CN110229806B - 纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶及其制备方法 - Google Patents

纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶及其制备方法，能制备纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶，其催化口袋不被纳米壳包裹。纳米二氧化硅对蛋白酶起到保护作用，同时蛋白酶的催化口不被纳米二氧化硅包裹，可以有效地与底物结合反应，进而提高催化反应的传质效率。本发明纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶将胰蛋白酶包裹在纳米二氧化硅之中，形成具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒，且胰蛋白酶的催化口袋不被纳米二氧化硅壳包裹，形成胰蛋白酶的催化口袋外露的传质窗口。本发明首次实现包封法固定的蛋白酶的催化口袋不被包裹，具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒热稳定性好，水解稳定性好，制备工艺简单，具备很好的应用前景。

Description

纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶及其制备方法，特别是涉及一种具有核壳结构的蛋白酶及其制备方法，应用于酶制剂技术领域。
背景技术
蛋白酶作为一种安全、清洁、高效的酶制剂，其应用较为广泛。例如，酿酒工业中使用的酵母菌，酶的作用是将淀粉等物质水解、氧化，最后转化为酒精；同样在食品行业中，酱油和食醋的生产也离不开酶的作用；饲料经过淀粉酶和纤维素酶处理后，其营养价值有所提高；在洗衣粉中添加酶，可以去除不易清洗的汗渍等顽固污渍，进而提高了洗衣粉的去污功效。然而，酶在其天然形态中的使用常常受到一些限制，如操作稳定性低，即热稳定性、pH稳定性、水解稳定性等不佳，以及使用游离蛋白酶的限制，因此影响了酶在工业领域中的研究和应用。针对提高蛋白酶的稳定性问题，包封法固定蛋白酶是一种有效地方式，则是将蛋白酶固定在纳米材料内，进而提高了蛋白酶的稳定性。但是，目前包封酶的研究均是将蛋白酶完全包裹在纳米材料之中，因而也影响了酶与底物反应的传质效率。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶及其制备方法，将蛋白酶包裹在纳米二氧化硅之中，且蛋白酶的催化口袋不被纳米壳包裹，纳米二氧化硅对蛋白酶起到保护作用，同时蛋白酶的催化口不被纳米二氧化硅包裹，可以有效地与底物结合反应，进而提高催化反应的传质效率。本发明首次实现包封法固定的蛋白酶的催化口袋不被包裹。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶，将胰蛋白酶(BT)包裹在纳米二氧化硅之中，形成具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒，且胰蛋白酶的催化口袋不被纳米二氧化硅壳包裹，形成胰蛋白酶的催化口袋外露的传质窗口。
一种本发明纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)使用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶进行混合，形成胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物，再使用APTS修饰胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物，形成具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体，使胰蛋白酶的催化口袋被胰蛋白酶抑制剂基团占据且不被APTS修饰；所述胰蛋白酶抑制剂优选采用BPTI；作为本发明的优选技术方案，采用EDC，对胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物进行活化处理，再加入引发剂NHS，引发反应生成具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体；
(2)使用未被APTS修饰的胰蛋白酶抑制剂，来置换在所述步骤(1)中被APTS修饰的具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体的胰蛋白酶抑制剂基团-APTS部分，形成APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团产物，从而去除具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体一端的APTS基团；
(3)利用水解反应方法，将在所述步骤(2)中制备的APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团产物作为核，形成纳米二氧化硅包裹层，而复合纳米材料中的胰蛋白酶抑制剂基团没有被APTS修饰，进而不会被纳米二氧化硅壳包裹，从而制备得到胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒；
(4)去除在所述步骤(3)中制备的胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的胰蛋白酶抑制剂基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。
作为本发明的一种优选技术方案，在所述步骤(4)中，去除胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的胰蛋白酶抑制剂基团的方法的步骤如下：
用盐酸胍或异硫氰酸胍作为变性剂，在变性条件下，破坏胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂基团的结合，使胰蛋白酶抑制剂基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团中的胰蛋白酶抑制剂基团。
作为本发明的另一种优选技术方案，在所述步骤(4)中，去除胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的胰蛋白酶抑制剂基团的方法的步骤如下：
使用芦丁小分子抑制剂，置换胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的胰蛋白酶抑制剂基团，再通过透析方式，去除芦丁。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明方法利用纳米二氧化硅对蛋白酶起到保护作用，可以防止蛋白酶被水解，提高其稳定性；蛋白酶的催化口袋不被纳米壳包裹，可以有效地使酶与底物结合反应，进而提高传质效率；
2.本发明方法制备的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒材料热稳定性好，pH稳定性好，水解稳定性好，制备工艺简单，具备很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例一方法纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶且其催化口袋不被纳米壳包裹的颗粒的透射电子显微镜图像。
图2为本发明实施例四方法制备的BPTI-FITC对BT催化活性的抑制作用表征图。
图3为本发明实施例四交换实验前后的APTS-BT-BPTI-APTS和APTS-BT-BPTI-FITC的荧光表征图：其中图a为蛋白的荧光光谱图，其中图b为FITC的荧光光谱图。
图4为本发明实施例四交换实验前后的BT@SiO2-BPTI-FITC和BT@SiO2-BPTI荧光表征图：其中图a为蛋白的荧光光谱图，其中图b为FITC的荧光光谱图。
图5为本发明实施例四盐酸胍变性处理前后的BT@SiO2-BPTI-FITC中的FITC的荧光表征图。
图6为本发明实施例五异硫氰酸胍变性处理前后的BT@SiO2-BPTI-FITC中FITC的荧光表征图。
图7为本发明实施例六芦丁与BT@SiO2-BPTI-FITC竞争实验前后，其中的FITC的荧光表征图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施例中，一种纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶，将胰蛋白酶(BT)包裹在纳米二氧化硅之中，形成具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒，且胰蛋白酶的催化口袋不被纳米二氧化硅壳包裹，形成胰蛋白酶的催化口袋外露的传质窗口。
一种本实施例纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)取2mL的浓度为120μM的BT，将BT加入9mL的pH为8.0的浓度为0.2M的磷酸缓冲溶液中，混合均匀后，再加入2mL的浓度为120μM的BPTI，在4℃条件下，控制搅拌转速为800rpm/min，进行反应12h，获得BT-BPTI复合物；然后称取8mg的EDC和10mg的NHS，并分别溶于0.5mL的pH为8.0的浓度为0.2M的磷酸缓冲溶液中，使EDC和NHS分别充分溶解；然后向BT-BPTI复合物中加入EDC的磷酸混合液进行反应10min，再加入NHS的磷酸混合液继续反应10min，最后加入7μL的APTS，在室温条件下，控制搅拌转速为800rpm/min，反应12h；然后，将得到产物用10K的超滤管在3000g的离心力作用下超滤，每次超滤15min，用超纯水清洗纯化6次，以去除盐分、未反应的APTS和其他杂质，得到APTS-BT-BPTI-APTS；本实施例使用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶进行混合，形成BT-BPTI复合物，再使用APTS修饰BT-BPTI复合物，形成APTS-BT-BPTI-APTS中间体，使胰蛋白酶的催化口袋被BPTI占据且不被APTS修饰；本实施例采用EDC，对BT-BPTI复合物进行活化处理，再加入引发剂NHS，引发反应生成APTS-BT-BPTI-APTS；
(2)使用10倍物质的量浓度的BPTI与1倍物质的量浓度的APTS-BT-BPTI-APTS进行混合，即将BPTI加入到pH为8.0为PB的缓冲液中，然后将在所述步骤(1)中被APTS修饰的APTS-BT-BPTI-APTS逐滴加入到BPTI的PB混合液中，在常温条件下进行竞争反应，利用BPTI来置换-BPTI-APTS基团，控制搅拌转速为600rpm/min，搅拌12h，将得到的置换反应产物使用10K分子量的透析袋透析72h，以去除多余的BPTI和被置换掉的BPTI-APTS，以及盐溶液，从而得到APTS-BT-BPTI；本实施例使用未被APTS修饰的高浓度胰蛋白酶抑制剂BPTI，来置换在所述步骤(1)中被APTS修饰的APTS-BT-BPTI-APTS的-BPTI-APTS部分，形成APTS-BT-BPTI复合纳米材料，从而去除APTS-BT-BPTI-APTS一端的-BPTI-APTS；
(3)称量9.1mg精氨酸加入到6.880mL超纯水中，震荡使精氨酸完全溶解，再将精氨酸溶液转移到50mL茄形瓶中，向精氨酸溶液中投入1mL的浓度为5.0×10-6M的在所述步骤(2)中制备的APTS-BT-BPTI，然后加入20μL的TEOS-环己烷混合液进行反应12h，其中TEOS-环己烷混合液中TEOS和环己烷体积比为5:4；然后将得到的产物BT@SiO2-BPTI用10K的超滤管在3000g的离心力作用下超滤，每次超滤15min，用超纯水清洗纯化6次，以去除盐分和其他杂质，得到BT@SiO2-BPTI纳米颗粒；本实施例利用水解反应方法，将在所述步骤(2)中制备的APTS-BT-BPTI作为核，形成纳米二氧化硅包裹层，而BT@SiO2-BPTI纳米颗粒中的-BPTI基团没有被APTS修饰，进而不会被纳米二氧化硅壳包裹，从而制备得到BT@SiO2-BPTI纳米颗粒；
(4)将4mg的在所述步骤(3)中制备的BT@SiO2-BPTI纳米颗粒溶于4.0mL盐酸胍GuHCl的缓冲溶液中，得到缓冲混合溶液，缓冲混合溶液的组成为：浓度为50mM的PB和浓度为2M的GuHCl进行混合，缓冲混合溶液的pH为7.0；再将缓冲混合溶液装入分子量为10K的透析袋中，并放入含有同浓度的GuHCl的透析液中透析，透析液设置于体积为50mL的烧杯中，并多次更换同组分的透析液，直至完成透析处理。将透析袋中的剩余物质取出，用10K超滤管进行超滤纯化，便得到纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶BT@SiO2，且其催化口袋不被纳米壳包裹。本实施例用盐酸胍作为变性剂，在变性条件下，破坏胰蛋白酶BT与胰蛋白酶抑制剂基团-BPTI的结合，使-BPTI基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除BT@SiO2-BPTI中的-BPTI基团。本实施例去除在BT@SiO2-BPTI纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的-BPTI基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。
本实施例为了保护胰蛋白酶BT的催化口袋，首先BT与胰蛋白酶抑制剂BPTI混合形成复合物BT-BPTI；再使用APTS修饰BT-BPTI得到APTS-BT-BPTI-APTS，其中BT的催化口袋被BPTI占据且不被APTS修饰。本实施例为了保护BT且使其催化口袋不被纳米壳包裹，用未被APTS修饰的BPTI置换APTS-BT-BPTI-APTS中的BPTI-APTS，而得到APTS-BT-BPTI；在碱性条件下，TEOS与APTS发生水解、缩合反应，将APTS-BT-BPTI作为核形成纳米二氧化硅，但复合物中的BPTI没被APTS修饰进而不会被纳米壳包裹，便制备了BT@SiO2-BPTI纳米颗粒。本实施例为了去除BT@SiO2-BPTI中的占据BT催化口袋的BPTI，从而使得BT的催化口袋外露。用盐酸胍变性剂，在变性条件下破坏BPTI与BT的结合，通过透析的方式去除BT@SiO2-BPTI中的BPTI。图1为本实施例方法制备的纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶且其催化口袋不被纳米壳包裹的颗粒的透射电子显微镜图像。本实施例得到了纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶且其催化口袋不被纳米壳包裹的颗粒，其分散性较好、大小均匀，如图1的透射电子显微镜图像所示，纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶且其催化口袋不被纳米壳包裹的颗粒均匀，没有发生团聚。
实施例二：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种本实施例纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)本步骤与实施例一相同；
(2)本步骤与实施例一相同；
(3)本步骤与实施例一相同；
(4)将浓度为0.5mg的在所述步骤(3)中制备的BT@SiO2-BPTI纳米颗粒溶于4.0mL异硫氰酸胍GdmSCN的PB缓冲溶液中，得到缓冲混合溶液，缓冲混合溶液的组成为：浓度为0.1M的PB和浓度为2M的GdmSCN进行混合，缓冲混合溶液的pH为8.0，其中还含有DTT的浓度为0.025mM；再将缓冲混合溶液装入分子量为10K的透析袋中，并放入含有同浓度的GdmSCN的透析液中透析，透析液设置于体积为50mL的烧杯中，并多次更换同组分的透析液，直至完成透析处理。将透析袋中的剩余物质取出，用10K超滤管进行超滤纯化，之后再进行超滤纯化去除GdmSCN和其他杂质，便得到纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶BT@SiO2，且其催化口袋不被纳米壳包裹。本实施例用异硫氰酸胍作为变性剂，在变性条件下，破坏胰蛋白酶BT与胰蛋白酶抑制剂基团-BPTI的结合，使-BPTI基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除BT@SiO2-BPTI中的-BPTI基团。本实施例去除在BT@SiO2-BPTI纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的-BPTI基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。
实施例三：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种本实施例纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)本步骤与实施例一相同；
(2)本步骤与实施例一相同；
(3)本步骤与实施例一相同；
(4)将10倍物质的量浓度的芦丁，加入到1倍物质的量浓度的在所述步骤(3)中制备的BT@SiO2-BPTI中，再将缓冲混合溶液装入分子量为10K的超滤管在3000g的离心力作用下超滤，超滤15min，再放置30-60min；
(5)再重复所述步骤(4)的操作方法进行超滤、放置，重复次数为10-15次；然后，将超滤收集的固形物装入分子量为10K的透析袋中透析，以去除芦丁和其他杂质，便得到纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶，且其催化口袋不被纳米壳包裹。本实施例用芦丁作为小分子抑制剂，置换BT@SiO2-BPTI复合纳米颗粒中的-BPTI基团，破坏胰蛋白酶BT与胰蛋白酶抑制剂基团-BPTI的结合，使-BPTI基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除BT@SiO2-BPTI中的-BPTI基团。本实施例去除在BT@SiO2-BPTI纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的-BPTI基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。
实施例四：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种本实施例纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)本步骤与实施例一相同；
(2)使用荧光染料FITC修饰BPTI，将BPTI按2mg/mL的浓度溶于pH为9.0的碳酸钠缓冲溶液中，再将FITC按1mg/mL的浓度溶于DMSO中；以BPTI：FITC的配比为1:5的物质的量比，将FITC逐滴加入到含有BPTI的碳酸钠缓冲溶液中；验的反应条件为：在4℃条件下，转速为600rpm/min，搅拌反应24h，将得到的产物使用2K分子量的透析袋透析48h，以去除游离的FITC、盐溶液和其他杂质，得到BPTI-FITC；
使用10倍物质的量浓度的BPTI-FITC与1倍物质的量浓度的APTS-BT-BPTI-APTS进行混合，即将BPTI-FITC加入到pH为8.0为PB的缓冲液中，然后将在所述步骤(1)中被APTS修饰的APTS-BT-BPTI-APTS逐滴加入到BPTI-FITC的PB混合液中，在常温条件下进行竞争反应，利用BPTI-FITC来置换-BPTI-APTS基团，控制搅拌转速为600rpm/min，搅拌12h，将得到的置换反应产物使用10K分子量的透析袋透析72h，以去除多余的BPTI-FITC和被置换掉的BPTI-APTS，以及盐溶液，从而得到APTS-BT-BPTI-FITC；本实施例使用BPTI-FITC，来置换在所述步骤(1)中被APTS修饰的APTS-BT-BPTI-APTS的-BPTI-APTS部分，形成APTS-BT-BPTI-FITC复合纳米材料，从而去除APTS-BT-BPTI-APTS一端的-BPTI-APTS；使得纳米二氧化硅包裹的BT的催化口袋不被纳米壳包裹，同时也为了便于检测纳米二氧化硅包裹的蛋白荧光信号强度值；
(3)称量9.1mg精氨酸加入到6.897mL超纯水中，震荡使精氨酸完全溶解，再将精氨酸溶液转移到50mL茄形瓶中，向精氨酸溶液中投入1mL的浓度为4.5×10-6M的在所述步骤(2)中制备的APTS-BT-BPTI-FITC，然后加入3.0μL的TEOS-环己烷混合液进行反应12h，其中TEOS-环己烷混合液中TEOS和环己烷体积比为5:4；然后将得到的产物BT@SiO2-BPTI-FITC用10K的超滤管在3000g的离心力作用下超滤，每次超滤15min，用超纯水清洗纯化6次，以去除盐分和其他杂质，得到BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒；本实施例利用水解反应方法，将在所述步骤(2)中制备的APTS-BT-BPTI-FITC作为核，形成纳米二氧化硅包裹层，而BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒中的-BPTI基团没有被APTS修饰，进而不会被纳米二氧化硅壳包裹，从而制备得到BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒；
(4)将4mg的在所述步骤(3)中制备的BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒溶于4.0mL盐酸胍GuHCl的缓冲溶液中，得到缓冲混合溶液，缓冲混合溶液的组成为：浓度为50mM的PB和浓度为2M的GuHCl进行混合，缓冲混合溶液的pH为7.0；再将缓冲混合溶液装入分子量为10K的透析袋中，并放入含有同浓度的GuHCl的透析液中透析，透析液设置于体积为50mL的烧杯中，并多次更换同组分的透析液，直至完成透析处理。将透析袋中的剩余物质取出，用10K超滤管进行超滤纯化，便得到纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶BT@SiO2，且其催化口袋不被纳米壳包裹。本实施例用盐酸胍作为变性剂，在变性条件下，破坏胰蛋白酶BT与胰蛋白酶抑制剂基团-BPTI-FITC的结合，使-BPTI-FITC基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除BT@SiO2-BPTI中的-BPTI-FITC基团。本实施例去除在BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的-BPTI-FITC基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。参见图2-图5，图2为本实施例方法制备的BPTI-FITC对BT催化活性的抑制作用表征图。图3为本实施例交换实验前后的APTS-BT-BPTI-APTS和APTS-BT-BPTI-FITC的荧光表征图：其中图a为蛋白的荧光光谱图，其中图b为FITC的荧光光谱图。图4为本实施例交换实验前后的BT@SiO2-BPTI-FITC和BT@SiO2-BPTI荧光表征图：其中图a为蛋白的荧光光谱图，其中图b为FITC的荧光光谱图。图5为本实施例进行盐酸胍变性处理前后的BT@SiO2-BPTI-FITC中的FITC的荧光表征图。由附图2-图5可知，本实施例为了便于检测蛋白信号，使用荧光染料FITC修饰BPTI得到BPTI-FITC，如图2所示，BPTI-FITC依然可以抑制BT的催化活性。本实施例为了保护BT且使其催化口袋不被纳米壳包裹，使用BPTI-FITC与APTS-BT-BPTI-APTS进行交换实验，由APTS-BT-BPTI-APTS和APTS-BT-BPTI-FITC的荧光光谱表征图3，说明该交换实验成功得到APTS-BT-BPTI-FITC。本实施例在碱性条件下，以APTS-BT-BPTI-FITC为核，形成BT被纳米二氧化硅包裹而BPTI-FITC未被纳米壳包裹的BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒。本实施例为了证明制备的纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶，且其催化口袋未被纳米壳包裹。用未被FITC修饰的BPTI与BT@SiO2-BPTI-FITC进行交换实验，以置换掉其中的BPTI-FITC。对交换实验前后样品中的蛋白和FITC进行荧光光谱表征，如图4所示，说明该交换实验成功得到BT@SiO2-BPTI纳米颗粒，证明二氧化硅纳米包裹的BT的催化口袋未被包裹。本实施例为了去除BT@SiO2-BPTI-FITC中的占据BT催化口袋的BPTI-FITC，从而使得BT的催化口袋外露。使用盐酸胍变性剂变性处理方式，用盐酸胍变性剂，在变性条件下破坏BPTI与BT的结合，通过透析的方式去除BT@SiO2-BPTI中的BPTI-FITC，如图5所示的变性实验前后BT@SiO2-BPTI-FITC中的FITC荧光光谱图，说明成功去除BPTI-FITC。
实施例五：
本实施例与实施例三基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种本实施例纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)本步骤与实施例一相同；
(2)本步骤与实施例一相同；
(3)本步骤与实施例一相同；
(4)将4mg的在所述步骤(3)中制备的BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒溶于4.0mL异硫氰酸胍GdmSCN的缓冲溶液中，得到缓冲混合溶液，缓冲混合溶液的组成为：浓度为50mM的PB和浓度为2M的GdmSCN进行混合，缓冲混合溶液的pH为7.0；再将缓冲混合溶液装入分子量为10K的透析袋中，并放入含有同浓度的GdmSCN的透析液中透析，透析液设置于体积为50mL的烧杯中，并多次更换同组分的透析液，直至完成透析处理。将透析袋中的剩余物质取出，用10K超滤管进行超滤纯化，便得到纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶BT@SiO2，且其催化口袋不被纳米壳包裹。本实施例用异硫氰酸胍作为变性剂，在变性条件下，破坏胰蛋白酶BT与胰蛋白酶抑制剂基团-BPTI-FITC的结合，使-BPTI-FITC基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除BT@SiO2-BPTI中的-BPTI-FITC基团。本实施例去除在BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的-BPTI-FITC基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。如图6所示的变性实验前后BT@SiO2-BPTI-FITC中的FITC荧光光谱图，说明成功去除BPTI-FITC。
实施例六：
本实施例与实施例三基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种本实施例纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)本步骤与实施例一相同；
(2)本步骤与实施例一相同；
(3)本步骤与实施例一相同；
(4)将10倍物质的量浓度的芦丁，加入到1倍物质的量浓度的在所述步骤(3)中制备的BT@SiO2-BPTI-FITC中，再将缓冲混合溶液装入分子量为10K的超滤管在3000g的离心力作用下超滤，超滤15min，再放置30-60min；
(5)再重复所述步骤(4)的操作方法进行超滤、放置，重复次数为10-15次；然后，将超滤收集的固形物装入分子量为10K的透析袋中透析，以去除芦丁和其他杂质，便得到纳米二氧化硅包裹的胰蛋白酶，且其催化口袋不被纳米壳包裹。本实施例用芦丁作为小分子抑制剂，置换BT@SiO2-BPTI-FITC复合纳米颗粒中的-BPTI-FITC基团，破坏胰蛋白酶BT与胰蛋白酶抑制剂基团-BPTI的结合，使-BPTI-FITC基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除BT@SiO2-BPTI-FITC中的-BPTI-FITC基团。本实施例去除在BT@SiO2-BPTI-FITC纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的-BPTI-FITC基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。
本实施例使用与BT结合能力相对较弱的小分子抑制剂置换的方式，去除BT@SiO2-BPTI-FITC中的BPTI-FITC，使用高浓度的芦丁与BT@SiO2-BPTI-FITC进行竞争实验，以置换掉其中的BPTI-FITC，再通过透析方式去除芦丁，如图7所示的竞争实验前后BT@SiO2-BPTI-FITC中的FITC荧光光谱图，说明成功置换掉BPTI-FITC。本实施例制备了纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶，其催化口袋不被纳米壳包裹。纳米二氧化硅对蛋白酶起到保护作用，同时蛋白酶的催化口不被纳米二氧化硅包裹，可以有效地与底物结合反应，进而提高催化反应的传质效率。本发明上述实施例首次实现包封法固定的蛋白酶的催化口袋不被包裹。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶及其制备方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶，其特征在于：将胰蛋白酶(BT)包裹在纳米二氧化硅之中，形成具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒，且胰蛋白酶的催化口袋不被纳米二氧化硅壳包裹，形成胰蛋白酶的催化口袋外露的传质窗口；
所述纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶采用如下方法制备而成：
采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)使用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶进行混合，形成胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物，再使用APTS修饰胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物，形成具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体，使胰蛋白酶的催化口袋被胰蛋白酶抑制剂基团占据且不被APTS修饰；
(2)使用未被APTS修饰的胰蛋白酶抑制剂，来置换在所述步骤(1)中被APTS修饰的具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体的胰蛋白酶抑制剂基团-APTS部分，形成APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团产物，从而去除具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体一端的APTS基团；
(3)利用水解反应方法，将在所述步骤(2)中制备的APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团产物作为核，形成纳米二氧化硅包裹层，而复合纳米材料中的胰蛋白酶抑制剂基团没有被APTS修饰，进而不会被纳米二氧化硅壳包裹，从而制备得到胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒；
(4)去除在所述步骤(3)中制备的胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的胰蛋白酶抑制剂基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。
2.一种权利要求1所述纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，采用包封法，固定胰蛋白酶，并使胰蛋白酶的催化口袋不被包裹，包括如下步骤：
(1)使用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶进行混合，形成胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物，再使用APTS修饰胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物，形成具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体，使胰蛋白酶的催化口袋被胰蛋白酶抑制剂基团占据且不被APTS修饰；
(2)使用未被APTS修饰的胰蛋白酶抑制剂，来置换在所述步骤(1)中被APTS修饰的具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体的胰蛋白酶抑制剂基团-APTS部分，形成APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团产物，从而去除具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体一端的APTS基团；
(3)利用水解反应方法，将在所述步骤(2)中制备的APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团产物作为核，形成纳米二氧化硅包裹层，而复合纳米材料中的胰蛋白酶抑制剂基团没有被APTS修饰，进而不会被纳米二氧化硅壳包裹，从而制备得到胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒；
(4)去除在所述步骤(3)中制备的胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的占据胰蛋白酶催化口袋的胰蛋白酶抑制剂基团，从而使得胰蛋白酶的催化口袋外露，得到带有传质窗口的具有胰蛋白酶@SiO2核壳结构的复合纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，去除胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的胰蛋白酶抑制剂基团的方法的步骤如下：
用盐酸胍或异硫氰酸胍作为变性剂，在变性条件下，破坏胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂基团的结合，使胰蛋白酶抑制剂基团与胰蛋白酶@SiO2分离，通过透析的方式，去除胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团中的胰蛋白酶抑制剂基团。
4.根据权利要求2所述纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，去除胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的胰蛋白酶抑制剂基团的方法的步骤如下：
使用芦丁小分子抑制剂，置换胰蛋白酶@SiO2-胰蛋白酶抑制剂基团复合纳米颗粒中的胰蛋白酶抑制剂基团，再通过透析方式，去除芦丁。
5.根据权利要求2所述纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶抑制剂采用BPTI。
6.根据权利要求2所述纳米二氧化硅包裹胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：在所述步骤(1)中采用EDC，对胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团复合物进行活化处理，再加入引发剂NHS，引发反应生成具有APTS-胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂基团-APTS结构的中间体。
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