CN110200957A - 氟芬那酸在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用 - Google Patents

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刘雪楠
夏丹丹
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Abstract

本发明提供了氟芬那酸在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用。非甾体类药物中灭酸类的代表药——氟芬那酸能够通过抑制NF‑κB信号通路，促进间充质干细胞体内外成骨分化，增加增龄性骨质疏松小鼠及雌激素缺乏性骨质疏松小鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度及数量，降低骨表面积与骨体积之比及骨小梁分离度，减少破骨细胞数量，从而达到预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松的效果。本发明产品氟芬那酸，是一种非甾体类抗炎药，以往临床用于抗炎镇痛，具有廉价易得、安全有效、副作用小等诸多优点，在预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松中具有广阔的应用前景。

Description

氟芬那酸在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用
本发明属于医药领域，具体涉及氟芬那酸在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用。
背景技术
骨质疏松症是一种内分泌、营养、免疫等多因素引起全身性代谢性骨病，以骨量减少、骨组织的微结构破坏引起骨脆性增加与骨折发生的风险增加为特征，其临床表现主要为骨骼疼痛、腰背畸形和脊柱变形，还可引起骨折，一旦发生髋部骨折，一年内死于各种合并症者达20％，而存活者中约50％致残，严重影响了患者的生活质量。骨质疏松症可发生在任何年龄段，随着年龄增长不断加重。据世界卫生组织的报道，全球骨质疏松症患者人数已经超过两亿，是居于第六位的常见多发病。随着我国社会老龄化的到来与进程加快，骨质疏松症的发病率上升，有待研制新型高效的抗骨质疏松药物。
按照抗骨质疏松症药物的作用机制，其主要分为骨吸收抑制剂、骨形成促进剂与骨矿化物。骨吸收抑制剂主要包括雌激素、双磷酸盐及降钙素等；骨形成促进剂主要包括氟化物及甲状旁腺激素等；骨矿化物主要包括钙剂及维生素D等。雌激素可以抑制骨吸收，但其发挥功效不仅仅作用于骨，还作用于全身其他器官，增加乳腺及子宫癌的风险，现已不做为常规用药；双磷酸盐长期应用会抑制骨的转换，引起骨强度下降与颌骨骨髓炎，还会导致恶心、呕吐、腹痛、腹泻等副作用；降钙素能抑制骨的吸收，还可抑制骨盐的溶解，其引起的不良反应有：面部或躯体皮肤潮红、恶心、呕吐等。氟化物能促进成骨细胞形成新骨，但长期应用此类药物容易导致钙化缺陷；甲状旁腺素的长期安全性缺乏足够证据，不良反应包括恶心、头痛、关节痛。单纯采用骨矿化物抗骨质疏松的疗效不明显，同时，长期大量摄入钙剂会引起高血钙症、影响铁吸收及便秘等；维生素D及其代谢产物可以促进肠道吸收钙，参与钙磷的调节，促进骨骼的钙化，但是，过量补充维生素D可能导致破骨细胞活跃与骨吸收增加，其对骨量的影响是双向的。由于诸多的副作用，骨质疏松患者长期应用抗骨质疏松药物受到限制。
因此，研发更安全、能同时抑制骨吸收并能促进骨形成的抗骨质疏松药物迫在眉睫。
发明内容
针对现有骨质疏松药物存在的上述副作用及不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种有助于预防和治疗骨质疏松且更安全的药物。旨在解决因现有预防和治疗骨质疏松药物的副作用而限制了骨质疏松患者长期使用这些药物的问题。
为了解决上述技术问题，本申请采用如下技术方案予以实现：氟芬那酸(FFA)在制备预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松的药物中的应用，氟芬那酸能够通过抑制NF-κB信号通路，促进间充质干细胞体内外成骨分化，增加增龄性骨质疏松小鼠及雌激素缺乏性骨质疏松小鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度及数量，降低骨表面积与骨体积之比及骨小梁分离度，减少破骨细胞数量，从而达到预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松的效果。
实验过程包括如下几个方面：
1)在体外检测低浓度氟芬那酸对人间充质干细胞成骨向分化的作用；
2)通过裸鼠背部皮下植入实验检测低浓度氟芬那酸对人间充质干细胞体内成骨向分化的作用；
3)Real-time qPCR实验、Western blot实验检测低浓度氟芬那酸对NF-κB信号通路的影响；
4)建立小鼠增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松模型实验组小鼠通过腹腔注射方式给氟芬那酸，对照组小鼠通过腹腔注射给生理盐水；
5)Micro CT、小鼠股骨切片HE染色及小鼠骨形态计量分析给药1月后，小鼠股骨的变化。
本发明产品氟芬那酸治疗骨质疏松与现有治疗骨质疏松的药物相比，具有以下优点：
本发明产品氟芬那酸，属于非甾体类抗炎药中的灭酸类药物，以往临床用于风湿性及类风湿关节炎，主要发挥其抗炎镇痛作用。其临床应用已近50年，安全性已得到肯定，故氟芬那酸在预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松中具有广阔的开发应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.氟芬那酸显著增加增龄性骨质疏松小鼠及雌激素缺乏性骨质疏松小鼠的骨密度及改善骨质疏松小鼠的骨微结构。
图2.低浓度氟芬那酸在体外促进人间充质干细胞成骨向分化。碱性磷酸酶(ALP)染色(a)及定量(c)实验以及茜素红(ARS)染色(b)及定量(d)实验显示25、50、100μM氟芬那酸均对人间充质干细胞体外成骨向分化有促进作用。其中50μM氟芬那酸促成骨作用最强。Real-time qPCR结果(e，f)与染色实验结果一致。
图3.低浓度氟芬那酸促进人间充质干细胞体内成骨向分化。HE染色(a)及Masson染色(b)结果表明，FFA处理组生成了更多的新生骨组织。
图4.低浓度氟芬那酸通过抑制NF-κB信号通路促进人间充质干细胞体外成骨向分化。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
氟芬那酸在制备预防和治疗骨质疏松的药物中的应用，增龄性骨质疏松小鼠及雌激素缺乏性骨质疏松小鼠接受氟芬那酸治疗后，股骨的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度及数量增加，骨表面积与骨体积之比及骨小梁分离度降低，破骨细胞数量减少，从而达到预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松的效果。
1)在体外实验中筛选氟芬那酸体外促成骨最佳浓度
在成骨诱导培养基中加入25、50、100、200μM氟芬那酸，通过碱性磷酸酶染色及定量、茜素红染色及定量以及Real-time qPCR实验检测不同浓度氟芬那酸对人间充质干细胞体外成骨向分化的影响，可见25、50、100μM氟芬那酸均对人间充质干细胞体外成骨向分化有促进作用。其中50μM氟芬那酸促成骨作用最强。具体实验结果见图2。
2)通过裸鼠背部皮下植入实验检测低浓度氟芬那酸对人间充质干细胞体内成骨向分化的作用
12只6周龄雌性裸鼠，随机均分为2组。一组在背部皮下植入在普通增殖培养基(PM)中培养的细胞与骨粉的混合物，一组在背部皮下植入在加入了50μM氟芬那酸的普通增殖培养基(PM+FFA)中培养的细胞与骨粉的混合物。植入8周后收集样本固定于4％多聚甲醛溶液。之后进行脱钙、切片及HE和Masson染色。两种染色结果表明50μM氟芬那酸处理能够促进人间充质干细胞体内成骨向分化。具体实验结果见图3。
3)Real-time qPCR实验、Western blot实验检测低浓度氟芬那酸对NF-κB信号通路的影响
通过Real-time qPCR实验及碱性磷酸酶染色及定量、茜素红染色及定量、Westernblot实验探究氟芬那酸促进人间充质干细胞体外成骨向分化的机制。实验结果表明氟芬那酸处理能够显著抑制NF-κB信号通路下游靶基因的表达。当NF-κB信号通路的激活剂TNF-α或LPS存在时，氟芬那酸的促成骨作用减弱。而当该通路的抑制剂Bay存在时，氟芬那酸的促成骨作用则增强。同时，氟芬那酸能够抑制NF-κB信号通路各关键蛋白的活化。具体实验结果见图4。Real-time qPCR结果(a)表明低浓度氟芬那酸抑制NF-κB信号通路下游靶基因表达。碱性磷酸酶(ALP)染色(b)及定量(d)实验以及茜素红(ARS)染色(c)及定量(e)实验显示当NF-κB通路的激活剂TNFα或LPS存在时，氟芬那酸的促成骨作用减弱。而当该通路的抑制剂Bay存在时，氟芬那酸的促成骨作用则增强。Real-time qPCR结果(f)与染色结果一致。Western blot结果(g，h)表明氟芬那酸能抑制NF-κB信号通路各关键蛋白的活化。
4)建立小鼠增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松模型
实验组小鼠通过腹腔注射方式给氟芬那酸，对照组小鼠通过腹腔注射给生理盐水。Micro CT、小鼠股骨切片HE染色及骨形态计量分析给药1月后，小鼠股骨的变化：取各组小鼠的右侧股骨去除软组织后，固定于4％多聚甲醛溶液24小时，进行Micro-CT扫描，检测氟芬那酸对小鼠股骨骨密度及骨微结构的影响，从而检测氟芬那酸对两种骨质疏松的预防和治疗效果，扫描参数为：电流为220μA，电压为60kV，曝光时间为1500ms。扫描后进行脱钙、切片及HE染色。实验结果表明氟芬那酸能够增加12月龄的老年鼠(代表了增龄性骨质疏松)及卵巢切除术后(OVX)小鼠(代表了雌激素缺乏性骨质疏松)的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度及数量，降低骨表面积与骨体积之比及骨小梁分离度。两类小鼠的骨形态分析结果也表明：代表骨形成的指标BV/TV(骨体积/总体积)、Tb.N(骨小梁数目)、MAR(矿化速率)、N.Ob/T.Ar(成骨细胞数量与总组织量之比)有所上升，而代表骨吸收的指标Tb.Sp(骨小梁间距)有所下降。这佐证了Micro-CT的结果：氟芬那酸能够促进小鼠骨形成，抑制其骨吸收。此外，N.Oc/T.Ar(破骨细胞数量与总组织量之比)及N.Oc/B.Pm(破骨细胞数量与骨表面积之比)两个代表破骨细胞数量的指标均有显著降低，表明氟芬那酸能够同时减少破骨细胞的数量。最终达到预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松的作用。具体实验结果见图1及表1、2，Micro-CT及HE染色结果表明氟芬那酸能够改善两种骨质疏松模型中小鼠股骨骨质情况。
表1卵巢切除小鼠骨形态分析
*p<0.05,**p<0.01。
表2老年小鼠骨形态分析
*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行局部修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.氟芬那酸在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：氟芬那酸能在体内外促进人间充质干细胞成骨向分化。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：氟芬那酸能抑制NF-κB信号通路的激活。
4.如权利要求1-3任一权利要求所述的应用，其特征在于：氟芬那酸能增加增龄性骨质疏松及雌激素缺乏性骨质疏松的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度及数量，降低骨表面积与骨体积之比及骨小梁分离度，减少破骨细胞数量，从而达到预防和治疗增龄性及雌激素缺乏性骨质疏松的效果。
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