CN110186920B - 一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法，属于杉木无性繁殖技术领域。发明的方法通过观测室内模拟低磷胁迫条件下，筛选出根系皮层组织细胞溶解明显，且有丛枝菌根真菌繁殖体侵染定殖的杉木无性系，即为磷高效利用良种。本发明能快速、精准筛选出高效利用土壤磷的杉木优良无性系，尤其适合于杉木高密度种植林分的运用。
Description
技术领域
本发明属于杉木无性繁殖技术领域，具体涉及一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法。
背景技术
杉木（Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook）是我国南方亚热带地区特有的优良用材造林树种，由于红壤磷素固化严重，迁移率低，林木可吸收利用的土壤有效磷极度缺乏。植物在这种环境下进化出多种机制以适应低磷胁迫，包括菌根共生体、根系伸长和增殖、形态生理以及根构型的变化等。可见，若能充分挖掘植物自身遗传潜力，筛选出对土壤有限磷资源利用效率较高的基因型，即可补充代替传统方法所需的磷素矿质能源，有效减少磷肥施用量，为实现农林植物高效生产提供科学途径。
传统上，为筛选出高效利用土壤磷素的杉木优良种质资源，林业研究工作者通常利用野外调查或室内盆栽模拟试验，通过树高（苗高）、胸径（地径）和根系指标等生长量，结合单位磷素含量的生物质产量来评价不同杉木基因型的磷素利用效率。然而，由于野外土壤环境因子的异质性，或者室内盆栽模拟试验时间较短，造成目前的评价结果可能出现的误差较大，仍需要长期验证才可推广。如何利用杉木本身具有稳定遗传性的特异性指标进行杉木良种筛选，具明显迫切性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法。本发明能快速、精准筛选出高效利用土壤磷的杉木优良无性系，尤其适合于杉木高密度种植林分的运用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法：通过室内模拟低磷胁迫条件，筛选出根系皮层组织细胞溶解明显，且有丛枝菌根真菌繁殖体（泡囊）侵染定殖的杉木无性系，即为磷高效利用良种。
一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法，具体包括以下步骤：
（1）材料准备：准备盆栽装置、参试无性系杉木幼苗和栽培基质；
（2）丛枝菌根真菌接种：将丛枝菌根真菌的菌种与步骤（1）准备的栽培基质混合均匀、备用。
（3）栽植与管理：将步骤（1）中参试杉木幼苗栽植于步骤（1）的盆栽装置中，1株/盆；同时用步骤（2）接种丛枝菌根真菌之后的栽培基质装入盆栽装置，≥5 kg/盆；为保证杉木幼苗的正常生长，每隔7 d每盆浇不含磷素的1/4 Hoagland’s营养液1次，根据栽培基质重量，每次浇60 ml/kg，以满足杉木生长对其他营养元素的需求。
（4）收获：参试杉木幼苗栽植2~3个月后进行参试苗木的收获，将收获的杉木幼苗根系用去离子水冲洗干净，利用棉布吸干根系表面水分。将根系样品分为2份备用，分别用于观察丛枝菌根真菌侵染情况和观测皮层组织细胞的溶解程度。
（5）侵染情况观察：将根系样品制片，显微镜观察丛枝菌根真菌的侵染情况。
（6）根系皮层组织细胞溶解情况观察：将根系样品制备成切片，显微镜观察皮层组织细胞的溶解情况；将根系样品放入5 ml玻璃瓶中，加入2 ml体积比为甲醛：乙酸：70vol%乙醇=1:1:18的固定液，经过脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、染色以及显微镜观察，进行观测计算皮层组织细胞的溶解面积。
（7）根据参试杉木不同无性系幼苗根系丛枝真菌根系侵染率和皮层组织溶解率的差异，筛选出侵染率15%以上、皮层组织细胞溶解率10%以上的杉木无性系为磷高效利用良种。
上述步骤（1）所述盆栽装置为盆口直径18 cm、盆底直径9 cm、高32 cm的聚乙烯材质盆栽装置，使用前在0.1 g/L KMnO4溶液中浸泡20 min进行消毒，然后取出用无菌水冲洗、晾干，备用；所述参试无性系杉木幼苗为长势均一、无病虫害的不同无性系杉木幼苗，采用0.5 wt% NaClO溶液对参试杉木根系表面消毒0.5 min，再用无菌水反复冲洗处理后备用；所述栽培基质为洗净晾干后过2 mm 网筛的河心沙与珍珠岩按体积比为3:1的比例混合，装入灭菌袋中，灭菌后自然晾干7 d后备用；灭菌的条件为121℃，0.1~0.2 MPa 高温高压灭菌30 min。
上述步骤（1）所述栽培基质的有效磷含量低至0.12±0.02 mg/kg。
上述步骤（2）所述丛枝菌根真菌的菌种与步骤（1）准备的栽培基质按体积比为1:10的比例混合。
上述步骤（2）所述丛枝菌根真菌为根内球囊霉（Rhizophagus irregularis），其菌种为购买的商业化菌种。
步骤（5）所述根系样品制片具体为：根系样品剪成1 cm的根段，放入50 ml烧杯中，用99 wt％乙醇和60 wt％乙酸按 3：1体积比混合的储存溶液固定4 h以上；除去储存液，无菌水洗涤2次；加入的20 wt% KOH溶液90~96℃加热透明45 min；除去KOH，无菌水洗涤2次；加入2 wt% HCl溶液酸化30 min；除去HCl溶液，无菌水洗涤2次；加入0.05 wt% Trypanblue溶液染色；经过优选的染色时间后，洗去染色剂，加入脱色液脱色。
上述步骤（7）中侵染率计算公式如下：
菌根侵染率F%=（菌根侵染段数/全部根段数）×100%。
上述步骤（7）中皮层组织细胞的溶解面积，利用Image J 1.46e 软件对上述步骤（6）中根系切片显微观测照片进行分析，皮层组织细胞溶解率按以下公式计算：
皮层组织细胞溶解率（%）= [皮层组织细胞的溶解面积/（皮层组织横截面总面积–中柱面积）] × 100%。
上述方法在磷高效利用杉木选育中的应用。
本发明的优点在于：
（1）提出一种杉木磷高效利用种质材料选育的良种鉴定方法，从菌根共生的角度出发，利用低磷胁迫条件下，一些杉木无性系可通过根系皮层组织细胞溶解，形成根系通气组织的特异性反应，这样，根系一方面可以释放出磷素等营养供植株体内循环利用，另一方面可以减小这些衰亡细胞的代谢消耗。根系对低磷环境的这种响应具明显特异性，且利用无性繁殖苗木具有的稳定遗传性。而丛枝菌根真菌的菌丝有助于吸收土壤磷素是不争的事实。本发明将杉木根系的这两种特性有机结合起来考虑，通过观察低磷环境参试杉木苗木根系皮层组织细胞是否溶解形成通气组织，这些通气组织形成的空腔是否定殖有丛枝菌根真菌的繁殖体，以此判断杉木不同无性系的磷素利用效率具明显的科学性，大大提高了杉木良种的鉴定效率和可靠性。
（2）与传统室内盆栽模拟试验的筛选，通过苗高、地径和根系指标等生长量，结合单位磷素含量的生物质产量来评价不同杉木无性系的磷素利用效率，同时还需要测定光合、根系活力等多个生理指标的复杂鉴定过程相比，本发明提供的方法更为快捷、方便易学，是林业基层单位技术人员均可掌握的鉴定技术，运用性强。
附图说明
图1 AM真菌侵染杉木根系的菌丝结构。
图2 AM真菌侵染杉木根系的泡囊结构。
图3 AM真菌定殖于杉木根系组织细胞内的泡囊。
图4 杉木幼苗根系1-2级根不同AMF菌种侵染率的比较。不同字母表示不同处理间的差异达显著水平（p<0.05）。
图5 低磷环境不同杉木种质材料根系皮层组织细胞溶解程度的差异。10–15 mm和40–45 mm 分别表示离根尖不同距离的杉木根系皮层组织的横截面；Family no. 25 andFamily no. 36 分别表示25和36号杉木家系幼苗；P1.0、P0.5和P0分别表示不同的供磷浓度，即1.0 mmol/L、0.5 mmol/L 和0 mmol/L KH2PO4；TA（The areas of total cross）：根系皮层组织横截面的总面积，μm2，SA（stele area）：中柱的面积，μm2，SCA（soluble corticalcells）：皮层组织细胞的溶解面积，μm2。
具体实施例：
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
试验地点：在福建农林大学科技园温室大棚。
材料准备：
盆栽装置：采用盆口直径20 cm、盆底直径16 cm、高20 cm的聚乙烯材质装置进行室内盆栽试验，该装置使用前在0.1 g/L KMnO4溶液中浸泡20 min之后，取出用干净水冲洗、晾干，备用。
参试无性系杉木幼苗：选择国家林业和草原局杉木工程技术研究中心培育的25号和36号杉木种质材料为研究对象。参试材料为一年生苗木，生长健壮，试验初始的平均苗高为17.27±1.72 cm，平均直径为2.85±0.52 mm。参试杉木幼苗在盆栽之前，用0.5 wt%NaClO溶液充分对根系表面消毒0.5 min后，再用无菌水反复冲洗灭菌处理后备用。
栽培基质：洗净晾干后过2 mm 网筛的河心沙与珍珠岩按体积比为3:1的比例混合，将栽培基质装入直径25 cm、长度40 cm的灭菌袋（高密度聚乙烯膜）中，于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌，每次灭菌的条件为121℃( 0.1~0.2MPa) 高温灭菌30 min，取出自然晾干7d后备用。
丛枝菌根（AM）真菌接种
分别接种根内球囊霉Glomus intraradices和摩西球囊霉Glomus mosseae至备用栽培基质中（0.6: 6，L/L）形成混合基质，其中，接种摩西球囊霉为试验对照处理。2种菌种均由北京蔬卉科技有限责任公司提供，不同混合基质的基本理化性质如表1。
表1 混合基质的基本理化性质
1.3栽植与管理
于2018年8月11日将备用的杉木幼苗栽植于盆栽装置中，栽培培基质为灭菌后的河心沙与珍珠岩（3:1，L/L）（有效磷含量0.12±0.02 mg/kg)，将接种的丛枝菌根真菌与栽培基质混合装入盆栽装置，每盆装混合基质5.0 kg，每盆栽种1株杉木幼苗。
根据南方红壤有效磷含量的特性，设置3个供磷浓度：正常供磷（1.0 mmol/LKH2PO4）、轻度磷胁迫（0.5 mmol/L KH2PO4）和重度磷胁迫（0 mmol/L KH2PO4），每个处理5个重复。为保证试验期间杉木幼苗的正常生长，每隔7 d每盆根据不同供磷浓度分别浇一次对应的1/4 Hoagland’s营养液，每次浇60 ml/kg，为平衡不同供磷处理间K+含量的差异，选择用KCl来替代。每2 d傍晚浇60 ml/kg纯水。
于2018年10月11日进行收获。将收获的杉木幼苗的根系用去离子水冲洗干净，利用棉布吸干植株表面水分。将根系样品分为2份备用，分别用于观察丛枝菌根真菌侵染情况和观测皮层组织细胞溶解形成通气组织的情况。
菌根侵染率测定
取杉木幼苗完整根系、洗净，剪取1级和2级根序的根组织样品用于菌根侵染率的测定。分别取不同处理的根段，放入50ml烧杯中，经过储存溶液（99％乙醇+ 60％乙酸= 3：1）固定4 h以上；无菌水洗涤2次去储存液；加入20 wt%的KOH溶液进行加热（1级根90℃，2级根96℃）透明45min；无菌水洗涤2次取去KOH；加入2 wt% HCl溶液加热酸化30 min；无菌水洗涤2次去HCl溶液，；加入0.05 wt% Trypan blue溶液染色；经染色（1级根30min，2级根10min）后，洗去染色剂，加入脱色液脱色；后制片（镜检法）观察。其中，只要含有一个菌根结构（菌丝、泡囊或丛枝）侵入点的根段就视为已有菌根侵染。
菌根侵染率（%）=（菌根侵染段数/全部根段数）×100%
1.5 根系皮层组织细胞溶解率观测
取杉木幼苗完整根系、洗净，剪取距根尖10–15 mm和 40–45 mm的根组织样品用于皮层组织溶解率的测定。切片观察：取新鲜2cm的杉木根端放入5ml小玻璃瓶中，加入2 ml固定液（甲醛：乙酸：70%乙醇=1:1:18，体积比），经过脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、染色以及显微镜观察，采用4X光学镜头（Plan Fluor PhL DL）进行观测计算皮层组织细胞的溶解面积。皮层组织细胞溶解率（%）= [皮层组织细胞的溶解面积/（皮层组织横截面总面积–中柱面积）] × 100%
1.6 结果与分析
菌根染色是观察AM真菌侵染根系结构情况的基础，其效果直接影响试验结果的准确性，是开展AM真菌研究比较重要的步骤。根据AM真菌侵染杉木根系的菌根结构：根系细胞、菌丝结构、泡囊结构清晰（图1、2、3），得出AM真菌侵染杉木根系的侵染率，其中，与1级根相比，细胞组织相对比较成熟的，距根尖（40-45 mm）2级根侵染率较高，平均侵染率达14.50%，而距根尖（10-15 mm）的1级根侵染率相对较低，平均侵染率4.34%（图4）。
从根系皮层组织溶解程度来看（表2和图5），无论供磷水平如何，2个参试杉木幼苗在离根尖10-15 mm的根段均未根系皮层组织细胞的溶解（Soluble cortical cells,SCA）。对于细胞组织较为成熟的离根尖40-45 mm根段而言，虽然2个参试杉木在在正常供磷条件下（1.0 mmol/L KH2PO4）均未观测到SCA；但在重度低磷胁迫（0.0 mmol/L KH2PO4）下，36号杉木幼苗根系SCA高达10.7%，明显多于25号杉木（3.1%）。而中度低磷胁迫（0.5 mmol/LKH2PO4）仅介导了36号杉木幼苗SCA的发生。
综上，筛选出36号杉木为磷高效利用杉木良种。
表2 不同供磷浓度处理下2个参试杉木根系皮层组织溶解率的比较
*表示不同杉木家系或供磷浓度处理之间差异达显著水平，p < 0.05；不同字母表未不同处理之间的差异达显著水平，p < 0.05。表中数值以平均值±标准误表示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法，其特征在于：通过模拟低磷胁迫条件，筛选出根系皮层组织细胞溶解明显，且有丛枝菌根真菌繁殖体侵染定殖的杉木无性系，即为磷高效利用良种；
具体包括以下步骤：
（1）材料准备：准备盆栽装置、参试无性系杉木幼苗和栽培基质；
（2）丛枝菌根真菌接种：将丛枝菌根真菌的菌种与步骤（1）准备的栽培基质混合均匀、备用；
（3）栽植与管理：将步骤（1）中参试杉木幼苗栽植于步骤（1）的盆栽装置中，1株/盆；同时用步骤（2）接种丛枝菌根真菌之后的栽培基质装入盆栽装置，≥5 kg/盆；为保证杉木幼苗的正常生长，每隔7 d每盆根据供磷浓度分别浇一次对应的1/4 Hoagland’s营养液，根据栽培基质重量，每次浇60 ml/kg，以满足杉木生长对其他营养元素的需求；
（4）收获：参试杉木幼苗栽植2~3个月后进行参试苗木的收获，将收获的杉木幼苗根系用去离子水冲洗干净，利用棉布吸干根系表面水分；将根系样品分为2份备用，分别用于观察丛枝菌根真菌侵染情况和观测皮层组织细胞的溶解程度；
（5）侵染情况观察：将根系样品制片，通过显微镜观察丛枝菌根真菌的侵染情况；
（6）根系皮层组织细胞溶解情况观察：将根系样品制备成切片，显微镜观察皮层组织细胞溶解程度；将根系样品放入5 ml玻璃瓶中，加入2ml体积比为甲醛：乙酸：70vol%乙醇=1:1:18的固定液，经过脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、染色以及显微镜观察，进行观测计算皮层组织细胞溶解的面积；
（7）根据参试杉木不同无性系幼苗根系丛枝菌根真菌根系侵染率和皮层组织细胞溶解率的差异，筛选出侵染率15%以上、皮层组织细胞溶解率10%以上的杉木无性系为磷高效利用良种；
步骤（2）所述丛枝菌根真菌的菌种为根内球囊霉（Rhizophagus irregularis）；
所述步骤（2）所述丛枝菌根真菌的菌种与步骤（1）准备的栽培基质按体积比为1:10的比例混合。
2.根据权利要求1所述的一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法，其特征在于：所述步骤（1）所述盆栽装置为聚乙烯材质盆栽装置，使用前在0.1g/L KMnO4溶液中浸泡20 min进行消毒，然后取出用无菌水冲洗、晾干，备用；所述参试无性系杉木幼苗为长势均一、无病虫害的不同无性系杉木幼苗，采用0.5 wt% NaClO溶液对参试杉木根系表面消毒0.5 min，再用无菌水反复冲洗处理后备用；所述栽培基质为洗净晾干后过2 mm 网筛的河心沙与珍珠岩按体积比为3:1的比例混合，装入灭菌袋中，灭菌后自然晾干7 d后备用；灭菌的条件为121℃，0.1~0.2 MPa 高温高压灭菌30 min。
3.根据权利要求1所述的一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法，其特征在于：所述栽培基质有效磷含量低至0.12±0.02 mg/kg。
4.根据权利要求1所述的一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法，其特征在于：步骤（5）所述根系样品制片具体为：根系样品剪成0.5-1 cm的根段，放入50 ml烧杯中，用99 wt％乙醇和60 wt％乙酸按 3：1体积比混合的储存溶液固定4 h以上；除去储存液，无菌水洗涤2次；加入20 wt% KOH溶液90~96℃加热透明45 min；除去KOH，无菌水洗涤2次；加入2 wt% HCl溶液酸化30 min；除去HCl溶液，无菌水洗涤2次；加入0.05 wt% Trypanblue溶液染色10~30 min，洗去染色剂，加入脱色液脱色。
5.根据权利要求4所述的一种应用丛枝菌根真菌的杉木磷高效利用良种鉴定方法，其特征在于1级根90℃加热透明，2级根96℃加热透明；0.05 wt% Trypan blue溶液染色时1级根染色30 min，2级根染色10 min。
6.权利要求1-5任一项所述方法在磷高效利用杉木良种选育中的应用。
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