CN110229787B - 一种牙髓干细胞原代提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牙髓干细胞原代提取方法，属于牙髓干细胞提取领域，一种牙髓干细胞原代提取方法，包括提取步骤以及步骤中必要的特殊实验仪器，按照提取步骤，工作人员能够将牙齿中的牙髓干细胞进行纯化培育，同时在对牙髓组织取出的步骤中，利用特殊实验仪器对牙齿进行钻孔的过程中，能够对深层的牙髓组织进行采集，大大增加了采集到的牙髓干细胞的活性，从而增加了采集到的牙髓组织的质量，同时将牙齿钻孔步骤与牙髓组织采集步骤合并，能够减小外界环境中活性较强的细胞混入牙髓组织中，增加了后续对牙髓干细胞纯化培育的可能。

Description

一种牙髓干细胞原代提取方法

技术领域

本发明涉及牙髓干细胞提取领域，更具体地说，涉及一种牙髓干细胞原代提取方法。

背景技术

牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞，牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。

牙髓干细胞具有以下优点：1、来源丰富。6-11岁的小孩自然脱落的牙齿中、成人需要拔掉的智齿中都含有丰富的牙髓干细胞。2、副作用小。牙髓干细胞是一种间充质干细胞，具有间充质干细胞的通性，不仅免疫原性低，不须经过严格配对即可使用，不会引起强烈的排异反应，而且还具有免疫调节功能，异体一直不会引起排斥反应。3、无伦理争议。因牙髓干细胞取自小孩自然脱落的牙齿及成人的智齿，属于废弃物品，且不损及生命，不存在伦理上的争议。由于牙髓干细胞具有多向分化的潜能，且获取简单不损及生命且不存在伦理上的争议，因此越来越多的人对自身的牙髓干细胞进行原代提取并保存，以备不时之需，牙髓干细胞在提取时需要将牙齿中的牙髓取出，对其中的干细胞进行分离和培育。

现有对牙髓的取出方式，一般通过专业工作人员将牙齿钻孔，采用无菌取样器取出部分牙髓，牙齿在钻孔时可能会对钻头周围的牙髓干细胞产生损伤，取样器无法采集到正常具有活性的牙髓干细胞，对牙髓干细胞的提取以及培育产生重大影响，同时牙齿钻孔与取出部分牙髓两步骤相分离，在两步骤的间隔中外界环境中的活性较强的细胞等可能会混入牙髓中，对后续牙髓干细胞的培育纯度产生影响。

发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种牙髓干细胞原代提取方法，它在对牙髓组织取出的步骤中，利用特殊实验仪器对牙齿进行钻孔的过程中，能够对深层的牙髓组织进行采集，大大增加了采集到的牙髓干细胞的活性，同时将牙齿钻孔步骤与牙髓组织采集步骤合并，能够减小外界环境中活性较强的细胞混入牙髓组织中，有效保证后续对牙髓干细胞的纯化培育。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种牙髓干细胞原代提取方法，其提取方法包括以下步骤：

S1、收集5-14岁儿童新鲜拔除的滞留乳切牙，用酒精对其表面进行擦拭，做消毒处理。

S2、通过实验仪器将残留牙髓组织取出，将其置于I型胶原酶(3g/L)和分散酶(4g/L)的消化液中，恒温37度将取出的牙髓组织消化1h，获得单细胞悬浮液。

S3、用计数板对细胞悬液进行细胞计数，根据实验需要，通过培养液对细胞悬液的密度进行调整，并将密度调整后的细胞悬液分装在培养瓶中。

S4、将培养瓶静置于二氧化碳培养箱，恒温37度对原代细胞培养。

S5、在显微镜下分别观察各个培养瓶内的原代细胞的培养情况；

所述S2中的实验仪器包括提取装置台，所述提取装置台上端开凿有放置槽，所述放置槽内固定连接有电动滑台，所述电动滑台左右两端均滑动连接有电动滑块，所述电动滑块上端固定连接有支撑块，两个所述支撑块相互靠近的一端均固定连接有夹板，所述提取装置台内端固定连接有电钻，所述电钻上端固定连接有钻头，所述电钻外端设有牙髓组织采集机构，所述牙髓组织采集机构包括半环形滑块、竖直块和限位块，所述半环形滑块与电钻卡接，所述半环形滑块左端开凿有竖直槽，所述竖直块与竖直槽滑动连接，所述竖直块下端壁与限位块固定连接，所述限位块与电钻滑动连接，所述限位块与半环形滑块形状相互匹配，所述竖直块上端固定连接有多个齿块，所述半环形滑块左端固定连接有两个辅助块，两个所述辅助块之间转动连接有转杆，所述转杆外端开凿有多个齿槽，所述齿槽与齿块相互匹配，所述转杆远离电钻的一端固定连接有连接板，所述连接板远离转杆的一端固定连接有采集盒，所述采集盒外端开凿有凹槽，所述半环形滑块上端固定连接有收纳板，所述收纳板远离电钻的一端开凿有细胞收纳盒，所述细胞收纳盒与采集盒相互匹配，所述细胞收纳盒靠近凹槽的一端固定连接有密封圈，所述密封圈与凹槽相互匹配，所述限位块外端固定连接有加长块，所述电钻左右两端均固定连接有多个卡块。

按照上述操作步骤，工作人员能够将牙齿中的牙髓干细胞进行纯化培育，通过实验仪器的作用，一方面增加了采集到的牙髓组织的质量，使其从源头上采集到活性较高的细胞，另一方面将牙齿钻孔与牙髓组织采集相互合并，减小外界环境中的细胞混入牙髓组织中，增加了后续对牙髓干细胞纯化培育的可能。

进一步的，所述凹槽形状为梯形，所述凹槽越靠近密封圈开口越大，由于凹槽的形状为梯形一方面可以使采集盒的外边缘保持锋利，使采集盒在转动时能够对牙髓干细胞进行采集，并收纳至凹槽内。

进一步的，所述卡块为塑胶材料，所述卡块与限位块过盈配合。在卡块和半环形滑块的过盈配合作用下，能够对限位块的上下移动位置进行一定的控制，且卡块为塑胶材料，使限位块在受到竖直方向上的力的作用下，能够使限位块通过卡块沿电钻竖直上下滑动。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于：

(1)本方案在对牙髓组织取出的步骤中，利用特殊实验仪器对牙齿进行钻孔的过程中，能够对深层的牙髓组织进行采集，大大增加了采集到的牙髓干细胞的活性，同时将牙齿钻孔步骤与牙髓组织采集步骤合并，能够减小外界环境中活性较强的细胞混入牙髓组织中，有效保证后续对牙髓干细胞的纯化培育。

(2)S2中的实验仪器包括提取装置台，提取装置台上端开凿有放置槽，放置槽内固定连接有电动滑台，电动滑台左右两端均滑动连接有电动滑块，电动滑块上端固定连接有支撑块，在电动滑台和电动滑块之间的相互配合作用下，能够对两个支撑块的移动轨迹以及位置进行调节和控制，两个支撑块相互靠近的一端均固定连接有夹板，在夹板与支撑块之间的相互配合作用下，能够将待提取的牙齿进行固定，便于实验仪器对牙齿本身的操作。

(3)提取装置台内端固定连接有电钻，电钻上端固定连接有钻头，在钻头和电钻之间的相互作用下，能够对牙齿外端进行钻孔操作，便于后续实验仪器对牙齿内的牙髓组织的提取，电钻外端设有牙髓组织采集机构，牙髓组织采集机构包括半环形滑块、竖直块和限位块，半环形滑块与电钻卡接，半环形滑块左端开凿有竖直槽，竖直块与竖直槽滑动连接，竖直块下端壁与限位块固定连接，当工作人员竖直上下移动限位块时，能够带动竖直块沿竖直槽竖直上下滑动，限位块与电钻滑动连接，限位块与半环形滑块形状相互匹配，能够将半环形滑块与限位块均能够与电钻相互连接，方便工作人员在取样结束后，将牙髓组织采集机构从电钻上取下，从而能够正常进行下一步操作，竖直块上端固定连接有多个齿块。

(4)半环形滑块左端固定连接有两个辅助块，两个辅助块之间转动连接有转杆，转杆外端开凿有多个齿槽，齿槽与齿块相互匹配，在齿块与齿槽之间的相互配合作用下，能够将齿块的竖直运动，转化成转杆的旋转运动，从而能够带动连接板进行旋转，工作人员可以控制采集装置进入牙髓组织后才转动打开，减小采集装置受到外界环境污染的可能，转杆远离电钻的一端固定连接有连接板，连接板远离转杆的一端固定连接有采集盒，采集盒外端开凿有凹槽，通过采集盒的转动能够将牙髓组织采集到凹槽内进行暂时保存。

(5)半环形滑块上端固定连接有收纳板，收纳板远离电钻的一端开凿有细胞收纳盒，细胞收纳盒与采集盒相互匹配，在细胞收纳盒与采集盒之间的相互配合作用下，能够减小外界环境对凹槽内端壁的污染，同时当采集盒采集到牙髓组织后，再将其旋转至细胞收纳盒内，对牙髓组织起到一定的保护作用。

(6)细胞收纳盒靠近凹槽的一端固定连接有密封圈，密封圈与凹槽相互匹配，在密封圈的作用下，能够在采集盒不使用的情况下，对其内部进行密封，保持凹槽内端壁的洁净，减小凹槽内端壁受到外界环境的污染。

(7)凹槽形状为梯形，凹槽越靠近密封圈开口越大，由于凹槽的形状为梯形一方面可以使采集盒的外边缘保持锋利，使采集盒在转动时能够对牙髓干细胞进行采集，并收纳至凹槽内。

(8)限位块外端固定连接有加长块。在加长块的作用下，能够辅助工作人员对限位块位置的控制，同时便于工作人员通过转动加长块能够控制半环形滑块的转动，从而能够带动采集盒在牙髓内转动并采集部分牙髓。

(9)电钻左右两端均固定连接有多个卡块。在卡块的作用下，能够对半环形滑块卡接的位置进行辅助定位，同时能够对限位块竖直上下移动的距离进行一定的提示和控制，从而对连接板的转动角度进行控制，便于工作人员对未被破坏的深层的牙髓细胞的采集。

(10)卡块为塑胶材料，卡块与限位块过盈配合。在卡块和半环形滑块的过盈配合作用下，能够对限位块的上下移动位置进行一定的控制，且卡块为塑胶材料，使限位块在受到竖直方向上的力的作用下，能够使限位块通过卡块沿电钻竖直上下滑动。

附图说明

图1为本发明实验前的结构示意图；

图2为本发明实验中的结构示意图；

图3为本发明半环形滑块部分的结构示意图；

图4为本发明采集牙髓组织时的剖面结构示意图；

图5为本发明采集牙髓组织后的剖面结构示意图；

图6为本发明半环形滑块部分的俯视剖面结构示意图；

图7为本发明采集盒部分的结构示意图；

图8为本发明收纳板部分的结构示意图。

图中标号说明：

1提取装置台、2放置槽、3电动滑台、4电动滑块、5支撑块、6夹板、7电钻、8牙髓组织采集机构、801半环形滑块、802竖直槽、803竖直块、804限位块、805齿块、9辅助块、901转杆、902齿槽、903连接板、904采集盒、905凹槽、10收纳板、11细胞收纳盒、12钻头、13卡块、14加长块。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接，可以是机械连接，也可以是电连接，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通，对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例1：

一种牙髓干细胞原代提取方法，其提取方法包括以下步骤：

S1、收集5-14岁儿童新鲜拔除的滞留乳切牙，用酒精对其表面进行擦拭，做消毒处理。

S2、通过实验仪器将残留牙髓组织取出，将其置于I型胶原酶3g/L和分散酶4g/L的消化液中，恒温37度将取出的牙髓组织消化1h，获得单细胞悬浮液。

S3、用计数板对细胞悬液进行细胞计数，根据实验需要，通过培养液对细胞悬液的密度进行调整，并将密度调整后的细胞悬液分装在培养瓶中。

S4、将培养瓶静置于二氧化碳培养箱，恒温37度对原代细胞培养。

S5、在显微镜下分别观察各个培养瓶内的原代细胞的培养情况。

按照上述操作步骤，工作人员能够将牙齿中的牙髓干细胞进行纯化培育，通过实验仪器的作用，一方面增加了采集到的牙髓组织的质量，使其从源头上采集到活性较高的细胞，另一方面将牙齿钻孔与牙髓组织采集相互合并，减小外界环境中的细胞混入牙髓组织中，增加了后续对牙髓干细胞纯化培育的可能。

请参阅图1，S2中的实验仪器包括提取装置台1，提取装置台1上端开凿有放置槽2，放置槽2内固定连接有电动滑台3，电动滑台3左右两端均滑动连接有电动滑块4，电动滑块4上端固定连接有支撑块5，在电动滑台3和电动滑块4之间的相互配合作用下，能够对两个支撑块5的移动轨迹以及位置进行调节和控制，请参阅申请号为：CN201820513265.5的中国实用新型专利，公开了《一种新型电动滑台模组》，本发明中提到的电动滑台3和电动滑块4之间的配合工作原理与上述使用新型中的电动滑台的工作原理相同，因此电动滑台3与电动滑块4之间的相互配合的方式属于本领域技术人员的公知技术，在此不再赘述，两个支撑块5相互靠近的一端均固定连接有夹板6，在夹板6与支撑块5之间的相互配合作用下，能够将待提取的牙齿进行固定，便于实验仪器对牙齿本身的操作。

请参阅图2-3，提取装置台1内端固定连接有电钻7，电钻7上端固定连接有钻头12，请参阅申请号为：CN201710366465.2的中国发明专利，公开了《牙科治疗床的使用方法》，本发明中的电钻7和钻头12分别对应于上述发明中提到的电钻驱动设备和牙科电钻，因此钻头12与电钻7的配合属于本领域技术人员的公知技术，在此不再赘述。请参阅图4，电钻7外端设有牙髓组织采集机构8，牙髓组织采集机构8包括半环形滑块801、竖直块803和限位块804，半环形滑块801与电钻7卡接，半环形滑块801左端开凿有竖直槽802，竖直块803与竖直槽802滑动连接，竖直块803下端壁与限位块804固定连接，当工作人员竖直上下移动限位块804时，能够带动竖直块803沿竖直槽802竖直上下滑动，限位块804与电钻7滑动连接，限位块804与半环形滑块801形状相互匹配，能够将半环形滑块801与限位块804均能够与电钻7相互连接，方便工作人员在取样结束后，将牙髓组织采集机构8从电钻7上取下，从而能够正常进行下一步提取操作，竖直块803上端固定连接有多个齿块805。

请参阅图4-5，半环形滑块801左端固定连接有两个辅助块9，两个辅助块9之间转动连接有转杆901，转杆901外端开凿有多个齿槽902，齿槽902与齿块805相互匹配，在齿块805与齿槽902之间的相互配合作用下，能够将齿块805的竖直运动，转化成转杆901的旋转运动，从而能够带动连接板903进行旋转，工作人员可以控制采集装置进入牙髓组织后才转动打开，减小采集装置受到外界环境污染的可能，转杆901远离电钻7的一端固定连接有连接板903，连接板903远离转杆901的一端固定连接有采集盒904，采集盒904外端开凿有凹槽905，通过采集盒904的转动能够将牙髓组织采集到凹槽905内进行暂时保存。

请参阅图4，半环形滑块801上端固定连接有收纳板10，收纳板10远离电钻7的一端开凿有细胞收纳盒11，细胞收纳盒11与采集盒904相互匹配，在细胞收纳盒11与采集盒904之间的相互配合作用下，能够减小外界环境对凹槽905内端壁的污染，同时当采集盒904采集到牙髓组织后，再将其旋转至细胞收纳盒11内，对牙髓组织起到一定的保护作用。请参阅图8，细胞收纳盒11靠近凹槽905的一端固定连接有密封圈，密封圈与凹槽905相互匹配，在密封圈的作用下，能够在采集盒904不使用的情况下，对其内部进行密封，保持凹槽905内端壁的洁净，减小凹槽905内端壁受到外界环境的污染，凹槽905形状为梯形，凹槽905越靠近密封圈开口越大，由于凹槽905的形状为梯形一方面可以使采集盒904的外边缘保持锋利，使采集盒904在转动时能够对牙髓干细胞进行采集，并收纳至凹槽905内。

请参阅图6，限位块804外端固定连接有加长块14，在加长块14的作用下，能够辅助工作人员对限位块804位置的控制，同时便于工作人员通过转动加长块14能够控制半环形滑块801的转动，从而能够带动采集盒904在牙髓内转动并采集部分牙髓，请参阅图5-6，电钻7左右两端均固定连接有多个卡块13，在卡块13的作用下，能够对半环形滑块801卡接的位置进行辅助定位，同时能够对限位块804竖直上下移动的距离进行一定的提示和控制，从而对连接板903的转动角度进行控制，便于工作人员对未被破坏的深层的牙髓细胞的采集，卡块13为塑胶材料，卡块13与限位块804过盈配合，在卡块13和半环形滑块801的过盈配合作用下，能够对限位块804的上下移动位置进行一定的控制，且卡块13为塑胶材料，使限位块804在受到竖直方向上的力的作用下，能够使限位块804通过卡块13沿电钻7竖直上下滑动。

当工作人员进行到S2，需要对牙齿内的牙髓组织进行采集时，请参阅图1-2，首先工作人员将牙髓组织采集机构8卡接在电钻7的外端，工作人员再将牙齿表面经过消毒后放置在提取装置台1的上端，通过操控电动滑台3，使两个夹板6将牙齿进行夹持固定，再将电钻7外端的开关开启，对牙齿进行钻孔，当钻至一定深度后，将电钻7关闭，请参阅图4，工作人员竖直向上移动限位块804，在齿块805和齿槽902之间的相互配合作用下，使采集盒904从细胞收纳盒11内转出一定的角度，使采集盒904能够深入到牙髓组织内，工作人员再转动限位块804，使限位块804带动半环形滑块801沿电钻7转动，在采集盒904的转动过程中能够将牙髓组织进行收集，转动完成后，工作人员再将限位块804竖直向下移动，带动采集盒904再次转回至细胞收纳盒11内，将收集到的牙髓组织暂时保存在采集盒904内，工作人员再次操纵电钻7，将其从牙齿内钻出，再将牙髓组织采集机构8从电钻7外端取下，对采集盒904内的牙髓组织进行下一步处理。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种牙髓干细胞原代提取方法，其特征在于：其提取方法包括以下步骤：

S1、收集5-14岁儿童新鲜拔除的滞留乳切牙，用酒精对其表面进行擦拭，做消毒处理。

S2、通过实验仪器将残留牙髓组织取出，将其置于I型胶原酶(3g/L)和分散酶(4g/L)的消化液中，恒温37度将取出的牙髓组织消化1h，获得单细胞悬浮液。

S3、用计数板对细胞悬液进行细胞计数，根据实验需要，通过培养液对细胞悬液的密度进行调整，并将密度调整后的细胞悬液分装在培养瓶中。

S4、将培养瓶静置于二氧化碳培养箱，恒温37度对原代细胞培养。

S5、在显微镜下分别观察各个培养瓶内的原代细胞的培养情况；

所述S2中的实验仪器包括提取装置台(1)，所述提取装置台(1)上端开凿有放置槽(2)，所述放置槽(2)内固定连接有电动滑台(3)，所述电动滑台(3)左右两端均滑动连接有电动滑块(4)，所述电动滑块(4)上端固定连接有支撑块(5)，两个所述支撑块(5)相互靠近的一端均固定连接有夹板(6)，所述提取装置台(1)内端固定连接有电钻(7)，所述电钻(7)上端固定连接有钻头(12)，所述电钻(7)外端设有牙髓组织采集机构(8)，所述牙髓组织采集机构(8)包括半环形滑块(801)、竖直块(803)和限位块(804)，所述半环形滑块(801)与电钻(7)卡接，所述半环形滑块(801)左端开凿有竖直槽(802)，所述竖直块(803)与竖直槽(802)滑动连接，所述竖直块(803)下端壁与限位块(804)固定连接，所述限位块(804)与电钻(7)滑动连接，所述限位块(804)与半环形滑块(801)形状相互匹配，所述竖直块(803)上端固定连接有多个齿块(805)，所述半环形滑块(801)左端固定连接有两个辅助块(9)，两个所述辅助块(9)之间转动连接有转杆(901)，所述转杆(901)外端开凿有多个齿槽(902)，所述齿槽(902)与齿块(805)相互匹配，所述转杆(901)远离电钻(7)的一端固定连接有连接板(903)，所述连接板(903)远离转杆(901)的一端固定连接有采集盒(904)，所述采集盒(904)外端开凿有凹槽(905)，所述半环形滑块(801)上端固定连接有收纳板(10)，所述收纳板(10)远离电钻(7)的一端开凿有细胞收纳盒(11)，所述细胞收纳盒(11)与采集盒(904)相互匹配，所述细胞收纳盒(11)靠近凹槽(905)的一端固定连接有密封圈，所述密封圈与凹槽(905)相互匹配，所述限位块(804)外端固定连接有加长块(14)，所述电钻(7)左右两端均固定连接有多个卡块(13)。

2.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞原代提取方法，其特征在于：所述凹槽(905)形状为梯形，所述凹槽(905)越靠近密封圈开口越大。由于凹槽(905)的形状为梯形一方面可以使采集盒(904)的外边缘保持锋利，使采集盒(904)在转动时能够对牙髓干细胞进行采集，并收纳至凹槽(905)内。

3.根据权利要求1所述的一种牙髓干细胞原代提取方法，其特征在于：所述卡块(13)为塑胶材料，所述卡块(13)与限位块(804)过盈配合。在卡块(13)和半环形滑块(801)的过盈配合作用下，能够对限位块(804)的上下移动位置进行一定的控制，且卡块(13)为塑胶材料，使限位块(804)在受到竖直方向上的力的作用下，能够使限位块(804)通过卡块(13)沿电钻(7)竖直上下滑动。

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