CN104531669B

CN104531669B - 一种包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料、制备方法及其用途

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Publication number: CN104531669B
Application number: CN201410842406.4A
Authority: CN
Inventors: 曲峰; 史晨漪; 宗洁; 安新; 李士杰
Original assignee: Suzhou Ying Ruicheng Biochemical Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ying Ruicheng Biochemical Technology Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN104531669A

Abstract

本发明属于先进纳米复合材料和生化分析技术领域，涉及一种包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料、制备方法和其固定化酶的应用。本发明首先以石墨烯为基体材料，采用溶剂热法，在石墨烯上生长磁性无机纳米颗粒，得到磁性复合材料，将其分散到多巴胺的前驱体溶液中，通过调节pH值，多巴胺自聚得到具有磁性、表面包覆聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料，直接用于固定化酶。该材料具有良好的磁性能，且分散性、生物相容性、稳定性好，比表面积大，对酶的负载量很大(高达0.175mg/mg)，可重复利用，并可用于蛋白质的高效降解，方法简单有效。该材料及制备方法在固定化酶和高效酶解等领域有良好的实用价值和应用前景。

Description

一种包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料、制备方法及其用途

技术领域

本发明属于先进纳米复合材料和生化分析技术领域，涉及一种包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料、制备方法及其固定化酶的应用。

背景技术

随着后基因组时代的发展，过去几十年中对蛋白质组学的研究受到越来越多的关注，其中一个主要难点是开发高效快速的各种基因组编码的蛋白质鉴别技术。到目前为止，质谱是鉴定和表征蛋白质最简单有力的工具。通常蛋白质会在蛋白酶作用下分解成肽段，通过质谱检测以及相应数据库查找相匹配的数据。在这个过程中，为了高通量和高精度地识别蛋白质，快速又完全地分解蛋白质是至关重要的。

在蛋白质体分析中，传统的溶液中酶解一般是在37℃胰蛋白酶作用12-16h下进行(胰蛋白酶：基质＝1:20～1:40)。整个酶解过程既费时又费力，而且在酶解过程中，酶的自我分解不仅可能抑制蛋白质的质谱信号，还会产生片段干扰蛋白质序列。因此，迫切需要开发更快速安全的蛋白质酶解方法来高效水解蛋白质，以获得相应的肽谱。

近年来，研究发现固定化酶有很多优点，例如：在有限的空间里高浓度酶可缩短酶解时间，稳定性好，可重复利用，可与反应介质分离，只有少量的蛋白自我分解副产物等。因此，很多研究者致力于这种技术。此外，固定化的酶易于分离和识别，可用于快速、高通量、高效、自动化的蛋白质组分析。至今为止，有很多材料被用作固定化酶的载体，例如：膜、排列好的珠子、毛细管、多孔聚合物、块材、多孔硅、纳米材料、溶胶凝胶基体材料以及杂化材料等。

其中磁性微球具有独特的优越性，例如：可重复利用、操作方便、非特性异蛋白结合量少。此外，磁性微球相应的磁性能使其在外磁场作用于易与蛋白分解的肽液分离，使处理过程简单、快速、高效。因此，磁性微球可作为固定化酶的理想载体，近年来被广泛用于蛋白质组学研究。尽管用磁球来固定化酶的方法发展很快，但这种方法仍存在两个主要问题，从而影响其在高通量蛋白质谱中的应用。一个问题是鳞片状磁性微球比表面积小，限制了固定化酶的量；另一个问题是磁性微球的亲水性差，不仅阻止亲水性的胰蛋白酶的固定化(胰蛋白酶是蛋白质组学研究中最常用的蛋白酶)，而且会导致大量的肽残留。

发明内容

针对已有技术的问题，本发明的目的之一在于提供一种磁响应效果好和载酶量高的磁性纳米复合材料，并将该材料固定化带有氨基的酶，可实现高效酶解。

为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料(MG@PDA)，所述石墨烯表面修饰有磁性无机纳米颗粒，磁性纳米颗粒的表面包覆具有亲水性的聚多巴胺层：磁性无机纳米颗粒的粒径为50nm～200nm。

首先，本发明通过具有大比表面积的石墨烯与磁性无机纳米颗粒复合以提高酶的负载率。石墨烯具有超高的比表面积(比表面积可达2630m²/g)，负载量大，是结合磁性微球和固定化酶的有利基体。其次，为了改进磁性纳米材料的亲水性，本发明通过在磁性无机纳米颗粒表面包覆聚多巴胺壳层。聚多巴胺有很多优点，如生物相容性好、环境稳定性好、亲水性好，有利于固化酶和蛋白质酶解。由于聚多巴胺包覆层中含有邻苯二酚和苯醌功能基团，可与氨基进行共价耦合，因此不用引入其他耦合试剂就可直接与胰蛋白酶共价耦合。

本发明通过采用石墨烯为基体，将磁性材料和多巴胺结合，既可增加固定化酶的量，实现高效率和高通量酶解，又可利用材料的磁性在外加磁场下实现对材料快速有效地分离。

作为本发明的优选技术方案，所述磁性无机纳米颗粒选自四氧化三铁、γ-三氧化二铁、NiFe₂O₄、CuFe₂O₄或纳米铁颗粒中的任意一种或者至少两种的组合，磁性无机纳米颗粒的粒径为50nm～1μm。

作为本发明的优选技术方案，所述聚多巴胺层的厚度为10nm。

作为本发明的优选技术方案，所述磁性无机纳米颗粒为粒径为200nm的四氧化三铁。

本发明的目的之二在于提供一种如上所述的包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料(MG@PDA)的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以石墨烯为基体材料，采用溶剂热法，在石墨烯上生长磁性无机纳米颗粒，所述方法包括以下步骤：

石墨烯用浓硝酸浸泡处理后，清洗至中性，干燥；将浓硝酸处理的石墨烯和无机磁性纳米颗粒前驱体加入到乙二醇溶液中，超声分散；然后向上述混合液中加入柠檬酸三钠、乙酸钠和任选地聚乙二醇，充分混匀后，将混合液转入反应釜，密封反应；待反应釜温度降至室温，将所得材料洗涤，干燥；其中，原料加入量为：每0.1g浓硝酸处理的石墨烯，加入2.2～3.7mmol(例如2.3mmol、2.5mmol、2.7mmol、2.9mmol、3.1mmol、3.3mmol或3.5mmol)无机磁性纳米颗粒前驱体，0.05～0.2g(0.06g、0.08g、0.10g、0.12g、0.14g、0.16g或0.18g)的柠檬酸三钠，2～4g(例如2.2g、2.4g、2.6g、2.8g、3.0g、3.2g、3.4g、3.6g或3.8g)的乙酸钠和任选地(0～1.0g)(例如0.2g、0.4g、0.6g或0.8g)聚乙二醇；

(2)将步骤(1)的产物分散到多巴胺的水溶液中，调节pH值为碱性，多巴胺发生自聚反应，得到包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料(MG@PDA)

所述聚乙二醇如聚乙二醇-20000。

优选地，溶剂热法的反应条件为：为使磁性无机纳米颗粒具有良好的结晶性，反应温度为180～200℃，例如180℃、190℃或200℃；反应时间为6.5～16h，例如6.5h、7.5h、8.5h、9.5h、10.5h、11.5h、12.5h、13.5h、14.5h、15.5h或16h。

优选地，为使磁性无机纳米颗粒具有良好的结晶性，步骤(2)多巴胺自聚反应的时间为10～16h，例如10.5h、11h、11.5h、12h、12.5h、13h、13.5h、14h、14.5h、15h或15.5h。

优选地，步骤(2)调节pH值为8-9，例如8、8.2、8.5、8.7、9。

本发明的目的之三在于提供一种如上所述的包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料的用途，其用于固定化酶。所述磁性石墨烯纳米复合材料的载酶量高达0.175mg/mg，可实现高效酶解。

优选地，所述酶为带有氨基的酶，优选胰蛋白酶、胃蛋白酶或过氧化氢酶等。

与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所述的包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料具有良好的磁性能且分散性、亲水性、生物相容性、稳定性好，比表面积大，对酶的负载量很大(高达0.175mg/mg)，显著高于已有技术采用氨基修饰的磁性四氧化三铁颗粒负载胰蛋白酶(其载酶量为0.086mg/mg)以及采用磁性沸石颗粒负载胰蛋白酶(其载酶量为0.062mg/mg)。而且，本发明所述的包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料可重复利用，并可实现蛋白质的高效降解，且方法简单有效。该材料在固定化酶和高效酶解等领域有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1是纳米材料的形貌表征图：其中，A为石墨烯的SEM图；B～D为不同条件下制得的磁性石墨烯纳米复合材料的SEM图：(B)实施例1、(C)实施例2、(D)实施例3；E为MG@PDA纳米复合材料的TEM图；F为MG@PDA纳米复合材料的TEM的局部放大图；

图2是石墨烯(曲线a)和MG@PDA纳米复合材料(曲线b)的拉曼光谱；

图3是石墨烯和MG@PDA纳米复合材料在不同时间段的分散性：5min(左)、一星期(右)；

图4是MG@PDA纳米复合材料固定化胰蛋白酶之后的FTIR图；

图5是细胞色素C和肌红蛋白酶解后的质谱图：其中，A为细胞色素C在溶液中酶解16h后的质谱；B为细胞色素C在MG@PDA-胰蛋白酶纳米复合材料作用下酶解10min的质谱；C为肌红蛋白在溶液中酶解16h后的质谱；D为肌红蛋白在MG@PDA-胰蛋白酶纳米复合材料作用下酶解10min的质谱；注：细胞色素和肌红蛋白中所有匹配的肽段分别用“C”和“M”标记；

图6是1ng/μL细胞色素C在MG@PDA-胰蛋白酶作用下酶解10min的质谱。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1.材料的制备1

本发明以石墨烯为基体制备包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料MG@PDA，固定化胰蛋白酶，过程如下：

1.1采用溶剂热法制备磁性石墨烯(MG)纳米复合材料

取0.4g石墨烯分散于50mL浓硝酸中，60℃下磁力搅拌8h，离心分离产物，用水和乙醇将其洗至中性，真空干燥。取上述干燥产物0.1g和FeCl₃·6H₂O1g加入到40mL乙二醇溶液中，超声分散。然后向上述混合液中加入0.05g柠檬酸三钠、2g乙酸钠和1.0g聚乙二醇-20000，磁力搅拌0.5h。将混合液转入反应釜，密封，200℃下保温16h。待反应釜温度降至室温，将所得材料用去离子水和乙醇分别清洗数次，真空干燥，得到磁性石墨烯(MG)纳米复合材料。

1.2制备包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料(MG@PDA)

将上述MG加入到含有40mg盐酸多巴胺的水溶液中，超声分散。在磁力搅拌下，向上述溶液中快速加入10mL三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM,pH9)，室温下继续搅拌16h。所得材料用去离子水和乙醇分别清洗数次，真空干燥，得到包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料(MG@PDA)。

1.3MG@PDA对胰蛋白酶的固定化

将一定量的胰蛋白酶溶于100μL pH为6.5的磷酸缓冲溶液中配制成浓度为2μg/μL的胰蛋白酶溶液。将1mg MG@PDA纳米复合材料用磷酸缓冲溶液(pH6.5)洗3次后，分散于上述胰蛋白酶溶液中，37℃下在摇床上振荡16h，所得材料用磁铁分离，并用磷酸缓冲溶液清洗数次。

实施例2.材料的制备2

步骤同实施例1，FeCl₃·6H₂O的加入量为0.6g，包覆亲水性聚多巴胺的反应时间为10h。

实施例3.材料的制备3

步骤同实施例1，反应体系不加聚乙二醇，混合液转入反应釜，密封，180℃下保温6.5h，包覆亲水性聚多巴胺时采用pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

实施例4.材料的表征

4.1纳米材料的形貌表征

利用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)表征石墨烯、磁性石墨烯纳米复合材料MG和包覆PDA的磁性石墨烯纳米复合材料MG@PDA，见图1。从图1A～图1D可以看出，纯石墨烯是透明的薄纱状鳞片状态，表面光滑，结合了磁性微球后，可以看到磁球负载到了石墨烯层的表面，图1B、1C、1D中磁球的平均粒径分别为200、65和50nm，说明增加FeCl₃的用量可以增大磁球的粒径，反应体系中减少聚乙二醇的用量可以减小磁球的粒径。减少多巴胺的反应时间和反应体系中pH值，并没有改变PDA的包覆厚度(图中未显示)，因此以下均以实施例1为研究对象。从图1E和1F可以看到得到的MG@PDA纳米复合材料最外层为一层清晰可见的厚度为10nm左右的壳层，并且没有游离的PDA颗粒。

4.2石墨烯和MG@PDA的拉曼表征

利用拉曼光谱仪对石墨烯和MG@PDA进行拉曼表征，见图2。从曲线a可以看到在1368cm^-1、1596cm^-1和2712cm^-1处的峰分别是石墨烯的D峰、G峰和2D峰。由曲线b可以看出，结合了磁性微球后，在424cm^-1和712cm^-1处出现了Fe-O振动峰的特征峰，包覆PDA之后，在1297cm^-1和1543cm^-1处出现了PDA的特征峰，对应的是领苯二酚的拉伸和变形；在MG@PDA纳米复合材料的拉曼光谱中，石墨烯中相应的D峰和G峰略有宽化，2D峰则大大减弱，说明石墨烯和PDA的表征峰几乎在同样的位置。

4.3石墨烯和MG@PDA的亲水性表征

将两组石墨烯和MG@PDA分散于水中，一组超声5min，另一组不搅拌放置一星期，见图3。从图3可以看到，石墨烯在几分钟内就在水中快速沉淀，而由于PDA壳层中存在丰富的羟基和氨基，MG@PDA纳米复合材料在水中的分散性在其静置一周后仍然很好，说明这种纳米复合材料具有优异的亲水性，是固定化亲水性胰蛋白酶的理想载体。

4.4MG@PDA固定化酶的表征

利用傅立叶变换红外光谱仪对MG@PDA固定化胰蛋白酶进行红外(FTIR)表征，见图4。从图4可以看出，548cm^-1处的峰是磁性微球中Fe-O的伸缩峰。FT-IR图中也出现胰蛋白酶的吸收峰，例如1574cm^-1和1512cm^-1处的酰胺键Ⅰ和Ⅱ、3412cm^-1处的N-H键、1288cm^-1处的C-N伸缩键，说明胰蛋白酶成功地固定到了MG@PDA纳米复合材料上。

利用紫外光谱仪对MG@PDA的载酶量进行表征。对比MG@PDA固定化胰蛋白酶前后在595nm处的紫外吸收值，可计算出MG@PDA载酶量高达0.175mg/mg。这个数值远大于目前报道的作为基本材料的其他磁性颗粒。这么高的载酶量归因于石墨烯具有SP²键和超高比表面积二维碳层的独特结构。

实施例5.材料的酶解作用

5.1MG@PDA-胰蛋白酶纳米复合材料对标准蛋白质的酶解效率研究

为了考察MG@PDA-胰蛋白酶纳米复合材料对标准蛋白质的酶解效率，选择50μL浓度为200ng/μL的细胞色素C(Cyt-C)和肌红蛋白(Myo)作为标准蛋白质样品分别在溶液中和在MG@PDA-胰蛋白酶作用下进行酶解。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)来分析蛋白质酶解后的肽段，见图5和表1。从图5和表1，可以看出，由于传统溶液中酶解所用的酶浓度较高，所以MG@PDA-胰蛋白酶的酶解效率与传统的溶液中酶解效率相当。MG@PDA-胰蛋白酶对细胞色素C和肌红蛋白分别酶解出的蛋白质序列涵盖率分别为62％和83％，说明MG@PDA-胰蛋白酶有利于提高酶解效率。

表1在溶液中和在MG@PDA-胰蛋白酶作用下酶解后的MALDI-TOF-MS质谱分析结果

为了研究MG@PDA-胰蛋白酶纳米复合材料对低丰度蛋白质的酶解效率，选择50μL浓度为1ng/μL的细胞色素C作为样品在MG@PDA-胰蛋白酶的作用下进行酶解。如图6所示，经过10min酶解，检测到6条匹配的肽段，蛋白质序列涵盖率为39％，说明MG@PDA-胰蛋白酶对低丰度蛋白质具有酶解能力。

5.2MG@PDA-胰蛋白酶纳米复合材料的可重复利用性和稳定性研究

采用肌红蛋白作为样品对MG@PDA-胰蛋白酶纳米复合材料的可重复利用性和稳定性作了评估。经过MG@PDA-胰蛋白酶对肌红蛋白五次连续酶解，第五次得到的肽段和第一次的基本一致，都是12条匹配的肽段，说明MG@PDA-胰蛋白酶至少可以重复利用五次并能保持相同的酶解效果。将MG@PDA-胰蛋白酶置于4℃下一个月，其酶解效果跟新制备的一样，蛋白质序列涵盖率仍然是83％。以上结果说明了MG@PDA-胰蛋白酶可重复利用性和稳定性好。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料，其特征在于，所述石墨烯表面修饰有磁性无机纳米颗粒，磁性无机纳米颗粒的表面包覆具有亲水性的聚多巴胺层：磁性无机纳米颗粒的粒径为50nm～200nm；

其中，所述聚多巴胺层的厚度为10nm。

2.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述磁性无机纳米颗粒选自四氧化三铁、γ-三氧化二铁、NiFe₂O₄、CuFe₂O₄或纳米铁颗粒中的任意一种或者至少两种的组合。

3.一种如权利要求1或2所述的包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)以浓硝酸处理的石墨烯为基体材料，采用溶剂热法，在石墨烯上生长磁性无机纳米颗粒，所述方法包括以下步骤：

石墨烯用浓硝酸浸泡处理后，清洗至中性，干燥；将浓硝酸处理的石墨烯和无机磁性纳米颗粒前驱体加入到乙二醇溶液中，超声分散；然后向上述混合液中加入柠檬酸三钠、乙酸钠和任选地聚乙二醇，充分混匀后，将混合液转入反应釜，密封反应；待反应釜温度降至室温，将所得材料洗涤，干燥；其中，原料加入量为：每0.1g浓硝酸处理的石墨烯，加入2.2～3.7mmol无机磁性纳米颗粒前驱体，0.05～0.2g的柠檬酸三钠，2～4g的乙酸钠和任选地0～1.0g聚乙二醇；

(2)将步骤(1)的产物分散到多巴胺的水溶液中，调节pH值为碱性，多巴胺发生自聚反应，得到包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，溶剂热法的反应条件为：反应温度为180～200℃，反应时间为6.5～16h，得到单分散性良好的磁性无机纳米颗粒。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)多巴胺自聚反应的时间为10～16h。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)调节pH值为8-9，得到在磁性无机纳米颗粒表面包覆比较完全的聚多巴胺层。

7.一种如权利要求1或2所述的包覆亲水性聚多巴胺的磁性石墨烯纳米复合材料的用途，其特征在于，其用于固定化酶。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述酶为带有氨基的酶。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶或过氧化氢酶。