CN110183439A - 一种小檗碱-Pyridostatin偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小檗碱‑Pyridostatin偶联物及其制备方法和应用。小檗碱‑Pyridostatin偶联物中的小檗碱部分对G‑四链体具有荧光检测性，Pyridostatin化合物也具有荧光检测、选择性结合和稳定G‑四链体DNA的性能，小檗碱和Pyridostati的偶联物可以达到高的荧光检测性，同时具有选择性结合和稳定双倍体G‑四链体DNA的双重功能，小檗碱‑Pyridostatin偶联物对分子内反平行双倍体G‑四链体DNA的检测灵敏度可达0.44nM，结合常数Ka可达20μM‑1，具有较高的热稳定性。本发明的小檗碱‑Pyridostatin偶联物对肿瘤细胞具有很好的抑制活性，具有抗肿瘤作用，尤其是宫颈癌细胞、人乳腺癌和肝癌细胞。

Description

一种小檗碱-Pyridostatin偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及DNA检测技术领域，更具体地，涉及一种小檗碱-Pyridostatin 偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
G-四链体(G-quadrμplex)是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很 多富含鸟嘌呤(G)区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序 列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、 VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程 都存在调控作用。有研究表明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基 因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形 成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过 程。所以在体内或者体外试验中，能够荧光检测和特异性地结合或诱导形成G-四链体结构G-四链体结构，对于开发以G-四链体结构为靶点的同步检测和治疗 的双功能抗癌药物具有非常重要的作用。
人端粒DNA是染色体末端由DNA重复序列TTAGGG组成的双螺旋区，其 末端是含有100-200nt(核苷酸)的富G碱基的单链悬突，虽然它们大多数是趋 向于形成单倍体G-四链体，但是仍有少数趋向于形成更复杂的由TTA碱基序列 连接的双倍体或多倍体G-四链体结构。而且多倍体G-四链体的形成，仅出现在 人端粒DNA和与渐冻人症(ALS)相关的r(GGGGCC)n的RNA重复序列中。 近些年来，对双倍体或多倍体G-四链体结合剂和荧光探针的研究逐渐成为热点， 但具备同步检测和特异性结合多倍体G-四链体的结合剂报道较少。
现有技术公开的Pyridostatin化合物(Org.Biomol.Chem.2010,8,2771-2776；Org.Biomol.Chem.2012,10,6537-6546；Nature Chem.2014,6,75-80)，结构式如 下所示：
虽然具有优良的荧光识别和热力学稳定单倍体G-四链体RNA和DNA的能 力，但针对双倍体G-四链体的荧光识别和结合选择性研究，没有相关类似物报 道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有化合物对G-四链体的荧光识别和结合 选择性的缺陷和不足，提供一种小檗碱-Pyridostatin偶联物。
本发明的另一目的是提供一种小檗碱-Pyridostatin偶联物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种小檗碱-Pyridostatin偶联物在作为G-四链体结构检测探针中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种小檗碱-Pyridostatin偶联物在作为G-四链体结构特异性结合剂或/和稳定剂中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种小檗碱-Pyridostatin偶联物在在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种小檗碱-Pyridostatin偶联物，其结构式如下：
其中X为负一价阴离子。
优选地，X为对甲基苯磺酸根、F-、I-、Br-、Cl-或NO3 -。
本发明所述的小檗碱-Pyridostatin偶联物中，该化合物中的小檗碱部分可荧 光检测G-四链体，Pyridostatin化合物具有荧光检测、选择性结合和稳定G-四链 体DNA的功能，将小檗碱和-Pyridostatin偶联后的偶联物具有荧光检测和选择性 结合双倍体G-四链体DNA的双重功能。
本发明所述的小檗碱-Pyridostatin偶联物还具有抗肿瘤作用，例如宫颈癌细胞、乳腺癌、人乳腺癌细胞、肺癌和肝癌细胞。
本发明还保护一种小檗碱-Pyridostatin偶联物的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成化合物1，化合物1的结构式如下：
其中Boc表示叔丁酯；
S2.合成化合物2，化合物2的结构式如下：
其中Ts为对甲基苯磺酸；
S3.合成化合物3，化合物3的结构式如下：
X为对甲基苯磺酸 根；
S4.将化合物3进行脱Boc反应或将脱Boc反应产物通过阴离子交换树脂得 到含相应阴离子的小檗碱-Pyridostatin偶联物。
优选地，S1中所述化合物1的制备方法为：将4-羟基吡啶-2,6-二甲酸与1- 氯-N,N,2-三甲基-1-丙烯胺反应，形成酰氯，加入N-乙基二异丙基胺和4-(2- 氨基喹啉)-乙氧基氨基叔丁酯，反应得到化合物1。
更优选地，S1中4-羟基吡啶-2,6-二甲酸:1-氯-N,N,2-三甲基-1-丙烯胺:N-乙 基二异丙基胺:4-(2-氨基喹啉)-乙氧基氨基叔丁酯的摩尔比为1:1～3:1～3:1～3。
其中S1中所述反应温度为-20～0℃，反应时间0～20h，反应体系的溶剂可 以为N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈和二甲基亚砜中一种或几种。
上述S1中所述制备方法的产物还可经过纯化得到化合物1，其纯化的具体 操作为：将反应液减压除溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用二氯甲烷先进行 洗脱，至小极性杂质出完后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液进 行洗脱,收集甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和 二氯甲烷得到化合物1。
优选地，S2中所述化合物2的制备方法为：将化合物1与1,8-二(对甲基 苯磺酸)-三甘油醇醚在溶剂中混匀，反应制备得到化合物2。
更优选地，S2中化合物1与1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚的摩尔比 为1:1～12。
S2中的反应温度优选80～110℃，反应时间0～4h。
反应体系的溶剂可以为氯仿、无水丙酮、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺中一种 或几种。
优选地，反应体系中还含有碱，碱的摩尔用量为化合物1的3～10倍，其中 碱优选为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或几种。
上述S2中所述制备方法的产物还可以经过纯化得到化合物2，其纯化的具 体操作为：将反应液减压除溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用二氯甲烷先进 行洗脱，至小极性杂质出完后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:80的洗脱液 进行洗脱，收集甲醇：二氯甲烷体积比为1:80的洗脱液，将所得洗脱液除去甲 醇和二氯甲烷得到化合物2。
优选地，S3中所述化合物3的制备方法为：将化合物2和小檗红碱在溶剂 中混匀，反应得到化合物3。
更优选地，S3中所述化合物2和小檗红碱的摩尔用量比为1:1～2。
S3中反应温度优选为80～110℃，反应时间0～4h。
反应体系的溶剂可以为氯仿、无水丙酮、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺中一种 或几种。
上述S3中所述制备方法的产物还可以经过纯化得到化合物3，其纯化的具 体操作为：将反应液减压除溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用甲醇：二氯甲 烷体积比为1:60的洗脱液先进行洗脱，至化合物2和其它杂质出完后，替换为 甲醇：二氯甲烷体积比为1:15的洗脱液进行洗脱，收集甲醇：二氯甲烷体积比 为1:15的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲烷得到化合物3。
S4中的分离纯化的具体操作为：将反应液减压除溶剂，通过阴离子交换树 脂，交换得到X为F-、I-、Br-、Cl-或NO3 -的所述小檗碱-Pyridostatin偶联物。
S4中的脱Boc反应用到的试剂优选为三氟乙酸。
S4中反应体系溶剂为氯仿、乙腈和二氯甲烷中的一种或几种。
S4中反应温度优选为-10～20℃，反应时间0～4h。
小檗碱-Pyridostatin偶联物在作为G-四链体结构检测探针中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，上述G-四链体结构为双倍体G-四链体结构。
更优选地，双倍体G-四链体结构为5’-A(GGGTTA)7-G3-3’序列构成的双倍 体G-四链体结构。
小檗碱-Pyridostatin偶联物检测双倍体G-四链体结构的方法为：将待测DNA 溶液中加入小檗碱-Pyridostatin偶联物溶液，混匀，检测混合液的荧光强度
具体检测应用中，操作步骤如下：
1)测定待测DNA溶液中DNA的浓度；
2)往待测DNA溶液中加入小檗碱-Pyridostatin偶联物，混匀，检测混合液 的荧光强度；
3)将上步测得的荧光强度和所述衍生物检测双倍体G-四链体结构的标准荧 光光谱进行比对，即可判断待测DNA中是否含有双倍体G-四链体结构，并确定 具体含有哪种双倍体G-四链体结构。
其中，检测荧光强度时的激发波长为355nm，发射波长为530nm。
待测DNA溶液的溶剂为含Na+的pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液。
小檗碱-Pyridostatin偶联物溶液的溶剂为含Na+的pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液，优选Tris-HCl缓冲液含95～105mM Na+，待测DNA与小檗碱-Pyridostatin 偶联物的摩尔比为1～10:1。
若上述3)中检测的待测DNA溶液的若待测DNA溶液的荧光强度增强了至 少180倍，说明待测DNA中含有反平行双倍体G-四链体结构。
本发明的小檗碱-Pyridostatin偶联物还可以用于检测细胞中G-四链体结构， 其方法为：将细胞与所述衍生物共孵2.5～3.5h后，在倒置荧光显微镜下对细胞 进行荧光检测，若细胞产生明显的荧光，说明细胞中含有G-四链体结构。
本发明还包含小檗碱-Pyridostatin偶联物在作为G-四链体结构特异性结合剂或/和稳定剂中的应用。
本发明还保护小檗碱-Pyridostatin偶联物在在制备抗肿瘤药物中的应用。本 发明的小檗碱-Pyridostatin偶联物对肿瘤细胞具有较高的抑制活性，可以抑制宫 颈癌细胞、乳腺癌、人乳腺癌细胞、肺癌和肝癌等肿瘤细胞，尤其是宫颈癌细胞、 人乳腺癌和肝癌细胞具有很好的抑制活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种小檗碱-Pyridostatin偶联物，化合物中的小檗碱部分 荧光检测G-四链体，Pyridostatin化合物具有荧光检测和选择性结合和稳定G-四 链体DNA，两者的偶联物达到更高的荧光检测和选择性结合双倍体G-四链体 DNA的双重功能，能进入活细胞检测DNA。
(2)本发明的小檗碱-Pyridostatin偶联物对分子内反平行双倍体G-四链体 DNA的检测灵敏度可达0.44nM，结合常数Ka可达20μM-1，具有较高的热稳定 性。
(3)本发明的小檗碱-Pyridostatin偶联物对肿瘤细胞具有很好的抑制活性， 具有抗肿瘤作用，尤其是宫颈癌细胞、人乳腺癌和肝癌细胞。
附图说明
图1为探针I对不同构型DNA在紫外灯下的发光情况及荧光光谱图。
图2为探针I对反平行G2T1的灵敏度检测图。
图3各不同序列和构型的DNA滴定探针I(1.0μM)的荧光光谱和结合常 数计算图，其中(a)双倍体反平行G2T1；(b)双倍体混合型G2T1；(c)反 平行单倍体G1；(d)混合型单倍体G1；(e)c-kit1；(f)c-kit2；(g)c-myc；(h)ds DNA，实验条件：λex/λem＝355/530nm。
图4各不同构型的G-四链体DNA中含不同浓度的小檗碱-Pyridostatin偶联 物时的圆二色谱曲线图，图中曲线依次表示所述小檗碱Pyridostatin偶联物浓度 为0、5.0μM、10.0μM、20.0μM和40.0μM的圆二色谱曲线，其中(a)褪火的反 平行G2T1(5.0μM)；(b)褪火的反平行G1(5.0μM)；(c)混合型G2T1(5.0μM)； (d)褪火的混合型G1(5.0μM)；(e)未褪火的双倍体G-四链体DNA溶液(5.0μM)。
图5各不同构型G-四链体DNA中不含和所述小檗碱-Pyridostatin偶联物时 的圆二色谱与解链温度关系的曲线图，其中(a)反平行双倍体G-四链体DNA溶液 (10.0μM)；(b)混合型G1(20.0μM)；(c)c-kit1(20.0μM)；(d)c-kit2(20.0μM)； (e)c-myc(20.0μM)；(f)双链DNA溶液(5.0μM)。
图6为Hela活细胞中加入Hoechst 33342、加入探针I、细胞明场图和三者 叠加的荧光倒置显微镜细胞成像图。
图7为Hela固定细胞中加入DAPI(a、e和i)、加入探针I(b、f和i)、 Hela癌细胞明场图(c、g和k)和三者叠加(d、h和l)的荧光倒置显微镜细胞 成像图。图a～d、e～h和i～l分别代表空白癌细胞(Control)、加了DNA消 化酶的癌细胞(DNase I)和加了RNA消化酶的癌细胞(RNase A)的荧光倒置显微 镜细胞成像图。
图8为Hela固定细胞中加入固定浓度的探针1(10.0μM)和浓度不断增大的 G4-DNA结合剂BLACO19(0，5.0μM、10.0μM、20.0μM和40.0μM)时的荧 光倒置显微镜细胞成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做 任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原 料试剂。
实施例1
一种小檗碱-Pyridostatin偶联物，制备方法如下：
S1.合成化合物1：称取4-羟基吡啶-2,6-二甲酸(92mg，0.5mmol)于10mL 圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)，0℃搅拌30min后，缓慢滴 加1-氯-N,N,2-三甲基-1-丙烯胺(160mg，1.2mM)，0℃搅拌2h；再缓慢滴 加N-乙基二异丙基胺(210μL，1.2mmol)，0℃下继续搅拌2h；称取4-(2- 氨基喹啉)-乙氧基氨基叔丁酯(303mg，1mM)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)， 在0℃条件下滴加到上述反应体系中，2h后转移至室温下搅拌12h。反应结束后(TLC监测反应)，将反应液滴加到蒸馏水(200mL)中析出沉淀，高速离 心得到灰色固体，将固体物质进行硅胶柱层析，用二氯甲烷先进行洗脱，至小极 性杂质出完后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液进行洗脱,收集甲 醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲烷得到 化合物1(75mg，收率20％)；
S2.合成化合物2：称取化合物1(45mg，0.06mM)、1,8-二(对甲基苯 磺酸)-三甘油醇醚(273mg，0.6mM)、无水碳酸钾(40mg，0.3mM)于100 mL圆底烧瓶中，加入重蒸氯仿(15mL)、丙酮(15mL)和N,N-二甲基甲酰 胺(3滴)，90℃搅拌反应，2.0h后反应完全(TLC监测反应)，减压蒸馏除 溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用二氯甲烷先进行洗脱，至小极性杂质出完 后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:80的洗脱液进行洗脱,收集甲醇：二氯甲烷体积比为1:80的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲烷得到白色固体化 合物2(37mg，收率60％)；
S3.合成化合物3：称取化合物2(35mg，0.033mM)、小檗红碱(14mg， 0.04mM)于50mL圆底烧瓶中，加入氯仿(5mL)、乙腈(5mL)，100℃搅 拌反应。8h后反应完全(TLC监测反应)，减压蒸除溶剂，将固体物质进行硅 胶柱层析，用甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液先进行洗脱，至化合物2 和其它杂质出完后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:15的洗脱液进行洗脱， 收集甲醇：二氯甲烷体积比为1:15的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲 烷得到黄色固体化合物3(25mg，收率64％)；
S4.合成小檗碱-Pyridostatin偶联物：称取化合物3(20mg，0.015mM)于 25mL圆底烧瓶中，加入DCM(4.0mL)，0℃搅拌溶解后，缓慢滴加三氟乙酸 (1.0mL)，室温下搅拌反应，1h后反应完全(TLC监测反应)，减压蒸馏除 溶剂，再溶于甲醇：水体积比为1：1的溶剂中，通过阴离子交换树脂(甲醇： 水体积比为0.5～1.5：1)交换得到阴离子为氯离子的淡黄色固体小檗碱 -Pyridostatin偶联物(15mg，收率100％)。
对化合物1、化合物2、化合物3和小檗碱-Pyridostatin偶联物进行结构鉴定， 鉴定结果如下：
化合物1分子式为C39H43N7O9，分子量为753.31，ESI-MS：m/z＝752.67 ([M-H]-)，HR-MS实验值：752.3054，计算值：752.3049([M-H]-)。
上述化合物1的具体鉴定数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.96(s, 2H),11.75(bs,2H),8.24(d,J＝8.0Hz,2H),8.05(s,2H),7.93(d,J＝8.0Hz,2H), 7.79(s,2H),7.77(t,J＝7.6Hz,2H),7.50(t,J＝7.6Hz,2H),7.20(t,J＝4.8Hz,2H), 4.28(s,4H),3.55(d,J＝4.8Hz,4H),1.41(s,18H)。
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ167.4,163.9,162.6,156.3,152.9,151.4, 147.5,131.0,127.2,124.8,122.7,119.7,113.7,95.3,78.3,68.3,28.7。
化合物2分子式为C52H61N7O14S，分子量为1039.40，ESI-MS：m/z 1040.64 ([M+H]+)和1062.76([M+Na]+)，HR-MS实验值：1040.4081，计算值：1040.4070 ([M+H]+)。
上述化合物2的具体鉴定数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.35(s,2H),8.07(m,4H),7.87(s,2H),7.82(d, J＝8.0Hz,2H),7.75(s,2H),7.55(s,2H),7.39(s,2H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),5.38 (s,2H),4.36(s,6H),4.21(s,2H),3.95(s,2H),3.76(s,4H),3.69(s,2H),3.27(s,4H), 2.44(s,3H),1.53(s,18H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.9,162.9,161.9,155.9,151.8,150.1,146.4,144.8,133.0,130.3,129.8,127.9,126.7,124.4,121.8,119.3,111.9,93.7,79.7,77.2,70.9,70.8,69.2,68.8,68.5,68.1,29.6,28.4,21.6。
化合物3分子式为C71H76N8O18S，分子量为1360.50，ESI-MS：m/z＝1189.65 ([M-C7H7O3S]+)，HR-MS实验值：1189.4882，计算值：1189.4877([M-C7H7O3S]+)。
上述化合物3的具体鉴定数据如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.90(s,2H),10.05(s,1H),8.16(s,1H),8.01(d, J＝8.0Hz,2H),7.65～7.75(m,6H),7.55(s,2H),7.53(d,J＝8.8Hz,1H),7.46(d,J＝ 8.8Hz,1H),7.36(s,2H),6.97(s,1H),6.64(s,1H),5.74(s,2H),5.62(s,2H),5.15(s, 2H),4.44(s,2H),4.37(s,2H),4.25(s,4H),4.07(s,2H),4.00(s,2H),3.92(s,3H), 3.89(s,2H),3.87(s,2H),3.78(s,4H),3.22(s,2H),1.55(s,18H)。
13CNMR(100MHz,CDCl3)δ167.8,162.7,161.3,156.1,151.5,150.2,150.1, 149.1,147.7,146.4,146.0,144.1,143.5,138.7,137.3,132.8,130.3,130.2,128.3, 126.6,125.9,125.2,124.3,123.2,121.8,119.8,119.6,119.1,111.5,108.0,104.9, 101.9,93.3,79.6,73.5,70.7,70.3,70.2,69.0,68.6,68.0,56.6,55.8,39.7,29.6,28.5, 21.2。
小檗碱-Pyridostatin偶联物分子式为C54H53Cl1N8O11，分子量为1024.35， ESI-MS：m/z＝989.65([M-Cl]+)和495.94([M+H-Cl]2+)，HR-MS实验值：989.3832 和495.1956，计算值：989.3828([M-Cl]+)和495.1951([M+H-Cl]2+)。
上述化合物小檗碱-Pyridostatin偶联物的具体鉴定数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.94(s,2H),9.72(s,1H),8.84(s,1H),8.67 (s,2H),8.63(s,2H),8.50(d,J＝8.0Hz,2H),8.04(s,1H),7.95(d,J＝8.0Hz,2H), 7.80(t,J＝8.0Hz,2H),7.73(s,1H),7.60(s,1H),7.55(t,J＝7.2Hz,2H),7.00(s, 1H),6.03(s,2H),4.92(s,2H),4.55(s,4H),4.36(s,4H),4.04(s,3H),3.83(s,4H), 3.69(s,4H),3.45(s,4H),3.20(s,2H)。
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ167.4,163.5,163.4,162.2,152.6,151.1, 150.9,150.1,147.9,147.3,145.6,142.9,137.6,133.2,131.2,130.7,127.0,124.9, 124.0,123.3,122.2,120.6,119.4,112.3,108.7,105.7,102.4,95.2,73.5,70.4,69.9, 69.8,68.8,68.7,65.5,57.4,55.8,38.5,26.77。
实施例2
将实施例1所得小檗碱-Pyridostatin偶联物分别用阴离子交换树脂对其中的Cl-进行离子交换，从而制得被F-、Br-、NO3-取代Cl-的小檗碱-Pyridostatin偶联 物。
实施例3实施例1的小檗碱-Pyridostatin偶联物的活性检测
1、样品制备
DNA样品：DNA样品购自上海生物生工技术有限公司，将适量DNA溶于 相应的缓冲溶液，95℃加热10min后缓慢降至室温，4℃孵育过夜，最后在 SMA1000上测量260nm处的吸光度，根据朗伯比尔定律计算DNA的浓度。
DNA样品包括：
dsDNA：5’-CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG-3’+
5’-GTTAGCCTAGCTTAAGC TAGGCTAAC-3’，双链DNA；
CT DNA：双链线性DNA；
c-kit 1：5’-(CG3)2(CG)2(AG3)2T-3’，分子内平行单倍体G-四链体DNA；
c-kit 2:5’-G3CG3(CG)2(AG3)2G-3’，分子内平行单倍体G-四链体DNA；
c-myc:5’-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3’，分子内平行单倍体G-四 链体DNA；
G1(K+)：5’-A(G3TTA)3G3-3’，分子内混合型单倍体G-四链体DNA；
G1(Na+)：5’-A(G3TTA)3G3-3’，分子内反平行单倍体G-四链体DNA；
G2T1(K+)：5’-A(GGGTTA)7G3-3’，分子内混合型双倍体G-四链体DNA；
G2T1(Na+)：5’-A(GGGTTA)7G3-3’，分子内反平行双倍体G-四链体DNA。
小檗碱-Pyridostatin偶联物的制备：
将实施例1～2所制备的小檗碱-Pyridostatin偶联物溶解在DMSO中得到母液， 该母液中小檗碱-Pyridostatin偶联物的浓度为10.0mM，用相应缓冲溶液溶解， 得到小檗碱-Pyridostatin偶联物溶液。
2、检测
2.1.荧光识别
将探针I(实施例1的小檗碱-Pyridostatin偶联物)溶液与待测样品混合，混 合后探针I的浓度为1.0μM，样品DNA的浓度为4.0μM，将混合液放在紫外灯 下，肉眼观察。不同构型DNA样品加入探针I中荧光光谱图和荧光颜色变化情 况如图1所示，从中可以看出，不同构型DNA样品加入探针I的在紫外光下的 荧光强度各不相同，其中混合型G2T1、c-kit 1、c-kit 2、c-myc、ds-DNA和CT DNA 与空白对照组(Blank)一样，几乎没有荧光；而含有单倍体G-四链体结构的 G1(K+)和G1(Na+)组有较弱的荧光，不明显；而含有反平行双倍体G-四链体结构的G2T1具有明显的黄色荧光，荧光增强了至少180倍。
上述结果说明本发明荧光探针I可以特异性检测反平行双倍体G-四链体结 构，若待测样品加入探针I后，其荧光增加至少180倍，即可判定该DNA中含 有反平行双倍体G-四链体结构。
2.2.探针I对G-四链体DNA结构的灵敏度检测
检测限实验在荧光仪上测试。
取1.0μM探针I溶液，以355nm作为激发波长测定溶液的荧光光谱，激发 和发射缝宽均为10mm，扫描范围为365-700nm，连续测量5次溶液的吸光度 值，然后算出标准差δ。根据荧光滴定的数据，选取前一段数据进行直线拟合， 检测限是3δ/slope(slope为直线的斜率)。
实验结果如图2所示，计算结果显示探针I对反平行双倍体G2T1检测灵敏 度为0.44nM，说明探针I对反平行双倍体G2T1具有高的荧光检测灵敏度。
2.3.荧光光谱测定确定结合能力
探针I的浓度为1.0μM，往探针I溶液里滴加不同的待测DNA样品溶液， 吹打均匀后，用荧光光谱测定体系的荧光发射，将等色点355nm设定为激发波 长。图3为1.0μM探针I加入不同浓度(0～5.0μM)不同构型的DNA中时的 荧光光谱图和结合常数计算图，图3进一步证实了图1的结果：混合型G2T1、 c-kit 1、c-kit 2、c-myc、ds-DNA和CT DNA荧光强度没有明显增强；而含有单 倍体G-四链体结构的G1(K+)和G1(Na+)组有较弱的荧光增强；而含有反平 行双倍体G-四链体结构的G2T1荧光增强了至少180倍。
进一步的，在图3的荧光变化光谱的基础上，根据下式：
公式中F和F0分别为探针I在存在和不存在DNA时530nm处的荧光强度；常 数P＝Fmax/F0，Fmax是加入DNA后的饱和荧光强度；M＝1/(Ka·C)，Ka为结合 常数，C为探针I的浓度；x＝nCDNA/C，CDNA为DNA浓度，n为可调整的 常数。以F/F0对CDNA进行线性拟合，得到结合常数Ka，实验结果如由图3和 表1。
表1探针I对各DNA的结合常数Ka(μM-1)。
上述实验结果说明：小檗碱-Pyridostatin偶联物I对反平行双倍体G-四链体 结合能力最强，是混合型G2T1、单倍体G-四链体和双链DNA的20倍左右。
实施例3用CD光谱检测本发明所述小檗碱-Pyridostatin偶联物对G-四链体 DNA构型的影响
将人端粒寡聚核苷酸G2T1溶于10mM Tris-HCl，pH 7.0缓冲溶液中，得到 5.0μM的褪火的反平行G2T1溶液，在CD光谱仪上检测G2T1的CD光谱的变 化，比色皿宽1mm，反应液为300μL，扫描范围为200-500nm；向含有5.0μM G2T1溶液中，分别不加和加入1.5μL、3.0μL、6.0μL和12.0μL的1mM小檗 碱-Pyridostatin偶联物溶液，使小檗碱-Pyridostatin偶联物浓度分别为0、5.0μM、 10.0μM、20.0μM和40.0μM，测定五种混合溶液的CD光谱，最后上述五种溶 液的CD光谱图用Origin 8.0软件处理。
实验结果如图5a中的所示，由图5a可以看出，随着小檗碱-Pyridostatin偶 联物浓度的不断增大，反平行双倍体G-四链体的特征CD信号峰265nm处的负 峰上升，295nm处的正峰下降，但并没有出现新的峰，说明小檗碱-Pyridostatin 偶联物不改变反平行双倍体G-四链体结构。相同的方法测试了小檗碱 -Pyridostatin偶联物对混合型G2T1、反平行G1、混合型G1和为褪火G2T1的 DNA序列的构型的影响。
由图5b可以看出：随着小檗碱-Pyridostatin偶联物浓度的不断增大，混合型 双倍体G-四链体的特征CD信号峰265nm处的正肩峰上升，295nm处的正峰下 降，说明小檗碱-Pyridostatin偶联物改变混合型双倍体G-四链体结构，使DNA 构型从反平行向平行结构转化。
由图5c可以看出：随着小檗碱-Pyridostatin偶联物浓度的不断增大，反平行 单倍体G1的特征CD信号峰265nm处的负峰消失，295nm处的正峰下降，同 时在250nm处出现了一个新峰，说明小檗碱-Pyridostatin偶联物改变了反平行 G1结构。
由图5d可以看出：随着小檗碱-Pyridostatin偶联物浓度的不断增大，混合型 单倍体G1的特征CD信号峰265nm处的肩峰和295nm处的正峰均下降，但没 有新峰出现，说明小檗碱-Pyridostatin偶联物不改变了混合型G1结构。
由图5e可以看出：随着小檗碱-Pyridostatin偶联物浓度的不断增大，未褪火 的G2T1的DNA序列的DNA单链的250nm处的CD信号峰逐渐下降，同时出 现265nm处的负峰和295nm处的正峰，此为反平行G-四链体的CD信号峰， 说明小檗碱-Pyridostatin偶联物可诱导形成反平行G-四链体。
上述结果说明：小檗碱-Pyridostatin偶联物不改变反平行G2T1的构型，可 诱导形成反平行G-四链体。
实施例4用CD-melting实验检验本发明小檗碱-Pyridostatin偶联物对反平行双倍体G-四链体DNA的热稳定性
将寡聚核苷酸G2T1用10mM Tris-HCl和100mM NaCl(pH 7.0)的缓冲溶 液稀释到100μM，95℃加热10min后缓慢降至室温，4℃孵育过夜。CD-melting 实验中，缓冲液中含有300μL 10.0μM G2T1，采集20℃～95℃温度范围内295 nm处的CD值，Origin8.0软件处理数据，求出G2T1 DNA本身的熔点TDNA；向 上述浓度的DNA溶液中加入3.0μL、6.0μL和9.0μL的1mM小檗碱-Pyridostatin 偶联物溶液，使小檗碱-Pyridostatin偶联物浓度分别为0、10.0μM、20.0μM和 30.0μM，采集溶液在20～95℃温度范围内295nm处的CD值，Origin 8.0软件处理数据，求出加入小檗碱-Pyridostatin偶联物后DNA的熔点Tm，根据TDNA和 Tm的值，计算DNA熔解温度的变化值ΔTm＝Tm-TDNA。
其实验结果如图6和表2，随着小檗碱-Pyridostatin偶联物的加入和浓度的 不断增大，其ΔTm呈浓度依赖关系，ΔTm最大可达到20℃，可以判断本发明小 檗碱-Pyridostatin二聚体偶联物对双倍体G-四链体DNA具优良的热稳定性。
同样的方法，检测了小檗碱-Pyridostatin二聚体偶联物对混合型G1、c-kit1、 c-kit2、c-myc和ds DNA的热力学稳定性。其实验结果如图6和表2，相对于反 平行G2T1，小檗碱-Pyridostatin二聚体偶联物对这些DNA都显示了弱的热力学 稳定性。
由上述实验结果说明：相对于对单倍体G1、c-kit1、c-kit2、c-myc和ds DNA， 小檗碱-Pyridostatin偶联物对反平行双倍体G-四链体DNA显示了更高的热稳定 性。
表2探针I对各DNA的热力学稳定性△Tm(℃)。
实施例5、探针I是否能进入活细胞检测DNA
活细胞染色实验：将3×105个Hela细胞接种于3cm的培养皿，在37℃， 5％CO2的恒温培养箱中孵育过夜，弃去培养基并用PBS洗2次；细胞用2mL 含10μM探针I的培养基孵育12h，弃去含化合物的培养基并用PBS洗3次； 细胞再用2mL含5μg/mL Hoechst 33342的培养基孵育20min，弃去含Hoechst 33342的培养基并用PBS洗3次，加入2mL培养基，使用倒置荧光显微镜(Axio Observer,Germany)进行拍照观察，20倍目镜，实验重复3次。
实验结果如图7所示，说明探针I可以染色Hela活细胞，也能清晰地看到 探针I对细胞核仁染色。
实施例6、探针I对固定细胞内DNA的检测
DNA消化酶和RNA消化酶实验：将2×105个Hela细胞接种于六孔板，在 37℃，5％CO2的恒温培养箱中孵育过夜，弃去培养基并用PBS洗2次；细胞用 1mL 4％多聚甲醛的PBS溶液固定15min，弃去固定液并用PBS洗3次；细胞 再用1mL 0.3％Triton X-100的PBS溶液处理30min来提高细胞膜的通透性，弃 去含Triton X-100的PBS溶液并用PBS洗3次；接着，细胞分别用1mL 100 units/mL RNase-free DNase I的PBS溶液、1mL 100units/mL DNase andProtease-free RNase A的PBS溶液或者1mL PBS溶液孵化3h，弃去溶液并用PBS 洗3次；最后，细胞用1mL含5μM探针I的PBS溶液染色1h，弃去含化合 物的溶液并用PBS洗3次；细胞再用1mL含5μg/mL DAPI的PBS溶液作用30 min，弃去含DAPI的溶液并用PBS洗3次，加入1mLPBS溶液，使用倒置荧 光显微镜进行拍照观察，20倍目镜，实验重复3次。
实验结果如图7所示，其中图8分别为Hela宫颈癌细胞中加DAPI、加探针 I、明场和前三个叠加的倒置荧光细胞成像图，这个共染色实验说明探针I对细 胞具有显著的荧光显色反应，同时这个荧光显色反应也发生在整个细胞核，整个 分子结构可以进入细胞核。由于细胞核中的细胞仁是rDNA转录为rRNA的区域， 即为rDNA中的G-四链体存在区域，为了进一步确认探针I荧光显色的靶点是 否是细胞仁中的DNA，进一步进行了如下的脱氧核糖核酸(DNase I)和核糖核 酸(RNaseA)消化实验。
检测结果如图7所示，其中图8为Hela癌细胞经DNase I处理过的加DAPI、 加探针I、明场和前三个图谱叠加的倒置荧光细胞成像图，从图可以看出：由于 DNase I的加入，整个细胞中的荧光显色消失，说明探针I可能对细胞中的DNA 进行荧光检测，几乎不对细胞中的RNA荧光检测。
图7i～l为Hela癌细胞经RNase A消化酶处理过的加DAPI、加探针I、明场 和前三个图谱叠加的共聚焦荧光成像图，从图7i～l可以看出：探针I可以进入细 胞核，甚至细胞核仁，产生明显的荧光响应，基本与加入DAPI的图谱重叠，上 述实验结果说明：探针I确实部分进入了细胞仁，与细胞仁中的rDNA发生结合 而发生荧光显色反应。
由此得到如下结论：探针I可进入细胞，甚至是细胞核，对DNA进行荧光 检测。
实施例7 BRACO 19竞争实验验证探针I是否能检测细胞核内G4-DNA
将2×105个Hela细胞接种于六孔板，在37℃,5％CO2的恒温培养箱中孵育 过夜，弃去培养基并用PBS洗2次；细胞用1mL 4％多聚甲醛的PBS溶液固定 15min，弃去固定液并用PBS洗3次；接着细胞用1mL含10μM探针I的PBS 溶液染色1h，弃去染液并用PBS洗3次；最后加入含不同浓度的BRACO 19(经 典的G4-DNA结合剂，0～40μM)的PBS溶液作用1h，弃去溶液并用PBS洗3 次，加入1mL PBS溶液，使用倒置荧光显微镜进行拍照观察，20倍目镜，实验 重复3次。
实验结果如图8所示，结果说明：随着经典的G4-DNA结合剂BRACO 19 浓度不断增大，在细胞核和核仁区域的荧光逐渐减弱，说明BRACO 19参与了 G4-DNA的竞争结合，以此说明探针I是与细胞核甚至核仁内的G4-DNA结合的。
实施例8、抗肿瘤活性
选择实施例1～2制备的化合物，采用MTT法，对五种肿瘤细胞Hela(宫颈 癌细胞)、MCF7(乳腺癌)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、A549(肺癌)、 HepG2(肝癌)和人正常肝细胞L02进行了抗肿瘤活性测试，其IC50值如表3 所示。实验结果显示：实施例1～2制备的化合物具有抗肿瘤活性，特别是对Hela (宫颈癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)和HepG2(肝癌)显示较高 的细胞抑制活性，但对正常干细胞毒性较大。
表3小檗碱-Pyridostatin偶联物抗肿瘤活性的IC50值(96h)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非 是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明 的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施 方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进 等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小檗碱-Pyridostatin偶联物，其特征在于，其结构式如下：
其中X为负一价阴离子。
2.如权利要求1所示小檗碱-Pyridostatin偶联物，其特征在于，X为对甲基苯磺酸根、F-、I-、Br-、Cl-或NO3 -。
3.权利要求1或2所述小檗碱-Pyridostatin偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.合成化合物1，化合物1的结构式如下：
其中Boc表示叔丁酯；
S2.合成化合物2，化合物2的结构式如下：
其中Ts为对甲基苯磺酸；
S3.合成化合物3，化合物3的结构式如下：
X为对甲基苯磺酸根；
S4.将化合物3进行脱Boc反应或将脱Boc反应产物通过阴离子交换树脂得到含相应阴离子的小檗碱-Pyridostatin偶联物。
4.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，S1中所述化合物1的制备方法为：将4-羟基吡啶-2,6-二甲酸与1-氯-N,N,2-三甲基-1-丙烯胺反应，形成酰氯，加入N-乙基二异丙基胺和4-(2-氨基喹啉)-乙氧基氨基叔丁酯，反应得到化合物1。
5.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，S1中4-羟基吡啶-2,6-二甲酸:1-氯-N,N,2-三甲基-1-丙烯胺:N-乙基二异丙基胺:4-(2-氨基喹啉)-乙氧基氨基叔丁酯的摩尔比为1:1～3:1～3:1～3。
6.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，S2中所述化合物2的制备方法为：将化合物1与1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚在溶剂中混匀，反应制备得到化合物2。
7.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，S3中所述化合物3的制备方法为：将化合物2和小檗红碱在溶剂中混匀，反应得到化合物3。
8.权利要求1或2所述小檗碱-Pyridostatin偶联物在作为G-四链体结构检测探针中的应用。
9.权利要求1或2所述小檗碱-Pyridostatin偶联物在作为G-四链体结构特异性结合剂或/和稳定剂中的应用。
10.权利要求1或2所述小檗碱-Pyridostatin偶联物在在制备抗肿瘤药物中的应用。
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