CN110200975B - 一种药物组合物及其在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药物组合物及其在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用，属于医学和生物学技术领域，所述药物组合物包括雷公藤红素和槲皮素；所述雷公红藤素与所述槲皮素的质量比为1:(1～1000)。在本发明中，所述药物组合物具有显著的神经保护作用，能够治疗神经退行性疾病、神经炎症、显著提升神经细胞的成活率；所述药物组合物在应用过程中不仅可以明显降低雷公藤红素和槲皮素各自的使用剂量，而且能达到优于单独使用的治疗效果。

Description

一种药物组合物及其在制备治疗神经退行性疾病药物中的 应用

技术领域

本发明属于医学和生物学技术领域，尤其涉及一种药物组合物及其在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术

神经退行性疾病是机体神经元结构或功能逐渐丧失而引发的一类疾病，包括帕金森疾病、阿尔兹海默病、亨廷顿氏病等；目前这类疾病病因尚不明确，且尚无有效治愈手段，并严重威胁着患者的生活质量。

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。

帕金森病(Parkinson's disease,PD)，又名震颤麻痹，是一种常见于中老年的神经系统变性疾病。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征。其发病率较高，不仅呈年龄递增、亦呈低龄化，并有全球化高发趋势。帕金森病最主要病理改变为中脑黑质(substantia nigra,SN) 多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性死亡，黑质—纹状体(striatum)多巴胺能通路变性，纹状体多巴胺递质水平显著降低，且多巴胺递质降低程度与患者症状严重程度呈正相关；残存的多巴胺能神经元胞质内病理性标记物路易小体(lewy's body)的形成，其主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein)。帕金森病病因尚不完全清楚，目前认为与遗传因素、环境因素、氧化应激、兴奋性毒性、线粒体功能障碍、细胞凋亡等多种因素相关。

现阶段帕金森病临床诊断主要依靠病史、临床症状及体征，动物模型中辅以检测黑质、纹状体酪氨酸羟化酶水平变化。其中，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，在多巴胺生物合成的调节中发挥重要作用，因此，该酶在生物体内，尤其是在黑质、纹状体中活性和表达量的变化，直接影响L-多巴胺的生物合成。因此，酪氨酸羟化酶水平是评价黑质、纹状体中，多巴胺能神经元水平变化的常用指标。小鼠帕金森病模型中，主要以MPTP诱导黑质多巴胺能神经元凋亡，模拟临床帕金森病发病症状；以及在小鼠黑质中过表达路易小体主要成分α-突触核蛋白实现。

雷公藤红素(Celastrol)是从卫矛科植物雷公藤根部提取的天然类三萜类化合物，易溶于有机溶剂，难溶于水。临床上主要用于治疗风湿性关节炎以及类风湿关节炎等疾病，此外也有报道表明，雷公藤红素对部分肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤活性。2015年一篇发表在《Cell》的文章表明(Liu J,Lee J,Salazar Hernandez MA,et al.Treatment ofObesity with Celastrol[J].Cell, 2015,161(5):999-1011.)，高浓度雷公藤红素具有显著的降低体重作用，高脂饮食诱导的肥胖小鼠在给予雷公藤红素后，脂肪量显著降低41.5％，其主要通过降低摄食量，缓解内质网应激及增加下丘脑瘦素敏感性发挥治疗肥胖的作用。

槲皮素(quercetin)，化学名为3,3',4',5,7-五羟基黄酮，存在于许多植物的花、叶、果实中，其药理作用广泛，具有抗癌、抗炎、心血管系统保护等作用。但因其水难溶性及高剂量毒性较强等特性，故临床上很少将其应用于神经系统疾病的预防和治疗。

医药领域人员在利用雷公藤红素，会不可避免地抑制细胞活性，这一问题无法解决，此外，因雷公藤红素具有一定的毒性且有轻微的中枢神经抑制作用，所以，使用雷公藤红素作为药物治疗神经退行性疾病，发挥神经保护作用仍存在一定的障碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种药物组合物及其在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用；所述药物组合物将雷公藤红素和槲皮素组合，具有显著的神经保护作用，不仅可以明显降低各自的使用剂量，而且能达到优于单独使用的治疗效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种药物组合物，包括雷公藤红素和槲皮素；所述雷公红藤素与所述槲皮素的质量比为1:(1～1000)。

优选的，所述雷公红藤素与所述槲皮素的质量比为1:(200～800)。

优选的，所述雷公红藤素与所述槲皮素的质量比为1:(250～350)。

优选的，所述药物组合物的剂型选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液中的一种。

本发明提供了所述的药物组合物在制备神经保护药物中的应用。

本发明提供了所述的药物组合物在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。

优选的，所述神经退行性疾病包括帕金森疾病、阿尔兹海默病和亨廷顿氏病。

本发明提供了所述的药物组合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。

本发明提供了所述的药物组合物在制备改善黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞分布和形态的药物中的应用。

本发明提供了所述的药物组合物在制备提高纹状体内酪氨酸羟化酶表达的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的药物组合物，包括雷公藤红素和槲皮素，所述雷公红藤素与所述槲皮素的质量比为1:(1～1000)。在本发明中，所述药物组合物具有显著的神经保护作用，能够治疗神经退行性疾病、神经炎症、显著提升神经细胞的成活率；所述药物组合物在应用过程中不仅可以明显降低雷公藤红素和槲皮素各自的使用剂量，而且能达到优于单独使用的治疗效果。

根据本发明实施例的记载，本发明提供的药物组合物能够显著恢复 MPTP所引起的小鼠运动功能障碍，且效果优于单一给药组；能够显著恢复MPTP所引起的多巴胺能神经元凋亡，且效果优于单一给药组；能够显著恢复小鼠纹状体中多巴胺能神经元投射，且效果优于单一给药组；能够显著降低神经炎症水平，且效果优于单一给药组；能够显著提升神经细胞的细胞存活率，发挥神经元保护作用。

附图说明

图1为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、雷公藤红素、槲皮素、雷公藤红素+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠行为学指标的变化情况；

图2为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、雷公藤红素、槲皮素、雷公藤红素+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元形态；

图3为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、雷公藤红素、槲皮素、雷公藤红素+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠纹状体酪氨酸羟化酶水平变化；

图4为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、雷公藤红素、槲皮素、雷公藤红素+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠黑质致密部GFAP阳性和Iba1阳性细胞水平；

图5为MPP+损伤的神经细胞加入对照溶剂，雷公藤红素、槲皮素、雷公藤红素+槲皮素(剂量减半)后细胞存活率；

图6为H₂O₂造成的氧化损伤的神经细胞加入对照溶剂，雷公藤红素、槲皮素、雷公藤红素+槲皮素(剂量减半)后细胞存活率；

图7为MPP+损伤的神经细胞加入对照溶剂，雷公藤红素、槲皮素、雷公藤红素+槲皮素(剂量减半)后细胞凋亡情况。

具体实施方式

本发明提供了一种药物组合物，包括雷公藤红素和槲皮素；所述雷公红藤素与所述槲皮素的质量比为1:(1～1000)，优选为1:(200～800)，更优选为1:(250～350)，最优选为1:300。本发明对所述雷公藤红素和槲皮素的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明对所述药物组合物的剂型没有特殊限定，采用本领域常规剂型即可，包括但不限于片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液；所述药物组合物的剂型还可以为缓释剂。本发明所述药物组合物中还包括辅料，本发明对所述辅料的种类没有特殊限定，采用雷公藤红素和槲皮素可接受的辅料即可。

本发明还提供了所述的药物组合物在制备神经保护药物中的应用。本发明所述药物组合物通过恢复多巴胺能神经元凋亡、恢复纹状体中多巴胺能神经元投射、降低神经炎症水平，能够显著提升神经细胞的细胞存活率，发挥神经保护作用；另外本发明提供的药物组合物具有抗氧化、抗凋亡的功效，通过所述药物组合物的抗氧化和抗凋亡的作用，保护神经细胞。

本发明提供了所述的药物组合物在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。在本发明中，所述神经退行性疾病包括帕金森疾病、阿尔兹海默病和亨廷顿氏病。根据本发明实施例的记载，与正常组相比，模型组行为学指标显著下调，出现明显的运动障碍；而雷公藤红素+槲皮素联合用药组能够显著恢复MPTP所引起的小鼠运动功能障碍，且效果优于单一给药组。

本发明提供了所述的药物组合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。本发明提供的药物组合物，能够显著降低小鼠黑质致密部GFAP和Iba1阳性细胞的量，从而降低神经炎症反应水平。

本发明提供了所述的药物组合物在制备改善黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞分布和形态的药物中的应用。

本发明提供了所述的药物组合物在制备提高纹状体内酪氨酸羟化酶表达的药物中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中所使用的小鼠为：7～8周龄雄性SPF级C57 BL/6小鼠，购买于北京大学医学部实验动物科学部。C57 BL/6小鼠饲养条件：环境温度 22±0.5℃，12小时/12小时明暗交替。

所有实验数据用均数±标准误表示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001， n＝10。

MPTP诱导帕金森病模型建立：小鼠适应性饲养1周后，随机选择体重 22g以上C57BL/6小鼠，腹腔注射30mg/kg MPTP溶液，1天注射1次，连续注射5天。

实施例1

本发明提供的药物组合物治疗帕金森病。

将MPTP注射组(后文简称模型组)随机分成4组，即模型+对照溶剂组，模型+雷公藤红素组，模型+槲皮素组，模型+雷公藤红素+槲皮素组。其中，每组小鼠，以小鼠的质量计，分别腹腔注射对照溶剂(二甲基亚砜 DMSO)、雷公藤红素(100μg/kg)，槲皮素(30mg/kg),雷公藤红素+槲皮素联合用药(雷公藤红素50μg/kg，槲皮素15mg/kg)，每组注射溶剂体积相同，为25μl。

检测每组药物和对照溶剂，每天注射一次，连续注射7天后，各组行为学指标的变化情况。

行为学指标检测：

MPTP诱导的帕金森病模型建立后，于各组药物注射第4天(取材前3 天)开始进行，在安静、适宜的环境中，进行小鼠行为学指标检测练习，每项实验每日检测3次，以排除其他因素对行为学指标的干扰。

1)平衡木实验

1.将小鼠home cage移至测试房间，习惯化1h。

2.准备一组长100cm，直径分别为10mm、20mm、30mm的圆杆以及宽分别为5mm、15mm、30mm的方杆。

3.构建两个离地50cm的平台，两平台相距80cm，其中一平台放置一个暗室。将上述最宽杆搭于两平台之间并固定。

4.将小鼠头朝前放置于暗室对侧的平台，在其身后用强光或噪音刺激其向前行走，记录其抵达暗室所需时间以及期间后肢打滑次数。

5.将宽杆替换为窄杆，测试步骤同理。

6.同一批小鼠每天测试5次，连续测试三天，取平均值。

2)爬杆实验

1.将小鼠home cage移至测试房间，习惯化1h。

2.准备一根长50-60cm，直径为1-1.5cm的圆杆，用纱布包裹防滑，并将其垂直立于小鼠home cage内。

3.将小鼠头朝上放置于圆杆顶端，记录其转为头朝下所需时间以及到达圆杆底部所需时间。

4.同一批小鼠每天测试5次，连续测试三天，取平均值。

3)后肢紧握实验

1.将小鼠home cage移至测试房间，习惯化1h。

2.抓取小鼠尾巴中间部位将其提起，用摄像机记录其后肢活动状态，共记录20s。

3.根据小鼠后肢活动情况进行评分：0分-测试过程中，后肢呈自然张开状态；1分-一侧后肢出现紧握或两侧后肢轻微紧握；2分-两侧后肢大部分时间均紧握，但仍具灵活性；3分-两侧后肢完全紧握，无灵活性。

4.同一批小鼠每天测试3次，连续测试三天，取平均值。

4)转动棒实验

1.将小鼠home cage移至测试房间，习惯化1h。

2.将小鼠放置于测试仪器(转杆)上，初始速度为4rpm，逐渐加速，每 8s增加1rpm，在5min时转速增加至40rpm后不再加速。

3.记录小鼠从杆上掉落的时间。

4.同一批小鼠每天测试3次，每次间隔20min，连续测试三天，取平均值。

实验结果：

实验结果如图1所示，数据以平均值±标准误SEM形式列出。

其中平衡木实验结果数据如下：

爬杆实验结果数据如下：

后肢紧握实验结果数据如下：

转动棒实验结果数据如下：

综上所述，与正常组相比，模型组行为学指标显著下调，出现明显的运动障碍；而雷公藤红素+槲皮素联合用药组能够显著恢复MPTP所引起的小鼠运动功能障碍，且效果优于单一给药组(图1)。

实施例2

本发明药物组合物对黑质及纹状体多巴胺能神经元的保护作用。

酪氨酸羟化酶(TH)为脑内多巴胺合成的限速酶，其水平高低，代表小鼠合成多巴胺的能力，因此，常将酪氨酸羟化酶作为小鼠多巴胺分泌能力的指标。

MPTP模型建立后，每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后(注射剂量与实施例1相同)，利用免疫组化技术检测各组小鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶水平。

免疫组化技术检测步骤具体如下：

1.小鼠灌流后取脑，4％PFA(多聚甲醛)固定24-48小时，20％，30％蔗糖梯度脱水。OCT包埋剂包埋，冰冻切片。

2.切片后铺片，PBS洗，5min*3。

3.透化处理。用0.5％TritonX-100(1X PBS配制)透化处理30min。

4.抗原修复，片子浸入柠檬酸钠溶液，98℃30min，取出待降温至室温。

5.PBS洗，5min*3。

6.阻断内源性过氧化物酶。滴加适量内源性过氧化酶阻断剂。室温孵育 10min。

7.PBS洗，5min*3。

8.封闭。滴加适量封闭用山羊血清工作液。室温孵育15min，倾去血清，勿洗。

9.一抗。滴加适量一抗，4℃孵育12h(过夜)。

10.PBS洗，5min*3。

11.二抗。滴加适量二抗(生物素标记IgG)，室温孵育15min。

12.PBS洗，5min*3。

13.三抗。滴加适量三抗(辣根酶标记链霉卵白素工作液)。室温孵育 15min。

14.PBS洗，5min*3。

15.配制DAB工作液。底物液和浓缩液按照20:1进行配制，混合均匀即成工作液。该溶液现用现配，配好后避光保存，6小时内使用，剩余液体应弃去。

16.DAB显色。每张切片滴加50-100uL DAB工作液，在显微镜下观察显色情况，显色时间一般为5-20min，显色充分后将切片放入自来水中终止反应。

17.封片。

18.保存。封好的片子放入片盒中保存，室温或4℃均可。

19.拍摄。

实验结果如图2和图3所示，结果证实与正常组相比，模型组小鼠黑质致密部TH阳性神经元数量显著下降，即出现明显的多巴胺能神经元凋亡情况。而雷公藤红素+槲皮素联合用药组能够显著恢复MPTP所引起的多巴胺能神经元凋亡，且效果优于单一给药组(图2)。

此外，亦证实模型组小鼠纹状体中多巴胺能神经元投射显著降低，而雷公藤红素+槲皮素联合用药能够显著恢复这一情况，且效果优于单一给药组 (图3)。

实施例3

本发明药物组合物治疗神经炎症。

目前认为，神经炎症的发生与发展是神经退行性疾病发病的相关因素之一，神经炎症在神经退行性疾病进程中促进介导神经元进行性死亡的作用已被广泛证实。神经炎症的发生主要包括小胶质细胞激活、星形胶质细胞激活等炎性反应。进一步这些中枢的炎性细胞通过多种机制相互作用，产生促炎细胞因子放大炎症信号，产生直接作用在神经元的神经毒素，最后导致神经退行性疾病的发生。

MPTP模型建立后，每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，注射量与实施例1相同，利用免疫组化技术检测各组小鼠黑质致密部GFAP和Iba1阳性细胞。其中，GFAP和Iba1分别为星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物，其异常活化指示神经炎症水平的上升。免疫组化技术的具体步骤参见实施例2。

实验结果如图4所示。

结果证实，而雷公藤红素+槲皮素联合用药组能够显著降低神经炎症，且效果优于单一给药组(图4)。

实施例4

本发明药物组合物的神经保护作用。

SH-SY5Y细胞为(购买自中科院细胞库)人类神经瘤母细胞细胞系，常用于神经退行性疾病的体外实验。向SH-SY5Y细胞加入毒性物质 50μMol/LMPP+后，出现显著的神经损伤情况。此时，分别向细胞中加入对照溶剂(1μMol/L DMSO)、雷公藤红素(2μMol/L)，槲皮素(20μMol/L)，以及雷公藤红素+槲皮素联合组(1μMol/L+10μMol/L)。

MTT即Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，也称Thiazolyl bluetetrazolium bromide，中文名为噻唑蓝。分子式为C₁₈H₁₆BrN₅S，分子量为 414.32。

1)MTT粉末(500mg)配制成5mg/ml溶解于无菌PBS溶液中(500mgMTT 粉末，溶解于100ml无菌PBS中，两个50ml离心管)，完全混匀后，用0.22μm 滤膜过滤后，装于EP管中，避光-20℃长期保存。

2)胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5～10×10⁴/ml。

3)将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100μl，这样待测细胞的密度为5000～10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

4)将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96 孔平底板)，加入浓度梯度的药物，细胞贴壁后即可加药，约6h左右，每孔 100μl，设3～6个复孔。

(1)将药物按不同体积(1，10，20μl)加入到96孔板中，以形成浓度梯度。(2)在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基。

5)5％CO₂，37℃孵育16～48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

6)每孔加入10μlMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

7)终止培养，准备溶解结晶。

(1)MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把结晶移走。

(2)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强，数据以平均值(百分比)±标准误形式表示。具体实验结果如下：

由此可见，雷公藤红素+槲皮素联合用药能够显著提升神经细胞的细胞存活率，发挥神经元保护作用(图5)。

实施例5

本发明药物组合物的抗凋亡作用。

荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

向SH-SY5Y细胞加入毒性物质50μM MPP+后，分别向细胞中加入对照溶剂(1μMDMSO)、雷公藤红素(2μMol/L)，槲皮素(20μMol/L)，以及雷公藤红素+槲皮素联合组(1μMol/L+10μMol/L)。

5％CO₂，37℃孵育培养24小时后，PBS洗1-2次，加入碘化丙啶溶液和7μM Hochest(标记细胞核)孵育15分钟。弃掉染色液，PBS洗1-2次，封片。荧光显微镜拍摄，计算碘化丙啶红色荧光与Hochest蓝色荧光标记细胞比值，即得细胞凋亡情况数据(图6)。数据以平均值±标准误形式表示，结果如下：

实施例6

本发明药物组合物的抗氧化、神经保护作用。

向SH-SY5Y细胞加入毒性物质100μM H₂O₂后，出现显著的神经损伤情况。此时，分别向细胞中加入对照溶剂(DMSO)、雷公藤红素(2μMol/L)，槲皮素(20μMol/L)，雷公藤红素+槲皮素联合(1μMol/L+10μMol/L)。

结果如图7所示，数据以平均值±标准误形式表示，具体结果数据如下：

结果证实，雷公藤红素+槲皮素联合用药能够显著提升神经细胞的细胞存活率，发挥神经元保护作用。

由上述实施例可知，本发明提供的药物组合物可以明显降低各自使用剂量，仍能达到优于单独使用的效果，是一项具有巨大临床前景的联合应用发现。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种治疗帕金森疾病的药物组合物，其特征在于，由雷公藤红素和槲皮素组成；所述雷公红藤素与所述槲皮素的质量比为1:300或1:10。

2.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液中的一种。

3.权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用。

4.权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗帕金森疾病的药物中的用途，其特征在于，所述药物组合物是通过神经保护、治疗神经炎症、改善黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞分布和形态以及提高纹状体内酪氨酸羟化酶的一种或多种来治疗帕金森疾病的。

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