CN110208357A - 基于icp-ms对富硒烟叶的离子组学研究的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于ICP‑MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，包括以下步骤：(1)烤烟试验材料的设计；(2)烤烟样品采集及制备；(3)供试样品溶液的制备；(4)仪器条件设置；(5)ICP‑MS测定过程；(6)数据统计方法分析。本发明利用离子组学研究硒的不同施肥方式及硒含量对烟草的影响，为硒在烟草生产中的科学施肥方式以及合理施肥量提供参考依据。
Description
技术领域
本发明属于离子组学研究技术领域，具体涉及一种基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法。
背景技术
金属元素在生物体内的总体含量比较低，但是多种金属元素却对生物体起着重要作用。例如常见的大量元素钾、钠、钙、镁等元素，以及一些微量或痕量元素锰、锡、钼、镍等。金属元素之所以能在生命体内起着重要作用，是因为金属离子与蛋白和酶相结合。例如，锌(Zn)作为生物体所必需的金属元素，它是生物体中DNA聚合酶和RNA聚合酶的重要组成部分；铁(Fe)结合了生命体内的过氧化氢酶、固氮酶、铁传递蛋白和细胞色素等蛋白质(酶)，这些金属蛋白或金属结合蛋白在生命体内发挥着重要的生物效应。
离子组学(metallomics)的概念是Haraguchi在2002年10月日本举行的国际生物微量元素研讨会上提出的。金属组学作为一门交错学科，是相继基因组学、蛋白质组学及代谢组学之后探究生命体的一种新的组学方法。它旨在系统地研究有机体中游离金属离子、非金属的微量元素、金属蛋白或金属结合蛋白等的分布、含量、化学种类、结构特征和功能。离子组学研究还能更好的了解微量元素的生物学效应和机制以及微量元素相关疾病的发生机制。
目前，用于离子组学的研究技术主要有电感耦合等离子体质谱仪法(ICP-MS)、电感耦合发射光谱法(ICP-OES)、液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪法(HPLC-ICP-MS)等，这些常用的元素鉴定技术不仅能满足能同时检测各种元素基团的含量、分布以及相互作用而且能检测出各种金属形态。而目前，离子组学的主要研究方法有高通量离子组定量分析技术、高通量离子组空间分布研究方法、高通量离子组形态分析方法以及高通量离子组结构分析方法等。
硒是人体和动物所必需的微量元素。缺乏硒会导致人体免疫力以及抗衰老能力下降，机体表现出未老先衰，严重时会引发许多疾病，比如克山病、大骨节病、癌症等。体内过量的硒会产生不适症状，甚至造成机体中毒。鉴于硒对人体健康的影响至深，适当补充硒元素，对抗氧化、防癌抗癌，提高机体免疫力等有重要作用。通过植物吸收硒、再以饮食方式进行补硒是一种最理想的途径。
适量的硒能够促进农作物的生长，提高农作物的品质，增强农作物的抗氧化能力，增强农作物对重金属毒害的抵抗力等。硒除了促进烟草生长之外，最重要的是能够提高烤烟品质，减轻吸烟对人体产生的危害，同时起到一点人体补硒作用，极大提高烟草的安全性。研究表明，硒含量的提高可以减少卷烟中焦油的含量和自由基的浓度。
元素不仅与植物的生长发育密切相关，还影响着其新陈代谢。目前，植物体内可以检测出70多种矿质元素，自然界中存在的所有元素几乎都能在植物体找到。每种元素对植物生长都有着不同的作用，例如磷(P)，它是植物体内许多核酸、磷脂、腺三磷等有机化合物的成分，并以多种方式参与植物体内的生理、生化过程，对植物的生长发育和新陈代谢都有重要作用；钾(K)，它不仅能够促进光合作用，促进纤维素和木质素的合成，促进碳水化合物及氮素的代谢，而且一定量的钾，才能使植物的酶发挥作用[18，19]；镁(Mg)，它不仅是叶绿素的组成部分，许多酶的活化剂，还密切关系着碳水化合物的代谢、磷酸化作用、脱羧作用。
ICP-OES与ICP-MS问世以来，两种技术得到了快速的发展，生命科学的进步还推动了ICP-OES与ICP-MS在植物样品领域的研究。可以用ICP-OES与ICP-MS研究元素与植物生长发育和新陈代谢的关系，通过补充某些元素使得植物能够更好的适应干旱、低温、盐害等不良环境，而且更好的抵抗病虫、倒伏等。ICP-OES与ICP-MS元素测定上与传统的元素测定方法有一定的优势，它们能同时测定多种元素，相对于原子吸收光谱仪单个元素测定上更方便、高效。近几年，金属组学得到了快速的发展，但是金属组学的检测手段还是遇到了很多问题，需要更进一步的研究。
发明内容
本发明提供一种基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，以解决基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究存在的问题。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，包括以下步骤：
步骤一：烤烟试验材料的设计
烤烟试验采取随机区组试验设计，分别设置对照组、根际施肥组、150mL/亩·次叶面喷施组和300mL/亩·次叶面喷施组，试验分为4个处理，每个处理小区面积一样，种植前，对供试土壤的理化性质进行检测；
步骤二：烤烟样品采集及制备
样品采集：烟叶成熟后分小区按照S型路线多点采取组成平均样品，先用自来水再用去离子水清洗样品，迅速干燥后马上进行烘烤，烘烤措施按照标准化生产技术要求执行，烘烤结束后，装入密封袋保存于干燥的环境中；
样品制备：将烤烟用植物粉碎机粉碎，装入密封袋留存；
步骤三：供试样品溶液的制备
称取烤烟0.3g到消煮管，加入6mL硝酸，置于石墨消化仪100℃预消解1h，向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，于120℃消解1h，再向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，温度不变，保持0.5h，再向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，升温至180℃消煮，直至澄清；最后，赶酸至5mL以下，至此，消煮完成；待消煮液冷却至室温后转移至25ml容量瓶中，用纯净水定容至25ml，过滤，待用；消煮时同时做空白对照；
步骤四：仪器条件设置
ICP-MS条件设置
ICP-MS仪器采集参数：雾化气流速：0.92L/min；辅助气流量：1.20L/min；等离子体流量：18L/min；射频功率：1500W；脉冲电压：1250V；碰撞模式入口电压：-4V；碰撞模式输出电压：-24V；
方法采集参数：扫描次数：20次；重复次数：1次；数据采集次数：3次；样品清洗：时间：50s，转速：-30rmp；延迟时间：时间：15s，转速：-20rmp；清洗时间：时间：45s，转速：-30rmp；自动进样；采用标准模式，测定过程中用6Li、45Sc、74Ge、89Y、115In、158Tb、209Bi作为内标液，进行仪器的校准；
步骤五：ICP-MS测定过程
仪器开机正常后，检测仪器状况，然后进行仪器的调谐，调谐完毕后，采用内标法对测定进行校正，接着进行待测烟叶样品溶液的测定；
步骤六：数据统计方法分析
ICP-MS的数据分别通过PE软件系统转换成可识别的excel文件格式，将数据整合生成另一个三维矩阵表，三维矩阵表包含三个指标：质荷比作为元素特性指标，样本的名字以及归一化后的响应值，将上述的三维矩阵表在SIMCA统计软件中进行主成分分析(PCA)。
进一步地，步骤一中所述烤烟的品种为云烟87。
进一步地，步骤一中所述对照组处理为未施用硒肥。
进一步地，步骤一中所根际施肥组处理为施用生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒。
更进一步地，施用生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒量为10kg/亩。
进一步地，步骤一中所述叶面喷施组处理为施用氨基酸纳米硒。
更进一步地，施用氨基酸纳米硒的量为150mL/亩·次及300mL/亩·次。
进一步地，步骤一中所述每个处理小区面积为55.56m2。
进一步地，步骤二中所述标准为GB/T23219-2008标准。
更进一步地，步骤七中所述HNO3溶液的浓度为1％。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明建立了一种基于ICP-MS对不同硒的施用方式获得的富硒烟叶的离子组学研究的方法。样品经过石墨消化仪的消解，利用优化好的ICP-MS仪器方法同时测定烟叶中多种元素。将所测数据经过数据预处理后导入SIMCA统计软件中进行主成分分析(PCA)。结果表明：未经施用外源硒的烟叶(硒含量0.029-0.033mg/kg，对照组)、土施生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒获得的富硒烟叶(硒含量0.188-0.271mg/kg，根际施肥组)，叶面喷施氨基酸纳米硒获得的富硒烟叶(硒含量0.168-0.299mg/kg，叶面喷施组)以及叶面喷施氨基酸纳米硒获得的富硒烟叶(硒含量0.367-0.565mg/kg，叶面喷施组)四组烤烟之间元素分布存在明显的差异。
(2)我国是世界第一烟草大国，人民生活水平在提高的同时，高品质烟草的生产受到了全社会的重视。许多研究都表明硒在提高烤烟品质及安全性中有积极影响。本发明利用离子组学研究硒的不同施肥方式(根际施硒与叶面施硒)及不同硒浓度对烟草的影响，为硒在烟草生产中的科学施肥方式及合理的硒含量提供参考依据。
附图说明
图1为得分图，其中，1代表对照组，2代表根际施肥组，3代表叶面喷施组(150mL/亩·次)，4代表叶面喷施组(300mL/亩·次)；
图2为loading图。
具体实施方式
1.1实验材料
1.1.1仪器与试剂
仪器：电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)：美国PE公司，NEXIOW350X；电子分析天平：北京赛多利斯仪器有限公司，BP121S；60孔石墨消化仪：长沙基隆(ZEROM)仪器仪表有限公司，PROD60。
试剂：硝酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；30％过氧化氢(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水，Milli-Q公司超纯水仪制备。
1.1.2烤烟试验材料
1.1.2.1烤烟试验材料的设计
烤烟不同施硒方式试验是在富川县朝东镇东水村的大田进行，试验时间2017年2月至2017年9月。烤烟品种为云烟87。
试验采取随机区组试验设计，分别设置对照组、根际施用纳米硒营养剂以及叶面喷施纳米硒营养剂试验(见表1)。试验分为4个处理，每个处理小区面积：55.56m2，种植前，对供试土壤的理化性质进行检测，检测值见表1。
表1烤烟材料实验方法设计
| 处理 | 纳米硒营养剂 | 备注 |
| Nx1 | 未施用硒肥 | 对照组 |
| Nx2 | 生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒(10kg/亩) | 根际施肥组 |
| Nxy2 | 氨基酸纳米硒(150mL/亩·次) | 叶面喷施组 |
| Nxy3 | 氨基酸纳米硒(300mL/亩·次) | 叶面喷施组 |
(硒浓度的设计说明：要求根际施硒与叶面喷施硒的最终效果是使烤烟中的硒含量处于同一水平。)
表2供试土壤的理化性质指标
1.1.2.2烤烟样品采集及制备
样品采集：烟叶成熟后分小区按照S型路线多点采取组成平均样品，先用自来水再用去离子水清洗样品，迅速干燥后马上进行烘烤，烘烤措施按照GB/T23219-2008标准化生产技术要求执行，烘烤结束后，装入密封袋保存于干燥的环境中。
样品制备：将烤烟用植物粉碎机粉碎，装入密封袋留存。
1.2实验方法
1.2.1供试样品溶液的制备
称取烤烟0.3g(精确到0.0001g)到消煮管，加入准确6mL硝酸(优级纯)，置于石墨消化仪100℃预消解1h，向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，于120℃消解1h，再向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，温度不变，保持0.5h，再向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，升温至180℃消煮，直至澄清。最后，视情况赶酸(140℃)至5mL以下，至此，消煮完成。待消煮液冷却至室温后转移至25ml容量瓶中，用超纯水定容至25ml，过滤，采用ICP-MS测定。消煮时同时做空白。
1.2.2 ICP-MS仪器条件设置
ICP-MS仪器采集参数：雾化气流速(Nebulizer Gas Flow)：0.92L/min；辅助气流量(Auxiliary Gas Flow)：1.20L/min；等离子体流量(Plasma Gas Flow)：18L/min；射频功率(ICPRF Power)：1500W；脉冲电压(Pulse Stage Voltage)：1250V；碰撞模式入口电压(KED Mode Cell Entrance Voltage)：-4V；碰撞模式输出电压(KED Mode Cell ExitVoltage)：-24V。
方法采集参数：扫描次数(Sweeps/Reading)：20次；重复次数(Replicates)：1次；数据采集次数(Replicates)：3次；样品清洗(Sample Flush)：时间：50s，转速：-30rmp；延迟时间(Read Delay)：时间：15s，转速：-20rmp；清洗时间(Wash)：时间：45s，转速：-30rmp；自动进样；采用标准模式(STD)。测定过程中用6Li、45Sc、74Ge、89Y、115In、158Tb、209Bi作为内标液，进行仪器的校准。测定元素的测量同位素见表3。
表3待测元素同位素信息表
1.2.3 ICP-MS测定过程
仪器开机正常后，检测仪器状况，然后进行仪器的调谐，调谐完毕后，采用内标法对测定进行校正，采用“1.2.2ICP-MS条件设置”方法条件进行待测烟叶样品溶液的测定。
1.2.4数据统计方法分析
ICP/MS的数据分别通过PE软件系统转换成可识别的excel文件格式，将数据整合生成另一个三维矩阵表，三维矩阵表包含三个指标：质荷比作为元素特性指标，样本的名字以及归一化后的响应值。将上述的三维矩阵表在SIMCA统计软件中进行主成分分析(PCA)。
1.3实验结果
1.3.1数据分析实验结果
ICP/MS的分析结果得到的不同元素的名字、样本名及归一化后的响应值的三维矩阵表在SIMCA统计软件中经过PCA分析得到如下结果。如图1四组不同处理烤烟的PCA图所示(PCA得分图上的任一点表示一个对应的样本)，对照组、根际施肥组、叶面喷施组(150mL/亩·次)及叶面喷施组(300mL/亩·次)的元素谱在PCA得分图中得到了较为明显区分。PCA得分图可以表示不同施肥方式下元素的不同使得烤烟在空间分布上的不同，提示我们不同施肥方式是造成植物体的元素发生明显变化的主要影响因素。
基于四组烤烟样本的Loading图(见图2)，本实验在四组之间寻找一些差异的元素。这些差异的元素在表4进行表示。从结果可知，硒不同的施肥方式对植物的生长有很大的影响，根际施肥较叶面喷施对植物体离子的影响较小，不同的硒浓度对烟草的离子吸收也有关系，当硒浓度达到0.367-0.565mg/kg之间时，明显烤烟各元素的吸收降低。所以，建议烤烟的硒浓度控制在0.168-0.299mg/kg之间，采用叶面施肥方式效果更好。
表4差异的元素表
| 序号 | 元素 |
| 1 | Mg |
| 2 | Al |
| 3 | Mn |
| 4 | Mo |
| 5 | Co |
| 6 | Cu |
| 7 | Fe |
| 8 | B |
| 9 | Ba |
本发明建立了一种基于ICP-MS对不同硒的施用方式及不同硒浓度获得的富硒烟叶的离子组学研究的方法。样品经过石墨消化仪的消解，利用优化好的ICP-MS仪器方法同时测定烟叶中的多种元素。将所测数据经过数据预处理后导入SIMCA统计软件中进行主成分分析(PCA)。结果表明：未经施用外源硒的烟叶(硒含量0.029-0.033mg/kg，对照组)、土施生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒获得的富硒烟叶(硒含量0.188-0.271mg/kg，根际施肥组)，叶面喷施氨基酸纳米硒获得的富硒烟叶(硒含量0.168-0.299mg/kg，叶面喷施组)以及叶面喷施氨基酸纳米硒获得的富硒烟叶(硒含量0.367-0.565mg/kg，叶面喷施组)四组烤烟之间元素分布存在明显的差异。
我国是世界第一烟草大国，人民生活水平在提高的同时，高品质烟草的生产受到了全社会的重视。许多研究都表明硒在提高烤烟品质及安全性中有积极影响。本发明利用金属组学和代谢组学研究硒的不同施肥方式(根际施硒与叶面施硒)对烟草的影响，为硒在烟草生产中的科学施肥方式提供参考依据。
尽管已经描述和叙述了被看作本发明的示范实施例，本领域技术人员将会明白，可以对其作出各种改变和替换，而不会脱离本发明的精神。另外，可以做出许多修改以将特定情况适配到本发明的教义，而不会脱离在此描述的本发明中心概念。所以，本发明不受限于在此披露的特定实施例，但本发明可能还包括属于本发明范围的所有实施例及其等同物。
Claims (10)
1.一种基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：烤烟试验材料的设计
烤烟试验采取随机区组试验设计，分别设置对照组、根际施肥组、150mL/亩·次叶面喷施组和300mL/亩·次叶面喷施组，试验分为4个处理，每个处理小区面积一样，种植前，对供试土壤的理化性质进行检测；
步骤二：烤烟样品采集及制备
样品采集：烟叶成熟后分小区按照S型路线多点采取组成平均样品，先用自来水再用去离子水清洗样品，迅速干燥后马上进行烘烤，烘烤措施按照标准化生产技术要求执行，烘烤结束后，装入密封袋保存于干燥的环境中；
样品制备：将烤烟用植物粉碎机粉碎，装入密封袋留存；
步骤三：供试样品溶液的制备
称取烤烟0.3g到消煮管，加入6mL硝酸，置于石墨消化仪100℃预消解1h，向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，于120℃消解1h，再向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，温度不变，保持0.5h，再向其中滴入2mL浓度为30％过氧化氢，摇匀，升温至180℃消煮，直至澄清；最后，赶酸至5mL以下，至此，消煮完成；待消煮液冷却至室温后转移至25ml容量瓶中，用纯净水定容至25ml，过滤，待用；消煮时同时做空白和标准物质对照；
步骤四：仪器条件设置
ICP-MS条件设置
ICP-MS仪器采集参数：雾化气流速：0.92L/min；辅助气流量：1.20L/min；等离子体流量：18L/min；射频功率：1500W；脉冲电压：1250V；碰撞模式入口电压：-4V；碰撞模式输出电压：-24V；
方法采集参数：扫描次数：20次；重复次数：1次；数据采集次数：3次；样品清洗：时间：50s，转速：-30rmp；延迟时间：时间：15s，转速：-20rmp；清洗时间：时间：45s，转速：-30rmp；自动进样；采用标准模式，测定过程中用6Li、45Sc、74Ge、89Y、115In、158Tb、209Bi作为内标液，进行仪器的校准；
步骤五：ICP-MS测定过程
仪器开机正常后，检测仪器状况，然后进行仪器的调谐，调谐完毕后，采用内标法对测定进行校正，接着进行待测烟叶样品溶液的测定；
步骤六：数据统计方法分析
ICP-MS的数据通过PE软件系统转换成可识别的excel文件格式，将数据整合生成另一个三维矩阵表，三维矩阵表包含三个指标：质荷比作为元素特性指标，样本的名字以及归一化后的响应值，将上述的三维矩阵表在SIMCA统计软件中进行主成分分析。
2.根据权利要求1所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，步骤一中所述烤烟的品种为云烟87。
3.根据权利要求1所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，步骤一中所述对照组处理为未施用硒肥。
4.根据权利要求1所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，步骤一中所根际施肥组处理为施用生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒。
5.根据权利要求4所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，施用生物质碳掺杂壳聚糖纳米硒量为10kg/亩。
6.根据权利要求1所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，步骤一中所述叶面喷施组处理为施用氨基酸纳米硒。
7.根据权利要求6所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，施用氨基酸纳米硒的量150mL/亩·次及300mL/亩·次。
8.根据权利要求1所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，步骤一中所述每个处理小区面积为55.56m2。
9.根据权利要求1所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，步骤二中所述标准为GB/T23219-2008标准。
10.根据权利要求1所述的基于ICP-MS对富硒烟叶的离子组学研究的方法，其特征在于，步骤七中所述HNO3溶液的浓度为1％。
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