CN110218258A - 融合三肽囊素的克隆表达及应用 - Google Patents

融合三肽囊素的克隆表达及应用 Download PDF

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Abstract

本发明设计并克隆表达了一种可溶性融合三肽囊素，经过纯化后作为动物的免疫佐剂，在具有ALV感染背景的鸡群中体现了良好的免疫增强作用、生长促进作用，并在体内外显示出较强的抑制反转录病毒的作用，具有良好的市场应用前景。

Description

融合三肽囊素的克隆表达及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及融合三肽囊素的克隆表达及应用。
背景技术
三肽囊素（bursin, BS），又称囊素肽、法氏囊活性肽，是存在于禽法氏囊中的小分子肽类活性物质。其结构为赖氨酸-组氨酸-甘氨酸（Lys-His-Gly-NH2）。国内外研究结果表明，BS具有增强免疫和促进畜禽生长的功能。BS能够提高血清中第二信使cGMP的含量，增加cGMP 和cAMP 的比值，提高B细胞中DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白的合成，从而提高血清中特异性抗体的水平。
近年来，禽白血病（Avian Leukosis，AL）的流行范围在逐渐扩大，造成巨大的经济损失。AL是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus， ALV）和禽肉瘤病病毒（Avian Sarcoma Virus， RSV）引起的，此病毒属于反转录病毒科甲型反转录病毒属，反转录病毒普遍不稳定，易发生变异。 该病毒引起禽类多种肿瘤，肿瘤造成的死亡率有时高达20%，一旦发生不易治疗和根除。感染 AL的鸡生产性能下降、免疫器官萎缩和形成不同程度的免疫抑制。
ALV感染禽类会导致机体的免疫抑制。目前，ALV在养殖业中广泛存在和流行，范围逐步扩大。对于AL目前还未研制出安全有效的生物制品（如：疫苗）来预防，主要原因是找不到非致病性的ALV毒株，这给兽医工作者带来了严峻的挑战，同时造成养殖业的巨大损失。
发明内容
本研究根据大肠杆菌编码外源蛋白的特异性，设计合成串联4肽BS，并连接融合肽编码序列，构建重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌进行原核表达，并探索和优化可溶性表达条件。设计动物实验研究BS可溶性蛋白和包涵体生长免疫调节功能并检测其安全性，进一步地，本发明通过鸡胚卵黄囊接种重组 ALV-FJ15HT0 建立 ALV 先天感染鸡群模型，在进行疫苗接种时注射原核表达的融合BS，探究融合BS 对 ALV 引发的生长抑制和免疫抑制作用的影响，为融合BS的临床应用提供科学的依据。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种融合三肽囊素，由串联四肽BS(8)和融合肽组成，所述串联四肽BS(8)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示（其氨基酸序列为：GSPRMKNPYKNPYKNPYKNPYKNPYKNPYKNPYKNPY），所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示（其氨基酸序列为：HMGGGGSKLQRLMEDICLPRWGCLWEDDF）。
所述串联四肽BS(8)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示（其核苷酸序列为：ATGAAAAACC CGTAT AAAAA CCCGT ATAAA AACCC GTATA AAAAC CCGTA TAAAA ACCCG TATAA AAACCCGTAT AAAAA CCCGT ATAAA AACCC GTAT），所述融合肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示（其核苷酸序列为：CATAT GGGCG GCGGC GGCAG CAAGC TTCAG CAAGC TTCAG CGCCT GATGGAAGAT ATTTG CCTGC CGCGT TGGGG CTGCC TGTGG GAAGA TGATT TTTAA TAA）。
一种重组表达载体pET-BS，以pET-32a 为质粒骨架，设计合成串联四肽BS(8)和融合肽的核苷酸序列，构建在质粒骨架上，得到重组表达载体pET-BS。
进一步地，将融合三肽囊素应用于制备ALV 先天感染鸡群生长及免疫调节剂中。
本发明的优点在于：
本发明通过表达可溶性融合三肽囊素，经过纯化后作为动物的免疫佐剂，在具有ALV感染背景的鸡群中体现了良好的免疫增强作用、生长促进作用，并在体内外显示出较强的抑制反转录病毒的作用，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为SDS-PAGE鉴定pET-BS诱导表达BS的结果，其中M：14-100 KDa 蛋白 Marker；1：pET-32a空载体转化诱导表达；2：pET-BS转化后未添加IPTG诱导；3：pET-BS转化诱导表达超声沉淀；4：pET-BS 转化诱导表达超声上清。
图2为BS 可溶性蛋白纯化过程，其中M: 14-100 KDa蛋白 Marker；1：纯化前BS可溶性蛋白； 2：蛋白上样流出液；3：10 mM咪唑洗脱液；4：40 mM咪唑洗脱液；5：60 mM咪唑洗脱液；6：120 mM咪唑洗脱液；7：200mM 咪唑洗脱液；8：去离子水洗脱液。
图3为BCA标准曲线图。
图4为融合BS对鸡生长性能的影响。
图5为融合BS对鸡各内脏器官指数的影响。
图6为融合BS对鸡NDV-HI抗体滴度的影响。
图7为融合BS对鸡AIV-HI抗体滴度的影响。
图8为融合 BS 对鸡血清细胞因子的影响，其中a为IL-2，b为IL-4，为IFN-γ。
图9为融合BS对鸡血清中IgG1/IgG2浓度的影响。
图10为gp85 表达量测定图。
图11为CNTFRα表达量测定图。
具体实施方式
实施例1 融合三肽囊素的克隆表达
1、引物的涉及与合成
根据大肠杆菌编码外源蛋白的特异性，设计合成串联4肽BS(8)，并在末端加上融合肽序列，该融合BS的氨基酸序列为GSPRM KNPY KNPY KNPY KNPY KNPY KNPY KNPY KNPYHMGGGG SKLQRLMEDICLPRWGCLWEDDF，其核苷酸序列为：ATGAA AAACC CGTAT AAAAA CCCGTATAAA AACCC GTATA AAAAC CCGTA TAAAA ACCCG TATAA AAACC CGTAT AAAAA CCCGT ATAAAAACCC GTATC ATATG GGCGG CGGCG GCAGC AAGCT TCAGC GCCTG ATGGA AGATA TTTGC CTGCCGCGTT GGGGC TGCCT GTGGG AAGAT GATTT TTAAT AA，送至上海生工生物工程有限公司合成并克隆至pET-32a质粒上，构建重组质粒pET-BS。另外，根据 pET-32a 和设计合成的重组pET-BS已公布的序列，设计检测BS的特异性引物送至上海铂尚生物公司合成， 引物序列如下表1。
表1 pET-BS 检测特异性引物序列表
2、重组质粒pET-BS的扩增及鉴定
将重组质粒转化至DH5α感受态细胞内，利用菌检PCR筛选出阳性转化子，进行测序分析。其中菌检PCR反应体系和条件如表2所示。
表2
3、重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达
（1）将重组质粒pET-BS转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中；
（2）pET-BS表达蛋白的诱导：
挑取疑似阳性单克隆菌落接种于LB（Amp+）液体培养基，37 ℃，200 r/min振荡培养过夜；取 1 mL 过夜培养菌液加到100 mL LB（Amp+）液体培养基中，37 ℃ 200 r/min培养至OD600≈0.6 时，取出部分菌液作为重组质粒IPTG未诱导对照组，其余加IPTG至终浓度为2.4µg/mL作为重组质粒 IPTG 诱导对照组，同时设空载体菌诱导组，37 ℃，200 r/min诱导培养4 h后，12 000 ×g离心2 min收集各组菌体沉淀，随后用PBS重悬洗涤2次，最终加入原始菌液 1/10 体积的可溶性平衡液，在冰上进行超声波破碎菌体，超声强度为：130 W，20kHz， 超声3 s，停5 s；至菌液变得澄清，4 ℃13 000 ×g离心15 min，分别收集上清和沉淀进行蛋白的可溶性表达分析，上清：按体积比加入6 × protein Loading buffer至浓度为1×，即50 µL上清中加入10 µL 6 × protein loading buffer 充分混匀；沉淀加入 60 µL 1× protein Loading buffer 充分混匀，后置于煮沸 10 min，冰浴 2min，12 000 ×g离心2 min，取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。
3、SDS-PAGE分析
根据目的蛋白的分子量制备 12%分离胶。分别取各组10 μL样品进行SDS-PAGE 电泳。电泳后将完整的分离胶放置于考马斯亮蓝染色液中，染色1 h后煮沸脱色，拍照分析目的产物表达情况。结果如图1所示，空载体转化的大肠杆菌无法诱导表达目的基因，pET-BS 转化的阳性菌经过IPTG诱导后表达BS目的蛋白，分子量约为27 KDa，与预期大小一致；主要以非可溶性的包涵体形式存在，可溶性形式的目的蛋白含量相对较低。
实施例2 可溶性蛋白的纯化及BCA定量
按照纯化试剂盒（ProteinlsoTM Ni-NTA Resin）说明进行。具体纯化步骤如下：
（1）层析柱的清洗：先用超纯水，润洗层析柱，使层析柱的底片紧贴柱子底部。
（2） 装柱：重悬介质，根据待纯化 BS 蛋白量，将适量的介质加入层析柱，静置，弃去流出液。
（3） 平衡：用8倍装柱介质体积的可溶性平衡缓冲液（含有10 mM咪唑）平衡层析柱，弃去流出液。
（4） 上样：将经过高速离心后的BS可溶性蛋白缓慢加入层析柱中，收集流出液。
（5） 洗涤：用10倍装柱介质体积可溶性平衡缓冲液（含10 mM咪唑）洗涤层析柱，收集流出液。
（6）洗脱：分别用含 40 mM 咪唑可溶性平衡液（5倍介质柱体积）、80 mM咪唑可溶性平衡液（5 倍介质柱体积）、120 mM咪唑可溶性平衡液（2倍介质柱体积）、200 mM咪唑可溶性平衡液（约为上样体积的1/3体积）洗脱层析柱，收集流出液。
（7）清洗层析柱：用已灭菌的去离子水洗涤层析柱（收集流出液前10 mL），直到层析柱流出液的 pH 接近 7.0。
（8） 层析柱介质的保存：用20%乙醇介质保存液重新平衡介质后，将介质转移到保存管中，4℃保存。将蛋白上样流出液和不同咪唑浓度的蛋白洗出液分别取50 µL进行SDS-PAGE 电泳鉴定，确定蛋白纯化的最佳条件，结果见图2，上样流出液中未见目的条带，这表明BS可溶性蛋白在纯化时能够充分与镍柱中 Ni+充分结合；10 mM和40 mM咪唑洗脱液能够洗脱除存在于介质中尚未与Ni+结合的非目的蛋白；120 mM咪唑洗脱液能够洗脱出少量的目的蛋白和部分低浓度咪唑洗脱液无法洗涤出来的非目的蛋白；200 mM 咪唑洗脱液的洗脱液能够将目的蛋白彻底洗脱出来，且几乎不含有非目的蛋白；在清水洗涤时则未见目的蛋白，说明200 mM的咪唑洗脱液能够充分将目的蛋白洗脱出来。
纯化后BCA标准曲线如图3所示，吸光值随着BSA浓度的升高而增大，标准曲线回归陈直线型符合预期标注。经BCA定量，纯化后的BS可蛋白可达到500 µg/mL。
实施例3 建立ALV先天性感染的动物模型
（1）ALV 的培养及病毒感染力（TCID50）的滴定
取ALV-FJ15HT0毒株接种于单层DF-1细胞，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱中，一周后收集，先连续冻融三次，接着用0.22 μm的过滤器过滤，最后冻存于-80 ℃的冰箱。ALV TCID50的测定选用IDEXX公司生产的ALV p27抗原检测试剂盒。按照试剂盒说明书进行测定。
（2）鸡胚的孵化
将购买的 SFP 鸡胚置于全自动孵化箱， 不同胚龄具体的孵化温度和湿度如下表3：
表3 鸡胚孵化条件
（3）SPF 鸡胚卵黄囊接种
于SPF鸡胚7胚龄时，卵黄囊接种3000 TCID50的ALV自然重组毒FJ15HT0。
具体如下：
A、 在暗室用照蛋器标出气室和胚体的大概位置，弃掉死胚和未受精蛋。
B、 接种前，用碘酊棉球消毒所标气室位置，再用酒精棉球脱碘和钻蛋器开一小孔以便接种。
C、 用 1 mL注射器将0.2 mL的FJ15HT0毒株的病毒稀释液（3000 TCID50）接种于鸡胚卵黄囊内，对照组接种0.2 mL的细胞培养液（DMEM）。
D、 最后用小蜡烛封孔，放回全自动孵化箱继续孵化。
（4）动物试验分组及处理
待雏鸡出壳后，称其体重并记录。每只雏鸡配带脚标感染鸡群随机分为垂直BS组与垂直菌液组，同时设立空白菌液组和空白 BS组。全部雏鸡出壳1 d和14 d时均以点眼滴鼻的方式接种鸡新城疫弱毒苗 0.1 mL 和以颈部皮下的方式免疫重组禽流感病毒 H5亚型二价灭活疫苗0.1 mL（Re-6株、Re-8株），免疫的同时，两组BS处理组的全部雏鸡肌肉注射纯化浓缩后的三肽囊素50 μg，两组对照组的全部雏鸡肌肉注射BL21菌液的超声上清纯化液。在试验期间按时按点饲喂鸡只充足的饲料和饮水，及时清理粪便，减少不必要的应激，以确保将试验误差降到最小。
实施例4 融合三肽囊素对ALV先天性感染SPF鸡群各指标的应影响
（1）融合三肽囊素对 ALV 先天性感染 SPF 鸡群体重的影响：
分别于雏鸡1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d 时，对全部鸡只进行称重并记录，并对所得数据进行生物统计分析。结果如表4和图4所示，1 d时，四组之间差异不显著（P＞0.05）；7 d时，垂直菌液组与其他三组鸡只体重之间均存在极显著差异（P＜0.01）；垂直BS组与空白菌液组和空白BS组鸡只体重相比，差异不显著（P＞0.05）；14 d时，空白菌液组与垂直BS组鸡只体重之间存在显著差异（P＜0.05），而与垂直菌液组鸡只体重之间存在极显著差异（P＜0.01）；空白BS组与垂直BS组鸡只体重相比，差异不显著（P＞0.05）；21 d时，空白菌液组与垂直菌液组鸡只体重相比，差异显著（P＜0.05），与垂直BS组鸡只体重之间差异并不显著（P＞0.05）；空白BS组与垂直菌液组鸡只体重比较差异极显著（P＜0.01）；28 d时，空白菌液组和空白BS组与垂直菌液组鸡只体重相比较存在差异显著（P＜0.05），但与垂直BS组鸡只体重比较差异不显著（P＞0.05）；35 d 时，垂直菌液组鸡只体重只有空白菌液组鸡只体重的 77.3% 但垂直BS组鸡只体重是空白菌液组鸡只体重的 87.6%，空白菌液组和空白BS组与垂直菌液组鸡只体重比较，差异极显著（P＜0.01），但与垂直BS组鸡只体重差异显著（P＜0.05）；42 d 时，空白菌液组、空白BS组与垂直菌液组、垂直 BS 组鸡只体重之间均存在极显著差异（P＜0.01）。整体来看，先天感染 ALV-FJ15HT0鸡群表现出增重缓慢；融合BS对先天感染ALV-FJ15HT0引起的生长抑制有一定的缓解作用。
表4 融合 BS 对鸡生长的性能的影响
注： 数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），无肩标或肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），下同。
（2）融合三肽囊素对 ALV 先天性感染 SPF 鸡群各器官指数的影响
于42 d剖杀全部鸡只，分离取其肝脏、肾脏、胸腺、脾脏和法氏囊，进行称重和记录，计算各个组织器官的指数（各组织器官指数=各组织重量÷体重×100%），并进行生物统计学的分析。结果如表5和图5所示，垂直菌液组鸡只肝脏指数大于垂直BS组鸡只肝脏指数，且达到了极显著水平（P＜0.01）；空白菌液组鸡只肝脏指数大于空白BS组，且达到了显著水平（P＜0.05）；垂直BS组鸡只肾脏指数比垂直菌液组鸡只肾脏指数小，且达到了显著水平（P＜0.05），由此可知，融合BS对先天感染ALV-FI15HT0鸡只肾脏的肿大有一定的抑制作用。鸡只胸腺指数和脾脏指数四组之间比较，均未达到显著水平（P＞0.05）；空白组法氏囊指数均比接毒组法氏囊指数大，且达到了极显著水平（P＜0.01）；但空白菌液组与空白BS组、垂直菌液组与垂直BS组鸡只法氏囊指数之间均不存在显著差异（P＞0.05）。
表5融合BS对鸡各脏器指数的影响
注：数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），无肩标或肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），下同。
（3）NDV抗体滴度的测定
于雏鸡21d、28d、35d和42d时，每组鸡只翼下静脉采血，室温自然凝固10-20分钟（min），离心20min（2000-3000r/min），仔细收集血清。用血凝抑制试验（HI）来检测NDV抗体滴度，具体操作步骤如下：首先需要通过血凝试验（HA）来确定鸡NDV血凝抑制试验抗原的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液；
1）HA：
A.取一96孔V形微量反应板并做标记，从左到右每孔依次加入生理盐水50μL；
B.用微型移液器取50uL鸡新城疫血凝抑制试验抗原加入第1孔内，移液器吹打混匀后吸取50uL加入到第2孔，依此倍比稀释至第11孔，第11孔吸取50μL液体弃掉，第12孔加入50uL红细胞作为对照；
C.从左到右每孔加入50μL的1%鸡红细胞悬液；
D.在振荡器上振荡混匀，置于37℃温箱中作用20min；
E.待对照孔中红细胞沉淀即可观察结果。
2）HI：
A.以HA试验结果为根据，配制4个血凝单位的鸡新城疫血凝抑制试验抗原稀释液；
B.取96孔V形微量反应板并做好标记，第1-11孔每孔加入生理盐水50μL；
C.第1孔内加入被检血清50μL，用移液器吹打混匀后吸取50μL液体至第2孔，按此方法依次倍比稀释至第10孔并弃掉50μL；第12孔加入ND阳性血清50μL，作为血清对照孔；
D.第1-12孔中依次加入50μL的4单位的鸡新城疫血凝抑制试验抗原；
E.置于微量振荡器振荡混匀，放37℃温箱作用20min;
F.第1-12孔每孔加入1%鸡红细胞悬液50μL；
G.用微量振荡器振荡混匀后，置于37℃温箱下作用20min；
H.第11、12孔对照孔成立的条件下，进一步观察结果并记录分析。
得到的NDV-HI抗体滴度如表6和图6所示。由表6可知，NDV-HI抗体滴度一直保持在6-8（Log2）。21d、28d和35d，四组之间NDV抗体滴度均未达到显著水平（P＞0.05）；42d时，空白菌液组与垂直BS组NDV抗体滴度之间存在显著差异（P＜0.05）；垂直BS组NDV抗体滴度大于空白菌液组NDV抗体滴度。21d-28d，NDV抗体滴度总体呈上升趋势，28d-35d，NDV抗体滴度呈下降趋势；42d时，空白菌液组和垂直菌液组NDV抗体滴度仍呈下降趋势，但空白BS组和垂直BS组NDV抗体滴度又呈现上升趋势，由此可知，融合BS对抗体的消长有一定的维持作用。从整个实验数据来看，先天感染ALV-FJ15HT0鸡只对NDV疫苗的抑制作用并不明显；融合BS可以提高健康鸡只和先天感染ALV-FJ15HT0鸡只的NDV抗体滴度，且对NDV抗体在体内的消长有维持作用。
表6 融合BS对鸡NDV-HI抗体滴度的影响
注：数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），无肩标或肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），下同。
（4）AIV-H5灭活苗抗体滴度的测定
于雏鸡21d、28d、35d和42d时，每组鸡只翼下采血，室温自然凝固10-20min，离心20min（2000-3000r/min），仔细收集血清。用血凝抑制试验（HI）来检测AIV-H5抗体滴度，具体操作步骤与NDV抗体滴度一致，对所测数据进行记录和统计分析。
结果如表7和图7所示，整体来看，从21d到42d，四组AIV-H5抗体滴度均呈现上升趋势。21d时，空白组AIV-H5抗体滴度高于垂直接毒组AIV-H5的抗体滴度，但空白菌液组与垂直接毒组的抗体滴度相比，未达到差异显著状态（P＞0.05），而空白BS组与垂直接毒组AIV-H5抗体滴度相比达到了显著水平（P＜0.05）；28d时，空白菌液组与其他三组AIV-H5的抗体滴度相比，差异不显著（P＞0.05），空白BS组与垂直菌液组AIV-H5抗体滴度相比，差异显著（P＜0.05），而与垂直BS组AIV-H5抗体滴度相比，差异不显著（P＞0.05）；35d和42d时，空白BS组与垂直菌液组AIV-H5抗体滴度相比，差异极显著（P＜0.01），而与垂直BS组AIV-H5抗体滴度相比，差异显著（P＜0.05）。从整个实验数据来看，先天感染ALV-FJ15HT0鸡群对AIV-H5疫苗产生免疫抑制；融合BS能提高健康鸡只和先天感染ALV-FJ15HT0鸡只对AIV-H5疫苗的免疫效果；融合BS能维持鸡体内AIV-H5抗体水平。
表7融合BS对鸡AIV-HI抗体滴度的影响
注：数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），无肩标或肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），下同。
（5）细胞因子的检测
1）IL-2
于雏鸡35d和42d时，每组鸡只翼下采血，室温自然凝固10-20min，离心20min（2000-3000r/min），仔细收集血清。用ELISA试剂盒测定血清样本中IL-2水平，每次测定的同时使用试剂盒中标准品绘制标准曲线，最好做复孔，具体操作步骤如下：
A.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加50μL不同浓度的标准样品；
B.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
C.加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外；
D.温育：用封板膜封板后置于37℃温育60min；
E.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；
F.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干；
G.显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min；
H.终止：每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转为黄色）；
I.测定：以空白孔调零，450nm波长依次测量各孔的吸光度（OD值）。测定要在加终止液后15min以内完成。
2）IL-4：检测具体操作方法同IL-2。
3）IFN-γ：检测具体操作方法同IL-2。
计算方法及数据处理：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；在乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。IL-2、IL-4和IFN-γ的检测结果分别如表8-10和图8所示。
表8融合BS对鸡血清中IL-2浓度的影响
表9融合BS对鸡血清中IL-4浓度的影响
表10融合BS对鸡血清中IFN-γ浓度的影响
（6）融合BS对抗体亚型（IgG1/IgG2）的检测
（1）IgG1：于雏鸡35d和42d时，每组鸡只翼下静脉采血，室温自然凝固10-20min，离心水平，具体操作步骤与计算方法以及数据处理同IL-2。
（2）IgG2：具体操作步骤与计算方法以及数据处理同IL-2。
结果如表11和图9所示，35d时，空白BS组与空白菌液组、垂直菌液组、垂直BS组鸡只血清中IgG1/IgG2水平之间相比较均存在显著差异（P＜0.05）；42d时，空白菌液组与空白BS组鸡只血清中IgG1/IgG2水平之间比较存在极显著差异（P＜0.01）；空白菌液组与垂直菌液组鸡只血清中IgG1/IgG2水平之间比较存在极显著差异（P＜0.01），与垂直BS组之间存在显著差异；空白BS组与垂直BS组鸡只血清中IgG1/IgG2水平之间比较存在显著差异（P＜0.05）。从试验数据结果来看，先天感染ALV-FJ15HT0鸡群血清中IgG1/IgG2水平高于健康鸡；融合BS对健康鸡血清中IgG1/IgG2水平有一定的影响，但对先天感染ALV-FJ15HT0鸡群血清中IgG1/IgG2水平的影响并不显著。
表11融合BS对鸡血清中IgG1/IgG2浓度的影响
注：数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），无肩标或肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），下同。
（7）融合BS对ALV-FJ15HT0鸡群组织中gp85和CNTFRɑ表达的影响
1）引物设计与合成 用引物设计软件（Primer5.0）设计ALV群特异性抗原gp85、CNTFRα和GADPH基因的荧光引物（见表12），送至上海博尚生物公司合成。按引物合成说明书进行稀释引物，-20℃保存备用。
表12荧光定量PCR引物
2）样品的处理及提取
于42d分别取先天感染ALVBS组和先天感染对照组雏鸡法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏和肾脏组织，组织研磨冻融三次后，按照全式金TrizolTM Up RNA Kit试剂盒说明书提取组织样品中的RNA，具体步骤如下：
A、取研磨冻融好的样品，加入1ml Trizol Up，用枪反复吹吸混匀，室温静置5min。
B、加0.2ml氯仿溶液，剧烈震荡30s，室温孵育3min；
C、4℃，10000×g离心15min后样品分三层，将上层无色水相转移至新的离心管，加入等体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀；
D、将混匀后的液体溶液和沉淀一起加入离心柱中，室温条件下，12000×g离心30s，弃掉流出液；
E、加入500μLCB9，室温条件下，12000×g离心30s，弃掉流出液；
F、重复步骤E；
G、加入500μLWB9（使用前需要检查是否加入乙醇），室温条件下，12000×g离心30s，弃掉流出液；
H、重复步骤G；
I、室温条件下，12000×g离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟以彻底晾干离心柱；
J、将离心柱放入RNase-free Tube（试剂盒已配）中，加入80μL RNase-free Water在离心柱中央，室温下静置1min；
K、室温，12000×g离心1min，洗脱RNA；
L、直接进行后续试验或置于-80℃保存。
（3）反转录
参照GoScriptTM Reverse Transcription system试剂盒说明书，进行反转录。反转录后的产物cDNA可直接进行后续的试验或保存在-20℃。反转体系及条件见表13：
表13反转录体系条件
（4）荧光定量PCR（Real-timePCR，RT-PCR）
按照SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行RT-PCR，选用GADPH为内参基因，每个样本需要做3个重复，结果用2-∆∆CT的方法计算统计。40个扩增循环的RT-PCR反应体系及条件见表14：
表14RT-PCR反应体系和条件
结果分析如下：
1）各器官组织中gp85的表达量
由表15和图10可知，在法氏囊组织中，垂直菌液组gp85表达量是垂直BS组gp85表达量的3.8倍，达到了极显著水平（P＜0.01）；在肾脏和胸腺组织中，垂直菌液组法gp85表达量大约是垂直BS组gp85表达量的2-2.5倍，均达到显著差异（P＜0.05）；在肝脏和脾脏组织中，两组gp85没有显著差异（P＞0.05）。由此可见，融合BS对鸡各组织器官中gp85的表达有一定的抑制作用。
表15 gp85表达量
注：数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），无肩标或肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），下同。
2）肝脏、胸腺中CNTFRα的表达量
由表16和图11可知，在肝脏组织中，空白菌液组CNTFRα表达量是空白BS组CNTFRα表达量的3.7倍，达到了显著差异（P＜0.05），而垂直菌液组CNTFRα表达量与垂直BS组CNTFRα表达量几乎是一致的；在胸腺组织中，空白菌液组CNTFRα表达量是空白BS组CNTFRα表达量的2.58倍，而垂直菌液组CNTFRα表达量是垂直BS组CNTFRα表达量的2.58倍。整体来看，融合BS对空白鸡肝脏和胸腺组织中CNTFRα表达有一定的抑制作用，但对于先天感染ALV-FJ15HT0鸡肝脏和胸腺中CNTFRα表达有一定促进作用。
表16 CNTFRα表达量
注：数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），无肩标或肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），下同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 融合三肽囊素的克隆表达及应用
<130> 8
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Ser Pro Arg Met Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro
1 5 10 15
Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro
20 25 30
Tyr Lys Asn Pro Tyr
35
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
His Met Gly Gly Gly Gly Ser Lys Leu Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile
1 5 10 15
Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp Phe
20 25
<210> 3
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaaaacc cgtataaaaa cccgtataaa aacccgtata aaaacccgta taaaaacccg 60
tataaaaacc cgtataaaaa cccgtataaa aacccgtat 99
<210> 4
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catatgggcg gcggcggcag caagcttcag caagcttcag cgcctgatgg aagatatttg 60
cctgccgcgt tggggctgcc tgtgggaaga tgatttttaa taa 103
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcagcttcc tttcgggctt tgt 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgacgacgac gacaaggcca t 21
<210> 7
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Ser Pro Arg Met Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro
1 5 10 15
Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro Tyr Lys Asn Pro
20 25 30
Tyr Lys Asn Pro Tyr His Met Gly Gly Gly Gly Ser Lys Leu Gln Arg
35 40 45
Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp
50 55 60
Asp Phe
65
<210> 8
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgaaaaacc cgtataaaaa cccgtataaa aacccgtata aaaacccgta taaaaacccg 60
tataaaaacc cgtataaaaa cccgtataaa aacccgtatc atatgggcgg cggcggcagc 120
aagcttcagc gcctgatgga agatatttgc ctgccgcgtt ggggctgcct gtgggaagat 180
gatttttaat aa 192

Claims (4)

1.一种融合三肽囊素，其特征在于，由串联四肽BS(8)和融合肽组成，所述串联四肽BS(8)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种如权利要求1所述的融合三肽囊素，其特征在于，由串联四肽BS(8)和融合肽组成，所述串联四肽BS(8)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述融合肽的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
3.一种重组表达载体pET-BS，其特征在于，以pET-32a 为质粒骨架，设计合成串联四肽BS(8)和融合肽的核苷酸序列，构建在质粒骨架上，得到重组表达载体pET-BS。
4.一种如权利要求1所述的融合三肽囊素在制备ALV 先天感染鸡群生长及免疫调节剂中的应用。
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Citations (3)

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