CN110179783A - 木兰脂素及对ddit3基因的调控在防治动脉粥样硬化中的应用 - Google Patents

木兰脂素及对ddit3基因的调控在防治动脉粥样硬化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种木兰脂素在治疗动脉粥样硬化药物中的应用，以及对DDIT3基因的调控在防治动脉粥样硬化中的应用，涉及木兰脂素对棕榈酸致血管内皮细胞损伤的改善作用，并探讨其作用机制。本发明采用HUVEC进行实验，通过MTT法测定木兰脂素对棕榈酸处理的HUVEC血管内皮细胞活性的影响，并提取细胞总RNA，用Affymetrix U4302.0基因芯片进行标记杂交实验，RMA法对Affyemtrix基因芯片的扫描结果进行分析，筛选出差异基因，随后采用实时定量荧光PCR法对表达的差异基因进行验证。本发明结果证实，木兰脂素能下调DDIT3基因表达，对棕榈酸损伤的血管内皮细胞具有明显的保护作用。

Description

木兰脂素及对DDIT3基因的调控在防治动脉粥样硬化中的 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种木兰脂素单体，木兰脂素在制备预防或治疗动脉粥样硬化药物和保健食品中的用途；同时涉及木兰脂素对DDIT3基因的调控在防治动脉粥样硬化中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化是一种多因素的动脉疾病。其特征是动脉壁增厚，动脉管腔变窄，最终导致供血不足和缺血。这些疾病在主要器官中最为突出，在这些器官中，血液供应对正常功能至关重要。例如，冠状动脉很容易发生动脉粥样硬化。冠状动脉管腔狭窄或阻塞会导致心肌梗塞，导致心脏病发作。在高风险人群中，大脑中动脉容易发生动脉粥样硬化，导致中风。动脉管腔直径的减小限制了血液的通过量，从而在心输出量保持正常的情况下增加了对血流的阻力，导致血压升高，这是高血压的一个原因。
动脉粥样硬化是心血管疾病的主要形式。根据世界卫生组织（世卫组织）的一份报告，动脉粥样硬化疾病，包括缺血性心脏病和脑血管病，在心血管疾病中占很大比例的死亡率。2014年，42%的心血管死亡是由心脏病发作引起的，36%是由中风引起的。心血管疾病的各种形式是本世纪疾病的主要负担。在过去的十年里，心血管疾病一直是全世界死亡的主要原因，其次是传染病和癌症。2014年，心血管疾病共造成1730万人死亡，约占全世界死亡人数的31.5%。预计到2030年，心血管疾病死亡人数将增至2300万。世卫组织关于死亡原因的详细分类报告表明，缺血性心脏病和脑血管病是全世界死亡的主要原因。前者占总死亡人数的12.2%，后者占总死亡人数的9.7%。据估计，这种趋势可能会持续到2030年。在香港，过去十年中，缺血性心脏病和脑血管疾病分别是癌症的第二个和第四个主要死亡原因。由于世界面临如此严峻的疾病形势，迫切需要寻求更好的心血管疾病（如动脉粥样硬化）的预防和治疗方法。
近年来越来越多的研究证实，内质网应激与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。已知的一些心血管疾病的独立危险因子，如同型半胱氨酸、肥胖和细胞内游离胆固醇的积聚均能引发内质网应激（ERS），而内质网应激则可能通过增加细胞内脂质的积聚，激活炎症反应通路和诱导细胞凋亡而促进动脉粥样硬化的发生发展。内质网应激反应通路的激活可能是动脉粥样硬化病理过程中的共同发病机制，而内质网应激反应通路中的关键因子也可能成为动脉粥样硬化治疗的新靶点。
激活转录因子（activating transcription factor 3，DDIT3）是亮氨酸拉链结构的活化转录因子，属于cAMP反应原件结合（cAMP-responsive element-binding，CREB）转录因子家族之一，通过其碱性亮氨酸拉链结构域与ATF/CREB 顺式作用元件结合调控基因表达。研究表明 DDIT3是一种应激反应基因，可被一系列细胞应激信号诱导，如DNA 损伤、氧化应激、细胞损伤以及内质网应激。是联系内质网应激与细胞凋亡的重要中间信号分子。内质网应激反应诱导DDIT3基因的表达，可引发内皮细胞凋亡而致内皮功能损伤，引发血管内皮细胞和血管平滑肌的凋亡致细胞残骸沉积在血管，从而促进动脉粥样硬化的发生发展。ERS被认为是多种疾病的病理机制，特别与动脉粥样硬化性疾病密切相关。ERS不仅能影响粥样硬化的危险因素，并且能从血管壁层面影响细胞生物过程。特别是ERS既能够引起巨噬细胞凋亡也有可能引起内皮细胞凋亡。
目前，对动脉粥样硬化尚无一种很有效的防治药物和方法。抗动脉粥样硬化研究的主要方向集中在通过调脂、抗氧化、抗血小板聚集、抑制平滑肌细胞增殖、保护内皮功能等方法抑制斑块增长，通过抗炎、抑制细胞因子表达、阻止基质降解、抗细胞凋亡等稳定斑块。有些药物在降脂和预防斑块破裂上显示较好作用，但其副作用也不可小视。中医药治疗动脉粥样硬化的基础主要依靠中药。从长期实践来看，丹参、葛根、当归、灵芝、大蒜、银杏等中草药对动脉粥样硬化有较好的治疗作用。越来越多的证据表明，草药的治疗价值，尽管其基本机制尚未完全了解。草药代表着一个有待发现的新大陆，对于传统药物难以治疗的疾病患者来说，它是新的药物发现和新希望的宝贵来源。
近几年的研究显示，木兰脂素具有降压、抑菌、抗炎、抗过敏作用等多种药理作用。由于目前对于木兰脂素抗动脉粥样硬化的研究，多选用不同植物来源的木兰脂素提取混合物，从单体成分获得的数据甚少，从而决定了现今已有研究结果的不确定性，同时这些研究较少深入到对细胞及亚细胞活性物质表达及机制的水平。运用分子细胞生物学研究万法和新技术手段对木兰脂素单体的抗动脉粥样硬化作用及其机理加以阐述和证明，将有助于针对该成分的药物开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木兰脂素在制备治疗或预防动脉粥样硬化药物中的用途，以及调控DDIT3基因的表达在制备治疗或预防动脉粥样硬化药物中的应用，探讨木兰脂素改善棕榈酸（PAL）致人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤的作用，并探讨其作用机制，即探讨木兰脂素可在制备治疗或预防动脉粥样硬化发生发展的药物中应用。
本发明采用HUVEC（来源于北京中国科学院细胞库）进行实验，通过噻唑蓝（MTT）法测定木兰脂素对PAL处理的HUVEC活性的影响。并提取细胞总RNA，用Affymetrix HumanU430 2.0基因芯片（美国Affymetrix公司）进行标记杂交实验，RMA（Robust multiarrayanalysis）法对Affyemtrix基因芯片的扫描结果进行分析，筛选出差异基因，随后采用实时定量PCR法对表达的差异基因进行验证，具体探讨木兰脂素的作用机制。
本发明技术方案具体内容如下：
A.木兰脂素对人类血管内皮细胞无明显毒副作用；
B.木兰脂素对HUVEC的作用：将培养的HUVEC接种于96孔板，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为6组，即空白对照组、30、60、90、120、150μmol/L木兰脂素组，每组重复6孔，分别加以0、30、60、90、120、150μmol/L木兰脂素处理，置于37℃、5％CO2 培养箱中培养12小时后，以3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT）法检测细胞的存活率，倒置显微镜观察细胞的形态。
C.木兰脂素对棕榈酸致HUVEC损伤的改善作用：将培养的HUVEC接种于96孔板，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为6组，即空白对照组、30、60、90、120、150μmol/L木兰脂素组，每组重复6孔，实验中先以0、30、60、90、120、150μmol/L浓度的木兰脂素预处理细胞2小时，然后加入PAL（终浓度100μmol/L），空白对照组用加入1%白蛋白代替PAL和木兰脂素，置于37℃、5％CO2培养箱中共同孵育12小时后，以倒置显微镜观察细胞的形态，MTT法检测细胞的存活率。
D.木兰脂素对PAL处理HUVEC基因表达谱的作用：将培养的HUVEC接种于75ml培养瓶中，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为3组，即①对照组：DMEM高糖培养基常规培养细胞（含1%白蛋白）；②PAL组：PAL终浓度为100μmol/L；③木兰脂素+PAL组：先用60μmol/L的木兰脂素培养细胞1小时，然后加入终浓度为100μmol/L的PAL。每组重复3次，各组细胞继续培养12小时后收获细胞，分别提取纯化各组细胞总RNA，利用Affymetrix HumanU430 2.0基因芯片进行标记杂交实验，RMA（Robust multiarray analysis）法对Affyemtrix基因芯片的扫描结果进行分析，筛选出差异基因。
E.木兰脂素对PAL处理HUVEC DDIT3基因表达的作用：将培养的HUVEC接种于75ml培养瓶中，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为3组，即①对照组：DMEM高糖培养基常规培养细胞（含1%白蛋白）；②PAL组：PAL终浓度为100μmol/L；③木兰脂素+PAL组：先用60μmol/L的木兰脂素培养细胞1小时，然后加入终浓度为100μmol/L的PAL。每组重复3次，各组细胞继续培养12小时后收获细胞，分别提取纯化各组细胞总RNA，用实时定量PCR法对基因芯片筛选出的差异基因DDIT3的表达进行检测。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、木兰脂素为一种木兰脂素的单体，化学结构清楚，研究证实对人血管内皮细胞无明显毒副作用；
2、本发明表明，当木兰脂素浓度为0、30、60、90、120μmol/L时，HUVEC呈鹅卵石形，细胞生长状态良好，MTT结果显示细胞活力与正常对照组没有显著差异。说明木兰脂素浓度在0～120μmol/L范围内为安全浓度；
3、本发明表明，木兰脂素浓度在0～120μmol/L范围内均可改善PAL对HUVEC的损伤作用，且其改善作用有剂量依赖性；
4、本发明表明，木兰脂素主要保护了PAL对脂质内膜的破坏，增强了细胞增殖能力和组织结构的再形成能力；
5、本发明表明，木兰脂素能降低PAL导致的内质网应激关键DDIT3蛋白基因的高表达，减轻血清游离脂肪酸导致的内质网应激反应，从而发挥其抗动脉粥样硬化作用。
附图说明
图1表示不同浓度木兰脂素作用于HUVEC血管内皮细胞12小时后细胞活力比较。*：与对照组比较，P＜0.05；
图2表示不同浓度木兰脂素对棕榈酸处理的HUVEC血管内皮细胞活力的影响。*：与对照组比较，P＜0.05；
图3表示显微镜下观察120μmol/L木兰脂素对棕榈酸处理HUVEC血管内皮细胞的形态（×500）；
图4表示DDIT3基因的实时灾光定量结果图；
图5表示定量PCR法检测各组细胞中DDIT3基因的表达水平。
具体实施方式
本发明实施例1：木兰脂素对HUVEC的作用
1 实验材料
1.1 实验药物
木兰脂素：购于成都德思特生物技术有限公司，目录号DM0041，CAS号31008-18-1，英文名magnolin，分子式C23H28O7 ，分子量416.46，化学结构如下所示：
1.2 实验对象
HUVEC：即人脐静脉内皮细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所（编号：3111C0001CCC 000475），经短串联重复序列（STR）鉴定和数据分析，符合HUVEC（ATCC® CRL-2922）的STR特征（广州凯普生物科技有限公司）。
1.3 试剂
3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT）购自北京酷来搏科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自索莱宝生物技术公司。
1.4 仪器
二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司；生物安全柜购自海尔医学设备公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；酶标仪购自美国Bio-Tek公司。
2 实验方法
2.1 HUVEC的培养
正常生长的HUVEC培养于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件为37℃、5％CO2，接种密度为1.2×105/ml，每3天传代一次。
2.2 分组及给药方法
采用2% FBS DMEM高糖培养基依次稀释木兰脂素。常规培养HUVEC，调整细胞密度为1×105/ml，然后均匀接种于无菌96孔培养板中，37℃、5％CO2培养2小时，待细胞贴壁后分为：①空白对照组：2% FBS血清培养基培养；②木兰脂素组：木兰脂素终浓度分别为30、60、90、120、150μmol/L。每组重复8孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12小时后进行检测。
2.3 MTT法
当96孔细胞培养板内对照组和木兰脂素组细胞的孵育时间到达12小时小时后，每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml），在细胞培养箱内继续孵育4小时，然后每孔加入100ul MTT三联溶解液，在37℃避光孵育8小时，再振荡混匀后，使用酶标仪测定OD值（540nm）。细胞活性分析公式为：
2.4 观测的指标
（1）倒置显微镜观察细胞形态改变
（2）MTT法检测细胞活性
2.5 数据处理
实验数据（计量资料）采用平均值±标准差（±s）表示，组间数据分析采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05为显著性差异。
3 实验结果
倒置显微镜观察显示，正常的HUVEC呈鹅卵石形贴壁生长。当木兰脂素浓度为30、60、90、120μmol/L时，细胞仍呈鹅卵石形，细胞生长状态良好。当木兰脂素浓度达150μmol/L时，出现部分细胞脱落、漂浮。
MTT实验结果（图1）显示，当木兰脂素浓度为30、60、90、120μmol/L时，细胞活力与正常对照组无明显差异。当木兰脂素浓度达150μmol/L时，细胞活力与正常对照组相比明显下降。
以上实验结果表明，木兰脂素浓度在0～120μmol/L范围内为安全浓度。
本发明实施例2：木兰脂素对PAL致HUVEC损伤的改善作用
1 实验材料
1.1 实验药物
木兰脂素：同具体实施例1。
1.2 实验对象
HUVEC：同具体实施例1。
1.3 试剂
PAL和DMSO购自美国sigma公司，MTT购自美国Fluka公司，DMEM高糖培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝生命科学技术公司。
1.4 仪器
同具体实施例1。
2 实验方法：
2.1 HUVEC的培养
同具体实施例1。
2.2 分组及给药方法
采用2% FBS DMEM高糖培养基依次稀释木兰脂素。常规培养HUVEC，调整细胞密度为1×105/ml，然后均匀接种于无菌96孔培养板中，37℃、5％CO2 培养2小时，待细胞贴壁后分为：①空白对照组：无血清培养基常规培养；②PAL组： PAL终浓度为100μmol/L。③木兰脂素+PAL组：分别用安全浓度为30、60、90、120μmol/L 的木兰脂素培养细胞1小时，然后加入终浓度为100μmol/L的PAL继续培养。每组重复6孔，置于37℃、5％CO2 培养箱中培养24小时后进行检测。
2.3 MTT法
同具体实施例1。
2.4 观测的指标
（1）倒置显微镜观察细胞形态改变。
（2）MTT法检测细胞活力
2.5数据处理
数据以±s表示，多组均数进行方差齐性检验和单因素方差分析，组间数据分析采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05为显著性差异。。
3实验结果
MTT实验结果（图2）显示，100μmol/L的PAL能明显降低细胞活力，而不同安全浓度的木兰脂素（30、60、90、120μmol/L）均能明显改善PAL对细胞的损伤，提高细胞活力。
图3显示的是倒置显微镜下观察的正常对照、100μmol/L的PAL及木兰脂素浓度为120μmol/L是细胞的生长状况图。
以上实验结果表明，木兰脂素可改善PAL对HUVEC的损伤，且浓度没有剂量依赖性。
本发明实施例3：木兰脂素对PAL处理HUVEC基因表达谱的作用
1 实验材料
1.1实验药物
木兰脂素：同具体实施例1。
1.2 实验对象
HUVEC：同具体实施例1。
1.3 试剂
MTT购自北京酷来搏科技有限公司；Pal、DMSO购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝生命科学技术公司；UltrapureRNA Kit购自康为世纪生物科技有限公司；AffymetrixHuman U4302.0基因芯片来源于美国Affymetrix公司；逆转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；其它生化试剂购自大连美仑生物技术有限公司。
1.4 仪器
二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司；生物安全柜购自海尔医学设备公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；酶标仪购自美国Bio-Tek公司。
2 实验方法：
2.1 HUVEC的培养
同具体实施例1。
2.2 分组及给药方法
常规培养HUVEC，调整细胞密度为1×107个/L，然后均匀接种于无菌60ml 培养瓶中，37℃、5％CO2 培养24小时，使细胞生长成良好单层。实验开始前用等体积无血清培养基静止培养24小时使之同步化，随后随机分为：①空白对照组：2% FBS血清培养基培养；②PAL组：PAL终浓度为100μmol/L。③木兰脂素+PAL组：先用60μmol/L的木兰脂素培养细胞1小时，然后加入终浓度为100μmol/L的PAL继续培养。每组重复3次，置于37℃、5％CO2 培养箱中继续培养24小时后收获细胞供检测。
2.3 RNA的提取及检测
取2×106 细胞加入1ml TRIZOL，室温放置10分钟充分裂解，然后加入200μl的氯仿，旋涡混匀15秒，室温放置1分钟，4℃，13000g离心20分钟，取上层水相加入等体积70%乙醇，轻轻混匀，转入提取柱，分别用试剂盒的Buffer A和Buffer B，洗涤提取柱；13000g离心2分钟，彻底去除残留Buffer，15～30℃放置5分钟，然后在提取柱中央点入40μl无Rnase超纯水，15～30℃放置1分钟；13000g离心1分钟，用分光光度计分析RNA浓度。
2.4 基因芯片和分析方法
使用Affymetrix U4302.0基因芯片进行分析，每个样品重复检测3次，样品分组及作用如下：
分组 作用
空白对照组 正常功能
PAL组 游离脂肪酸损伤模型
木兰脂素+PAL组 木兰脂素对细胞损伤的干预
应用RMA（Robust multiarray analysis）对Affyemtrix基因芯片的cel格式文件进行数据预处理，包括通过探针邻近区域背景的加权平均对每个探针背景校正，去除信号响应值为P的基因占基因总数比例低于50％的样本，对校正后的PM对数转换，估计PM对数转换后的均值，而后对均值进行指数化，对指数化后的均值去除极大极小值后，进行标准化。经过数据预处理后，基于随机方差模型的分析木兰脂素+PAL组、正常对照、PAL组三组间的差异表达基因，即使用贝叶斯统计理论的共轭先验分布推断基因标化后信号值（简称信号值）在样本中的均值和方差中的分布，利用了先验分布，从而推导出实际的后验分布状况。
3 实验结果
基因芯片结果显示共存在差异基因417条。其中，PAL 组和对照组比较：上调基因54条，下调基因102条；木兰脂素+PAL组和PAL组比较：上调基因25条，下调基因31条。经共表达基因的显著性分析后，筛选出两个基因群构建基因功能相似性网络，计算网络中心点，得出在木兰脂素+PAL组和PAL组比较中，DDIT3基因是木兰脂素下调的主要调控基因。木兰脂素主要保护了PAL对脂质内膜的破坏，增强了细胞增殖能力和组织结构的再形成能力。
本发明实施例4：木兰脂素对PAL损伤HUVEC DDIT3基因表达的影响
1实验材料
1.1实验药物
木兰脂素：同具体实施例1。
1.2实验对象
HUVEC：同具体实施例1。
1.3试剂
MTT购自北京酷来搏科技有限公司；Pal、DMSO购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝生命科学技术公司；UltrapureRNA Kit购自康为世纪生物科技有限公司；AffymetrixHuman U4302.0基因芯片来源于美国Affymetrix公司；qPCR荧光试剂盒、逆转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；其它生化试剂购自大连美仑生物技术有限公司。
1.4仪器
二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司；生物安全柜购自海尔医学设备公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；酶标仪购自美国Bio-Tek公司；定量PCR仪（7300SequenceDetection System）购于美国ABI公司。
2实验方法：
2.1 HUVEC的培养 同具体实施例1。
2.2分组及给药方法
常规培养HUVEC，调整细胞密度为1×107个/L，然后均匀接种于无菌60ml 培养瓶中，37℃、5％CO2 培养24小时，使细胞生长成良好单层。实验开始前用等体积无血清培养基静止培养24小时使之同步化，随后随机分为：①空白对照组：2% FBS血清培养基培养；②PAL组：PAL终浓度为100μmol/L。③木兰脂素+PAL组：先用60μmol/L的木兰脂素培养细胞1小时，然后加入终浓度为100μmol/L的PAL继续培养。每组重复3次，置于37℃、5％CO2 培养箱中继续培养24小时后收获细胞供检测。
2.3 RNA的提取及检测同具体实施例3。
2.4 RT-PCR反应
2.4.1 cDNA合成
（1）cDNA合成体系如下：
总RNA 5μg
2×cDNA逆转录酶预混物 18μl
总体积 20μl
反应条件为37℃保温15分钟后，85℃变性5秒钟，4℃保存。
2.4.2 实时荧光定量PCR
SYBR Green RT-PCR反应体系的反应体系如下：
ddH2O 6.0μl
SyBR Taq 10.0μl
primer mix 1.6μl
ROXII 0.4μl
cDNA 2.0μl
扩增循环反应条件选择仪器默认条件，具体为：95℃ 20秒后进入循环阶段，95℃ 3秒，60.0℃ 30秒，40个循环，然后采用融解曲线法检测产物特异性，最后使用仪器配套软件进行数据分析。
2.4.3 DDIT3基因引物设计
根据NCBI数据库DDIT3 cDNA基因序列，设计引物如下：
Forward Primer：5`-AGCAGCAGAGAACCATCAAG-3`
Reverse Primer：5`-CCTGGAGTTGAGGCAAAGAT-3`
3实验结果
实时定量RT-PCR结果如图5所示，其进一步验证了基因芯片结果，证实木兰脂素能降低PAL导致的HUVEC中DDIT3基因的高表达。

Claims (5)

1.木兰脂素作为唯一活性成分在制备治疗或预防动脉粥样硬化的药物中的应用。
2.木兰脂素作为唯一活性成分在生产用于调控DDIT3基因的表达来治疗或预防动脉粥样硬化药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是：
⑴.木兰脂素对HUVEC作用的测试方法：将培养的HUVEC接种于96孔板，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为6组，即空白对照组、30、60、90、120、150μM木兰脂素组，每组重复6孔，分别加以0、30、60、90、120、150μM木兰脂素处理，置于37℃、5％CO2 培养箱中培养12小时后，以3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT）法检测细胞的存活率，倒置显微镜观察细胞的形态；
⑵.木兰脂素对棕榈酸致HUVEC损伤的改善作用测试方法：将培养的HUVEC接种于96孔板，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为6组，即空白对照组、30、60、90、120、150μM木兰脂素组，每组重复6孔，实验中先以0、30、60、90、120、150μM浓度的木兰脂素预处理细胞2小时，然后加入PAL（终浓度100μM），空白对照组用加入1%白蛋白代替PAL和木兰脂素，置于37℃、5％CO2培养箱中共同孵育12小时后，以倒置显微镜观察细胞的形态，MTT法检测细胞的存活率；
⑶.木兰脂素对PAL处理HUVEC基因表达谱的作用测试方法：将培养的HUVEC接种于75ml培养瓶中，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为3组，即①对照组：DMEM高糖培养基常规培养细胞，含1%白蛋白；②PAL组：PAL终浓度为100μM；③木兰脂素+PAL组：先用60μmol/L的木兰脂素培养细胞1小时，然后加入终浓度为100μM的PAL；每组重复3次，各组细胞继续培养12小时后收获细胞，分别提取纯化各组细胞总RNA，利用Affymetrix Human U430 2.0基因芯片进行标记杂交实验，RMA法对Affyemtrix基因芯片的扫描结果进行分析，筛选出差异基因；
⑷.木兰脂素对PAL处理HUVEC DDIT3基因表达作用的测试方法：将培养的HUVEC接种于75ml培养瓶中，待细胞长成80～90％融合的单层后，随机分为3组，即①对照组：DMEM高糖培养基常规培养细胞，含1%白蛋白；②PAL组：PAL终浓度为100μM；③木兰脂素+PAL组：先用60μmol/L的木兰脂素培养细胞1小时，然后加入终浓度为100μM的PAL；每组重复3次，各组细胞继续培养12小时后收获细胞，分别提取纯化各组细胞总RNA，用实时定量PCR法对基因芯片筛选出的差异基因DDIT3的表达进行检测。
4.根据权利要求5所述的应用，其特征是HUVEC的培养方法为：正常生长的HUVEC培养于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件为37℃、5％CO2，接种密度为1.2×105/ml，每3天传代一次。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是木兰脂素浓度在30～120μmol/L之间。
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吕莎 等: "内皮型一氧化氮合酶异常信号系统调节与动脉粥样硬化防治研究进展", 《上海医学》 *

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