CN110228801A - 一种荧光碳点及其制备方法和应用 - Google Patents

一种荧光碳点及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光碳点及其制备方法和应用，将3‑氨基异烟酸分散在超纯水中，制备形成3‑氨基异烟酸的超纯水分散液，将3‑氨基异烟酸的超纯水分散液移入聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜，置于烘箱加热反应，将反应液离心分离后收集上清液，采用微孔滤膜过滤处理，将处理所得滤液进行透析，最后对透析液进行冷冻干燥处理，得到荧光碳点粉末。本发明操作简单，价格低廉，重复性好；制备的荧光点光稳定性高，毒性低，水溶性好，选择性好，能够灵敏专一地检测和分析色氨酸。

Description

一种荧光碳点及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于新型纳米材料制备领域，具体涉及一种荧光碳点及其制备方法和应用。
背景技术
色氨酸(Tryptophan，Trp)是人体重要的神经递质5-羟色胺的前体和重要的神经活动传导物质，是人体必需氨基酸且不能通过自身合成，只能通过饮食或服用药物进行补充。世界卫生组织规定，正常人体内色氨酸的含量不得低于4mg kg-1。人体内95％以上的色氨酸由肝细胞的色氨酸2,3-加氧酶分解。当肝细胞受损时，酶数量的减少和活力降低往往导致色氨酸代谢紊乱，不仅引起有毒物质在神经系统的累积、造成妄想和幻觉紊乱、引起精神疾病和神经退行性疾病，而且还引起血液中色氨酸含量异常。例如，与正常人群相比，肝癌患者血液中的色氨酸含量普遍较高。因此建立一种灵敏准确的血清中色氨酸含量检测方法，对于临床诊断肝功能与色氨酸异常具有重要意义。
由于色氨酸具有重要的生物学功能，已经建立了多种检测色氨酸含量的方法。与高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、气相色谱法(GC)和电化学技术等传统分析方法相比，荧光法操作简单，选择性好，灵敏度高，已广泛应用于色氨酸含量检测。值得注意的是，大多数报道的色氨酸荧光传感器的检测机制都需要芳香族荧光团，使其与色氨酸产生π-π堆积相互作用。然而它们仍然存在一些不可避免的缺点，例如合成方法复杂、水溶性差和毒性较高等，限制了它们在生物医学领域中的应用。因此，开发一种简单、低毒、水溶性好的分析方法，用于检测各种生物体液中色氨酸含量具有重要意义。
荧光碳点作为最新一代的荧光碳纳米材料，已广泛应用于生物成像、药物输送、荧光传感和分析。这是因为荧光碳点具备很多优点，如制备工艺简单，毒性低，水溶性高，生物相容性好，光学性能优异等。荧光碳点作为化学传感器和生物传感器，广泛地应用于化学、环境和生物领域中，例如重金属离子、pH、活性自由基等的检测。但是用于直接检测氨基酸(尤其是色氨酸)的荧光碳点非常少。因此，制备一种新颖、低毒、水溶性好、光学性能优异的荧光碳点，并用于直接检测生物样品中色氨酸含量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光碳点及其制备方法和应用，以克服现有技术存在的缺陷，本发明操作简单，价格低廉，重复性好；制备的荧光碳点光稳定性高，水溶性好，选择性高，低毒，生物相容性好，能够灵敏专一地检测和分析色氨酸。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种荧光碳点的制备方法，包括以下步骤：
步骤1.1：将3-氨基异烟酸分散在超纯水中，然后通过水热法进行反应；
步骤1.2：将步骤1.1所得产物经离心收集上清液，将上清液经微孔滤膜过滤；
步骤1.3：将步骤1.2所得滤液经透析后，收集透析液，最后经冷冻干燥处理，即得到荧光碳点。
进一步地，步骤1.1中将3-氨基异烟酸分散在超纯水中后，3-氨基异烟酸与水的质量体积比范围为(0.1-50)mg/mL。
进一步地，步骤1.1中水热法进行反应的温度为120-200℃，时间为6-12h。
进一步地，步骤1.2中微孔滤膜采用标称孔径为0.22μm的微孔滤膜。
进一步地，步骤1.3中透析过程采用的透析袋，截留分子量为1000D，透析时间为48h。
一种荧光碳点，采用上述的一种荧光碳点的制备方法制得。
一种荧光碳点作为色氨酸检测荧光探针的应用，取不同体积的相同浓度的色氨酸溶液，用缓冲溶液稀释至相同体积，得到一系列等体积不同浓度的色氨酸标准溶液，并分别加入相同体积的荧光碳点储存液，然后分别进行荧光强度检测，得到色氨酸标准溶液的荧光光谱图，以空白组的荧光强度与每份标准溶液的荧光强度的比值为纵坐标，以色氨酸溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合线性关系，实现对色氨酸的定量检测。
进一步地，缓冲溶液为pH＝7.2的HCl-Tris缓冲溶液。
进一步地，荧光碳点储存液配制过程为：称取荧光碳点，用超纯水溶解，准确配制浓度为2mg/mL的荧光碳点储存液。
进一步地，所述荧光碳点对色氨酸的检测浓度区间为0.05-200μmol/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明以3-氨基异烟酸为唯一前驱体，采用一步水热法制备得到了荧光碳点。制备的荧光碳点粒径均一，单分散性良好，荧光性能优异。与普通的制备方法相比，本发明采用的制备方法更为简便安全，绿色经济，不需要使用昂贵的仪器。
(2)本发明制备的荧光碳点，可以选择性、灵敏地检测血清中色氨酸的含量，检测结果不受血清中共存氨基酸及其他物质的干扰，可实现对色氨酸的简单快速检测。同时该荧光碳点能够迅速和色氨酸反应，反应时间为15s，能够实现实时监测色氨酸的含量变化。基于该荧光碳点的探针，制备方法简单，探针的生物相容性优、水溶性好，在色氨酸检测中具有成本低、操作简便、短时高效、选择性好和灵敏度高等优点。
附图说明
图1为实施例2中制备的荧光碳点的透射电镜图。
图2为实施例2中制备的荧光碳点荧光激发光谱和发射光谱。
图3为实施例2中制备荧光碳点与不同氨基酸溶液反应后的荧光强度变化图。
图4为实施例2中制备荧光碳点与不同离子溶液反应后的荧光强度变化图。
图5为实施例2中制备荧光碳点与不同浓度色氨酸标准溶液反应后的荧光发射谱图。
图6为实施例2中色氨酸标准溶液的溶液浓度与荧光淬灭率关系曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式做进一步详细描述：
一种特异性识别色氨酸的荧光碳点的制备方法，将3-氨基异烟酸分散在超纯水中，得到质量体积比为0.1-50mg/mL的3-氨基异烟酸的超纯水分散液。将3-氨基异烟酸的超纯水分散液移入聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜，置于烘箱加热反应，反应温度为120-200℃，反应时间为6-12h。将反应产物于10000rpm离心10min(离心两次)后取上清液，采用0.22μm注射器滤膜过滤处理上清液，将处理所得滤液用截留分子量为1000D的透析袋透析，收集透析液，最后经冷冻干燥处理，得到荧光碳点粉末。称取适量的荧光碳点，用超纯水溶解，准确配制2mg/mL的荧光碳点储存液。
一种荧光碳点作为色氨酸检测荧光探针的应用，取不同体积的相同浓度的色氨酸溶液，用缓冲溶液稀释到相同的体积，得到一系列等体积不同浓度的色氨酸标准溶液。分别加入相同体积的荧光碳点储存液，检测溶液的荧光强度，得到色氨酸标准溶液的荧光光谱图。以空白组的荧光强度与每份标准溶液的荧光强度比值为纵坐标，色氨酸溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合线性关系。其中，缓冲溶液为pH＝7.2的HCl-Tris缓冲溶液，所述荧光碳点对色氨酸的检测浓度区间为0.05-200μmol/L。
下面结合实施例对本发明做进一步详细描述：
实施例1
一种荧光碳点的制备方法，将3-氨基异烟酸加入到超纯水中分散，得到质量体积比为0.1mg/mL的3-氨基异烟酸超纯水分散液。将3-氨基异烟酸超纯水分散液移入聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜，置于烘箱加热反应，反应温度为120℃，反应时间为12h。将反应产物离心并取上清液，采用0.22μm微孔滤膜过滤处理上清液，将处理所得滤液用截留分子量为1000D的透析袋透析，收集透析液并进行冷冻干燥处理，得到荧光碳点粉末。
实施例2
一种荧光碳点的制备方法，将3-氨基异烟酸加入到超纯水中分散，得到质量体积比为5mg/mL的3-氨基异烟酸超纯水分散液，将3-氨基异烟酸超纯水分散液移入聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜，置于烘箱加热反应，反应温度为160℃，反应时间为10h。将反应产物离心并取上清液，采用0.22μm微孔滤膜过滤上清液，将处理所得滤液用截留分子量为1000D透析袋透析，收集透析液，最后经冷冻干燥处理，得到荧光碳点粉末。
实施例3
一种荧光碳点的制备方法，将3-氨基异烟酸加入到超纯水中分散，得到质量体积比为50mg/mL的3-氨基异烟酸超纯水分散液，将3-氨基异烟酸超纯水分散液移入聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜，置于烘箱加热反应，反应温度为200℃，反应时间为6h。将反应产物离心并取上清液，采用0.22μm微孔滤膜过滤处理上清液，将处理所得滤液用截留分子量为1000D的透析袋透析，收集透析液，最后经冷冻干燥处理，得到荧光碳点粉末。
配制pH＝7.2的HCl-Tris缓冲溶液，称取实施例2制备的荧光碳点，用超纯水溶解，准确配制2mg/mL的荧光碳点储存液。移取300μL上述荧光碳点储存液置于5mL比色管中，加入pH＝7.2的HCl-Tris缓冲溶液稀释至3mL，得到0.2mg/mL荧光碳点储存液，配制两份。一份用紫外可见分光光度计进行吸光度检测；另一份用荧光分光光度计进行荧光检测，得到激发光谱和发射光谱。结果如图2所示。
配制体积为30μL、浓度为50mmol/L的丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Gln)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)溶液，分别在上述氨基酸溶液中加入300μL的荧光碳点储存液，再加入HCl-Tris缓冲溶液，稀释至3mL。采用荧光分光光度计分别对溶液进行荧光光谱检测。图3所示结果表明，制备的荧光碳点对色氨酸具有很高的选择性，能特异性识别色氨酸。丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等氨基酸对色氨酸检测无干扰作用。
配制体积为30μL、浓度为50mmol/L的Na+、Ca2+、Mg2+、HCO3 -、CO3 2-、HPO4 2-、H2PO4 -和NO3 -溶液，分别在上述溶液中加入300μL荧光碳点储存液，再加入HCl-Tris缓冲溶液，稀释至3mL。采用荧光分光光度计分别对溶液进行荧光光谱检测，图4所示结果进一步证明了制备的荧光碳点对色氨酸具有很高的选择性，能够专一地识别色氨酸。生物体内常见的Na+、Ca2 +、Mg2+、HCO3 -、CO3 2-、HPO4 2-、H2PO4 -和NO3 -对色氨酸检测无干扰作用。
向HCl-Tris缓冲溶液缓冲溶液，加入300μL浓度为2mg/mL的荧光碳点储存液，再加入一系列不同标准浓度的色氨酸(0-200μmol/L)，总体积为3mL，激发波长为285nm，进行荧光光谱测定。如图5所示，随着色氨酸浓度的增加，荧光强度逐渐减弱。以空白组荧光强度与每份标准溶液荧光强度的比值(F0/F，亦即荧光淬灭率)为纵坐标，以色氨酸溶液浓度为横坐标，绘制如图6所示的标准曲线，用于检测色氨酸含量。采用式(1)所示Stern-Volmer方程对标准曲线中的实验数据进行线性拟合。
F0/F＝Ksv[Trp]+1 (1)
式中，F0为未加猝灭剂的色氨酸溶液荧光强度；F为加入猝灭剂的色氨酸溶液荧光强度；Ksv为猝灭常数；[Trp]为猝灭剂色氨酸溶液的浓度，μmol/L。
线性拟合结果表明，当色氨酸溶液的浓度范围为0.05-200μmol/L时，荧光猝灭率F0/F与色氨酸溶液浓度之间呈现优异的线性关系，表明该检测方法具有很高的灵敏度。

Claims (10)

1.一种荧光碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.1：将3-氨基异烟酸分散在超纯水中，然后通过水热法进行反应；
步骤1.2：将步骤1.1所得产物经离心收集上清液，将上清液经微孔滤膜过滤；
步骤1.3：将步骤1.2所得滤液经透析后，收集透析液，最后经冷冻干燥处理，即得到荧光碳点。
2.根据权利要求1所述的一种荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤1.1中将3-氨基异烟酸分散在超纯水中后，3-氨基异烟酸与水的质量体积比范围为(0.1-50)mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤1.1中水热法进行反应的温度为120-200℃，时间为6-12h。
4.根据权利要求1所述的一种荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤1.2中微孔滤膜采用标称孔径为0.22μm的微孔滤膜。
5.根据权利要求1所述的一种荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤1.3中透析过程采用的透析袋，截留分子量为1000D，透析时间为48h。
6.一种荧光碳点，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的一种荧光碳点的制备方法制得。
7.一种权利要求6所述的荧光碳点作为色氨酸检测荧光探针的应用，其特征在于，取不同体积的相同浓度的色氨酸溶液，用缓冲溶液稀释至相同体积，得到一系列等体积不同浓度的色氨酸标准溶液，并分别加入相同体积的荧光碳点储存液，然后分别进行荧光强度检测，得到色氨酸标准溶液的荧光光谱图，以空白组的荧光强度与每份标准溶液的荧光强度的比值为纵坐标，以色氨酸溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线并拟合线性关系，实现对色氨酸的定量检测。
8.根据权利要求7所述的一种荧光碳点作为色氨酸检测荧光探针的应用，其特征在于，缓冲溶液为pH＝7.2的HCl-Tris缓冲溶液。
9.根据权利要求7所述的一种荧光碳点作为色氨酸检测荧光探针的应用，其特征在于，荧光碳点储存液配制过程为：称取荧光碳点，用超纯水溶解，准确配制浓度为2mg/mL的荧光碳点储存液。
10.根据权利要求7所述的一种荧光碳点作为色氨酸检测荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光碳点对色氨酸的检测浓度区间为0.05-200μmol/L。
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