CN110177618A - 用于分析和识别分子的方法与装置 - Google Patents

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Abstract

呈现了用于执行分子的分析和识别的装置和方法。在一个实施方式中，便携式分子分析器包括用于接收样本的样本输入/输出连接、用于实质上实时地对样本执行分析的基于纳米孔的测序芯片以及用于输出分析结果的输出接口。

Description

用于分析和识别分子的方法与装置
技术领域
本发明总体上涉及分析和识别分子，尤其涉及提供实时的、便携式的、基于纳米孔(nanopore)的分子分析装置。
背景技术
核酸、脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)是存在的，并且在每个活体有机体中都具有其唯一的序列。其自然地将其自己作为各种生物主体(bio-agent)的决定性标识。因此，对核酸、DNA和/或RNA的分析(这里其被概括地称为基因分析)在研究一切生物个体方面是非常有用的。然而，当前商业可用的核酸测序技术(诸如微阵列、焦磷酸基因测序(pyrosequencing)、通过合成的测序和通过结扎的测序)在各种方面都是非常受限制的。例如，这些技术中的一些或全部不能执行实时分析，需要长的样本核酸扩增过程和实验方案(诸如聚合酶链式反应)，具有长的周转时间(通常要花费几天到几周的时间来分析小片段的样本核酸)，具有高的运营成本(其中一些使用昂贵的化学试剂)，具有高的假阳性(false-positive)误差率并且是非便携性的。
由于当前核酸测序技术的上述局限性，工作在该领域中的人们(诸如医工、安全人员、科学家等)不能在本地执行现场基因分析。相反地，现场工作人员不得不收集并输送样本到专门实验室来进行几天甚至几周的分析，以识别存在于样本中的核酸。这种长而繁琐的过程很难满足当今基因分析的需求，尤其是在流行病爆发期间(诸如英国的口蹄疫流行病、亚洲的非典型严重急性呼吸道综合征(SARS)和最近在墨西哥和美国的H1N1流感(也通常被称为猪流感)。只通过使用当前的核酸测序技术，官方很难达成迅速且有根据的决定(即使不是全然不可能)，而这将对社会产生巨大的安全和经济影响。
为了应对当前核酸测序技术的缺点，科学家已经开发了各种基于纳米孔的测序技术。近来，牛津大学的Hagan Bayley教授和他的同事在生物纳米孔试验中证明通过使用α-溶血素能够实现精度为99.8％的长读取(long read)。基于已建立的检测速度，256X256个纳米孔的阵列通常足够用于在大约30分钟内分析整个的人类基因组。如果人们能够成功实现生物纳米孔阵列，则这将是具有转折意义的成功。然而，生物纳米孔的一个缺点是在形成生物纳米孔中使用的蛋白质和酶的寿命相对短，其一般为几小时到几天。
固态纳米孔是对生物纳米孔的更稳健的替代，因为在构建固态纳米孔时不涉及生物试剂。然而，在半导体工业中采用的传统光刻技术不能限定基于固态纳米孔的测序技术所需的2nm的特征尺寸。迄今为止，使用当今不同的制造技术(例如，电子/离子铣削)只可以顺序地一一切割纳米孔。但是这些技术不能调整(scale to)来以不太昂贵的成本和合理的生产时间产生256X 256的阵列。
附图说明
在附图中通过示例而非限制的方式示出了本发明，其中:
图1示出了基于纳米孔的测序器(sequencer)和相关的基于纳米孔的测序生物芯片的一个实施方式；
图2A示出了在基于纳米孔的核酸测序的检测和分析期间分子的易位过程的一个实施方式；
图2B示出了与空孔的背景信号相比核酸序列的示例性电读出；
图3示出了在用于刻蚀和淀积两者的纳米缩放仪中使用中的单透镜的一个实施方式的侧视图和俯视图；
图4A-4E示出了用于制造纳米孔和/或纳米孔阵列的减去法(subtractivemethod)的一个实施方式；
图5A-5I示出了用于制造纳米孔和/或纳米孔阵列的添加法(additive method)的一个实施方式；
图6A示出了纳米环的一个实施方式和纳米隙缝的一个实施方式；
图6B示出了位于晶圆上的薄膜上的漏斗状纳米孔的一个实施方式。
图7示出了用于形成测量腔室的底部空腔的键合的纳米孔阵列晶圆和集成电路晶圆的一个实施方式；
图8示出了用于形成测量腔室的顶部空腔的键合的顶部晶圆和复合晶圆的一个实施方式；
图9示出了能够用基于纳米孔的测序器操作的电压偏置方案和电流感测电路的一个实施方式；
图10A示出了基于纳米孔的测序器的一个实施方式；
图10B示出了多测量腔室的一个实施方式；
图11示出了基于纳米孔的测序器的一个实施方式的沿着从样本入口、沿着微流体通道和纳米流体通道、通过测量腔室之后到达样本出口的选定路径的截面图；
图12示出了具有嵌入电极的三层生物芯片结构的一个实施方式；
图13A示出了用于纳米孔检测的偏置和感测方案的一个实施方式；
图13B示出了平面电极实现方式的一个实施方式；
图13C示出了平面电极实现方式中的感测电极和纳米隙缝的一个实施方式的俯视图；
图14A示出了用于拉直带有链裂的dsDNA的一个实施方式。DNA泵1403是可以锚定在固定位置并在定向方式下作为DNA马达机的DNA易位蛋白，例如，FtsK蛋白家族可主动运输链裂dsDNA1402的其中一端到带有引导电极的通道内，随后运输至解离区1405，dsDNA在加热后分离成短链的ssDNA 1406，其通过引导电极向下游传输。
图14B示出了以一阵列微/纳米柱取替了图14A中的DNA泵的一个实施方式。
图14C示出了和图14A相同的实施方式，除了在解离区使用了解旋酶1408代替了加热。
图14D示出了和图14B相同的实施方式，除了在解离区使用了解旋酶1408代替了加热。
图14E示出了链裂dsDNA在没有被拉直下直接被带到解离区的一个实施方式。
图15示出了具有H树状结构的一组通道，其中包括单个入口1501和多个出口1502。H树状结构确保了从入口1501到任何出口1502的路径长度是相同的。
图16示出了连接算法的流程图。由于寡核苷酸测序结果与寡核苷酸从链裂dsDNA解离的次序密切相关，因此临时存储TS-1和TS-2可以用相对简单的数据结构实行，例如队列、堆栈、链表或哈希表。
图17示出了在实时数字PCR生物芯片中的井阵列和H树状结构。
图18示出了一个完整实时数字PCR模块的示例。
图19示出了基于纳米孔的测序器的一个实施方式的硬件高级结构；以及
图20示出了用于基于纳米孔的测序器的一个实施方式中的操作系统和基因分析软件的软件和相关硬件部件的高级结构。
具体实施方式
在下面的描述中，阐述了诸如特定部件、设备、方法等的示例的若干特定细节，以便提供对本发明实施方式的透彻理解。然而，对本领域技术人员显而易见的是，不需要采用这些特定细节并以实践本发明的实施方式。在其他实例中，没有详细描述众所周知的材料或方法，以避免不必要地模糊本发明的实施方式。
下面描述用于执行分子(诸如核酸、氨基酸、缩氨酸、蛋白质和聚合物)和纳米尺寸的粒子(诸如碳纳米管、硅纳米杆和涂覆/未涂覆的金纳米粒)的分析和识别的装置和方法的各种实施方式。注意，下面的讨论集中于分子分析(即基因分析)的一个示例，以便说明思想。本领域技术人员将容易地意识到本文公开的技术能够应用于分析和识别一般的分子。在一个实施方式中，基于纳米孔的测序器是便携式基因分析系统。图1示出了便携式基于纳米孔的测序器110和关联的基于纳米孔的测序生物芯片120的一个实施方式。在检测和分析期间，待测样本中的分子在溶液中被电泳式地驱动穿过纳米级的孔(也称为纳米孔)，如图2A所示。在一些实施方式中，纳米孔的尺寸大约2nm。注意，纳米孔的尺寸在不同的实施方式中可以改变。例如，纳米孔在一些实施方式中具有固定的相同尺寸。在一些可替换实施方式中，纳米孔具有不同的尺寸。另外，在同一实施方式或者不同实施方式中，纳米孔的形状也可以改变，诸如圆形、椭圆形、拉长隙缝等。依赖于纳米孔所限定的空间中的分子的相对尺寸和移动速度，各种电学特性(诸如由图2B所表示的具有不同幅度和持续时间的电流脉冲)能够被观察并用于识别分子。结果，能够在不破坏待测分子的情况下实现对核酸序列的直接读取。换言之，能够对核酸序列进行测量，同时保持核酸序列的完整。在一个实施方案中，其电读出是分子的开启电压和/或电导/电流。在另一个实施方案中，分子可以是来自DNA链的核苷酸。Kletsov等人已经获得了每种核苷酸的相应理论值。[引用文献：Kletsov etal..,“Ab initio electron propagator calculations of transverse conductionthrough DNA nucleotide bases in 1-nm nanopore corroborate third generationsequencing”,Biochimica et Biophysica Acta,Volume 1860,Issue 1,Part A,January2016,Pages 140-145]
在不具有基本限制的情况下，可以利用多个制造技术来大量生产纳米孔阵列，该纳米孔阵列在一些实施方式中包括具有大于2nm的孔的阵列。一些示例性制造技术的细节将在下面进行详细描述，以说明该思想。本领域技术人员将意识到，也可以采用其他兼容的制造技术或这些技术的变形方式来生产纳米孔阵列。通过并入微流体/纳米流体通道的网络，基于纳米孔的测序器能够以前所未有的速度和在没有人类干预的情况下精确地破译基因组。
除了基因分析中的小型因数(form-factor)和速度，基于纳米孔的测序器的一些实施方式还提供下述其他优点。其中一个优点是能够容易地提供对生物主体中的任何变异的进一步证明。这是有可能的，因为基于纳米孔的测序技术是一种直接读取技术，它的结果不需要待测基因组的之前信息。另外，基于纳米孔的测序器的一些实施方式能够在极端情况和不明环境中进行操作，因为总是能够保证纳米孔的无菌状态和洁净，因为在整个分析过程期间，纳米孔总是被封闭在基于纳米孔的测序生物芯片内并且没有被暴露给任何不期望的外来物质。
作为手持便携式设备，基于纳米孔的测序器的一些实施方式能够加速许多不同的工业和科学的进步。例如，在商业和研究与开发中，基于纳米孔的测序器的一些实施方式在基本研究、药物基因组学、细菌诊断、病原体检测、农业、食品工业、生物燃料等方面是有用的。作为进一步的示例，基于纳米孔的测序器的一些实施方式在快速DNA法医学、进口港生物筛分等方面是有用的。
用于基于纳米孔的测序的纳米孔阵列
在20世纪70年代，基于库尔特计数器的电阻脉冲技术，DeBlois和他的同事成功地证明在通过粒子尺寸和电泳淌度来表征粒子时使用单个亚微米直径的孔。之后，Deamer提出将纳米尺寸的孔用于基因测序的思想。他和他的同事证明，单链DNA(ssDNA)和RNA分子能够被驱动通过成孔蛋白质并能够通过它们对通过该纳米孔的离子电流的影响而得到检测。假定最近被证明的高测序速度，基于纳米孔的测序的进展因缺乏廉价且并行写入的制造过程来创建用于快速基因分析的纳米孔大阵列而在很大程度上受到限制。许多常规的光刻方法(例如电子铣削、离子铣削和硅回蚀)不是用于制造实时基因分析所需的纳米孔阵列的切实可行的方式。直到近来，休斯顿大学的Donnelly和他的同事研发了纳米缩放仪的一些实施方式，这些实施方式能够大量产生2nm的纳米孔阵列，而不会受到太多的限制。根据他们的模拟结果，纳米缩放仪能够定义具有像1nm那样小的尺寸的孔或点。通过并入微流体/纳米流体技术，纳米缩放仪展现了实现实时或接近实时基因分析系统的可能性。
在纳米缩放仪中，宽的、准直的、单能离子束被指向制造在导电衬底(例如，掺硅(Si)的晶圆)上的亚微米直径静电透镜(也称为单透镜，如图3所示)阵列。通过将适当的电压施加到透镜电极上，进入透镜的“细光束(beamlet)”聚焦到能够比透镜的直径小100倍的点上。这意味着可以由10nm的透镜来定义1nm的特征，这能够通过在当前的半导体处理中使用的光刻技术来处理。而且，每个透镜都将其自己的纳米特征写在衬底上，因此纳米缩放仪是并行写入过程，其与聚焦的电子束或离子束的顺序写是非常不同的。由于透镜阵列是衬底的一部分，所以该方法实质上不受振动或热膨胀导致的未对准的影响。纳米特征的尺寸由预定义的透镜的尺寸控制，这些预定义透镜的直径可以相同或不同，即相同或不同的纳米特征阵列能够被实质上同时处理。在存在Cl2气体的情况下具有Ar+束，得到了直径为10nm、深度为10nm的刻蚀Si孔。蚀刻仅可以出现在这样的孔中，即电压被施加到上金属层以便离子细光束被聚焦。其余的孔将不具有被施加到上金属层的电压，细光束将不被聚焦，并且电流密度将太小而不能导致任何明显的刻蚀。
通过采用纳米缩放仪，存在着两种方法，即减去法和添加法，来制造用于基因分析的纳米孔。下面将首先讨论直接刻蚀方法的一个实施方式，之后讨论间接刻蚀方法的一个实施方式。
A、用于制造纳米孔和/或纳米孔阵列的减去法的一个实施方式
图4A-4E示出了用于制造纳米孔和/或纳米孔阵列的减去法的一个实施方式。参照图4A，氮化物420被淀积到S i(硅)(I 00)晶圆410上。在图4B中，淀积底部导电材料422(掺硅或金属)，随后是介电分离器(spacer)424和上金属层426。之后，限定多个单透镜。参照图4C，对导电材料422执行纳米缩放刻蚀以限定纳米孔430，该纳米孔430被用作氮化物层420中的纳米孔刻蚀的硬掩膜。在图4D中，移除单透镜。之后，将氧化物435涂覆到纳米孔430上以进行保护。最后，在图4E中，通过对硅衬底410的背部进行化学机械抛光(CMP)、光刻技术和氢氧化物(KOH)刻蚀来形成测量腔室的底部空腔440。氧化物层435之后被移除以露出纳米孔430。
B、用于制造纳米孔和/或纳米孔阵列的添加法的一个实施方式
图5A-5I示出了用于制造纳米孔和/或纳米孔阵列的添加法的一个实施方式。参照图5A，氮化物520被淀积到Si(100)晶圆510上。在图5B中，淀积底部导电材料522(掺硅或金属)、介电分离器524和上金属层526。之后，限定单透镜。在图5C中，淀积用于纳米杆或纳米管生长的纳米种子530。在图5D中，形成纳米杆或纳米管535。在图5E中，淀积氧化物540。在图5F中，去除纳米杆或纳米管535。剩余的氧化物纳米孔550被用作用于导电层或氮化物层的硬掩膜。在图5G中，将图案从氧化物层540转移到导电层522上，之后转移到氮化物层520。在图5H中，移除单透镜，之后移除氧化物层540。纳米孔被涂覆用于保护的氧化物552。最后，在图5I中，通过在硅衬底510的背部上进行CMP、光刻技术和KOH刻蚀来形成测量腔室的底部空腔560ο氧化物层552之后被移除以露出纳米孔565。
图6A示出了在本发明的一些实施方式中使用的纳米隙缝的一个实施方式和纳米环的一个实施方式。拉长的纳米尺寸的纳米隙缝610和纳米环620可以由具有单透镜的减去法的一些实施方式(其在上面已经讨论)限定，其中开口分别为矩形和半圆形，如图6A所示。基于本文做出的公开，本领域技术人员应当意识到，能够通过使用类似的图案化技术来定义任何二维形状。由于在一些实施方式中在整个过程中晶圆载物台实质上是静止的，所以该非圆形图案化方法解决了倾斜晶圆载物台的常规方法所面临的至少三个主要技术问题。首先，不需要精确控制晶圆载物台的倾斜角度和速度。其次，其总体上克服了将晶圆相对于离子的入射束进行倾斜而引入的线路加宽效应和线路宽度非均匀性。第三，其允许在大约同时定义图案的不同形状和尺寸。在一个实施方案中，纳米缩放仪在位于晶圆上的薄膜上产生一阵列漏斗状纳米孔。图6B示出了一个漏斗状纳米孔在晶圆上的薄膜上的示例。每个漏斗状纳米孔601的一面具有一个大开口602，并且在另一个面具有一个小开口603。在一个实施方案中，较大的开口602促进分子的接收，而较小的开口603则被用于将单分子限制在空间内以测量识别参数。小开口603的尺寸与分子的尺寸相当。在一个实施方案中，小开口的直径为1,2或3纳米。在一个实施方案中，薄膜是包含多层的合成薄膜。薄膜可以包括至少三层，包括两个导电层604夹着电介质层605。那两个导电层604可以是碳基材料，例如石墨烯，或金属，例如铱。在一个实施方案中，导电层604可被进一步处理成电极以用作用于检测分子身份。电介质层605可以是高k介电材料，例如氮化硅、氧化铝、二氧化铪和二氧化锆。在一个实施方案中，高k介电材料层605可用于电隔离两层导电材料604，并防止漏电流在两层导电材料605之间通过。电介质层605的1,2或3纳米厚度給予高分辨率以准确指出单分子，例如指出ssDNA在穿过薄膜上的纳米孔601时中的单个核苷酸。由于漏斗状纳米孔穿过所述多层薄膜，每一层将在纳米孔的一部分形成一个圆形通孔606，这样的设定能确保即使分子从纳米孔的中心轴倾斜也能获取相同的读取，因为导电层上的开口围绕中心轴对称。由于包夹层是用于检测分子的身分，因此穿过该结构的纳米孔截面具有1,2或3纳米的直径以确保检测的准确性。为了达到提供结构支撑或与周围环境电隔离等目的，薄膜更可以包括附加的上电介质层和下电介质层607,608，例如二氧化硅或氮化硅。所述附加层位于薄膜漏斗状纳米孔相对较大的部分，促进分子易位至纳米孔的最终1，2，或3纳米来进行检测。上述纳米孔直径1-3纳米的值域和高k介电材料的厚度是针对核酸特别选择的。就其他分子而言，例如氨基酸，蛋白质或缩氨酸，本领域技术人员将容易地调整尺寸以优化检测信号。
基于纳米孔的测序生物芯片
在用减去法或者添加法形成了纳米孔阵列之后，纳米孔阵列晶圆750可以被键合到具有预制造的集成电路720和微流体通道730的晶圆上，如图7所示。这完成了测量腔室的底部空腔的形成。如果期望的话，可以通过底部晶圆上的微流体通道将核酸样本从生物芯片中提取出来。
类似地，在一些实施方式中，通过将具有集成电路820和/或流体通道830的顶部晶圆810键合到复合晶圆上来形成测量腔室的顶部空腔，该复合晶圆包括键合的纳米孔晶圆840和底部晶圆850。该三层晶圆结构800在图8中示出。电压偏置方案910和关联的电流感测电路920的一个实施方式如图9所示。通过采用恰当的流体I/O连接，诸如具有最小死体的那些，该三层复合晶圆800之后被安装到支撑框架上以进行引线键合或栅铃(bell grid)引线键合。典型的封装技术(例如环氧封装和陶瓷封装)能够用于封闭整个组件来形成基于纳米孔的测序生物芯片。可替换地，集成电路(诸如与感测和偏置关联的那些集成电路)可以制造在纳米孔晶圆840上，该纳米孔晶圆840可以被键合到空白衬底上而非其上具有集成电路的另一晶圆。
另外，在一些实施方式中，存在着嵌入到顶部晶圆810上的两个或更多个特征，SP沿着微流体通道1010的样本引导电极1015和通向测量腔室1030的纳米流体通道1013，如图1OA和11所示。为了进一步说明通过基于纳米孔的测序生物芯片的样本流，下面将详细讨论一个示例。
缓冲器入口1025和缓冲器出口1027用于在装入用于检测的样本之前预湿和预填充微流体通道1010、纳米流体通道1013和测量腔室1030的网络。在检测期间，微流体通道中的流体流能够通过使用芯片上或芯片外的微栗或微阀门通过缓冲器入口和出口的流速率进行调节。
在一个示例中，单链核酸分子的磷酸盐-去氧核醣主链(backbone)被充电有用于每个基本片段的负电荷，并且在该分子的5’末端处存在着两个负电荷。沿着从接收容器1020通过样本入口连接器1023到达目标测量腔室1030的样本引导电极链1015的正电压脉动能够从接收容器1020中提取核酸分子，并将该分子递送给预分配的测量腔室1030。类似地，样本引导电极1017也被沿着微流体通道1010嵌入到底部晶圆上，以用于以类似方式从基于纳米孔的测序生物芯片中提取样本。
通过使用沿着流体通道网络的样本引导电极的类似方案，人们能够将测量腔室1040的数量扩展到不止一个。以树形结构布置的测量腔室的一个示例如图1OB所示。除了用于执行多个独立分析的能力之外，DNA片段被从样本接收容器1020中提取时的顺序在一些实施方式中被预分配给每个测量腔室。如图1OB所示，测量腔室1040用2个十进制数标记。第一个十进制数表示分支编号而第二个十进制数表示分支中测量腔室的位置。测量腔室1040的分配顺序可以简单地以升序顺序，即首先使用具有最低编号的腔室之后是具有下一较高编号的腔室。这样，在移动到下一分支之前能够使用分支中的所有测量腔室。可替换地，在当前示例中，样本可以被分配给每个分支中具有最低编号的腔室，其中最低的分支编号被首先使用，即11、21、31、41，之后是12、22、32、42等。根据该分配方法，每个分支的与中心微流体通道具有最远距离的测量腔室可以被首先分配，之后是每个分支的下一测量腔室。该方法可以降低中心微流体通道中的样本引导电极的电信号对测量到的信号的干扰。当整个测量完成时，能够根据片段的提取顺序来对整个DNA样本的序列进行系统地汇编。这可以消除其他传统测序技术(诸如微阵列，其中，杂交过程将样本的原始序列随机化，并且需要检测分析后再以极多的计算和易错来修补后然后获得恰当的序列)所需要的费时的后检测分析。另外，由于片段的提取顺序被记录，所以能够重新组合这些片段来形成原始的DNA样本。对于其他常规测序技术，原始样本通常被损坏并且不能被恢复以供后续使用。
返回参照图10A，通过顶部晶圆和复合晶圆的晶圆键合形成的纳米流体通道1013可以用作滤波器、样本流速率控制器以及分子拉伸器(stretcher)。在一些实施方式中，纳米流体通道通过开启和关闭顶部晶圆上的顶部电极而用作滤波器，人们能够选择性地从微流体通道中拉(pull)入样本。在一些实施方式中，纳米流体通道通过调节顶部电极和底部电极的电压而用作样本流速率控制器，人们能够控制通过纳米流体通道的样本的流速率。纳米流体通道1013还可以用作分子拉伸器，因为单链核酸分子1101在通过纳米流体通道1013时会被从自然的弯曲状态拉伸，如图11所示。
在一些实施方式中，利用纳米流体通道的速度控制特性来允许更准确地分析分子。如图12所示，感测电极1205被嵌入纳米孔1225中，在控制通过纳米孔1225的分子流时其成为微通道/纳米通道网络的主要部分。除了纳米流体通道，所施加的DC电压还被设计成在通过纳米孔1225改变位置时微调分子的速度和方向。通过交替分别施加到顶部驱动电极1230和底部驱动电极1235的DC偏置电压的幅度以及嵌入的感测电极1205，待测分子能够被通过纳米孔1225来回拖动多次以进行反复分析，以便通过消除统计误差来增加识别分子的精度，即能够降低假阳性误差率。
不同于一些常规方法(其中，感测电极被集成到纳米孔中)，DNA中的每个基部或许仅花费几纳米就能通过纳米孔。该渡越时间对于任何有意义的测量而言都是太短了。鉴于该缺点，已经开发了其他常规方法来减慢分子通过纳米孔的移动。一个常规方法提出用于通过向纳米孔中嵌入额外电极来控制分子的速度的电压诱捕方案。所提出的电压诱捕方案很难实现，因为其需要在彼此顶部堆叠并且通过在导电电极之间夹入介电材料而彼此电绝缘的四个或更多个导电电极。形成在该多层膜上的所要求的2_3nm的纳米孔可以具有大于30:1的纵横比，即使不是不能实现，这也是用当前的集成电路制造技术很难实现的。
如图13A所示，所施加的AC感测电压1310用于在分子通过纳米孔1325改变位置时询问分子。因此，能够采用各种感测机制来识别分子，例如，电阻变化、电容变化、相位变化和/或隧道电流。由于嵌入的感测电极1305与待测分子的紧密接近，所以能够改善信噪比。
上面的示例性样本递送和滤波机制作为用于说明纳米孔测量腔室阵列如何被实现的示例。本领域技术人员将意识到，在不同的实施方式中可以采用上面的递送和滤波机制的变形。另外，可以通过使用所示出的方法来实现具有不同尺寸的孔的阵列。将蛋白质孔(诸如溶血素)与上面提到的固态纳米孔阵列连同在一起也能够实现生物纳米孔阵列。在一些实施方式中，两个感测电极都可以被布置到同一导电层上，来替代上面描述的位于不同导电层上的堆叠电极。图13Β示出了平面电极实现方式的一个实施方式。在该平面电极实现方式中，两个感测电极1307都布置在同一导电层上，其中纳米隙缝1327限定在感测电极1307之间。感测电极1307和纳米隙缝1327的俯视图如图13C所示。如上所述，纳米孔和纳米隙缝都使用纳米缩放仪来定义。
在一些实施方式中，用于实质上实时执行分子检测的能力、用于执行单个分子检测而不需要预检测样本扩增的能力、用于执行多个且实质上同时的检测的能力、用于进行多通道检测的能力、用于识别样本而不要计算加强后检测分析的能力和/或用于在检测之后保留样本供后续使用的能力在提供低成本、快速且准确的基因分析方面(例如，在识别单个核苷酸多态性方面)是非常关键的。
在本发明中，双链DNA、dsDNA经由切口酶的预处理，以使切口作用发生在特定的酶切位点或其附近。在各寡核苷酸根据他们在dsDNA的顺序在解离区脱离链裂dsDNA之前，可将链裂dsDNA先拉直。其后，每个寡核苷酸将通过引导电极被拉入引导通道的不同臂中，例如H树状结构通道。每个寡核苷酸的序列将会被下游的纳米孔芯片所检测。当一组H树状结构通道被使用时，每个寡核苷酸到达纳米孔的时间将将粗略地反映寡核苷酸在dsDNA上的顺序，因为在平衡的H树状结构中，由单一入口到叶子的径长被设计为相同。此顺序可应用于组装检测结果以获得原始dsDNA的序列而无需参考序列。由于dsDNA中的两条链彼此互补，因此在相约时间到达纳米孔芯片的两个寡核苷酸很可能彼此互补，并且每对这样的寡核苷酸的检测序列将对应检查彼此的正确性，即自我检查。由于酶切位点具有散佈性质，当配对两个最大互补的寡核苷酸时，两端突出部份的序列可用作搜索邻近寡核苷酸的匹配标准，即自我引导。基于这种內置的自我检查和自我引导机制，所检测的寡核苷酸序列可以在沒有参考序列的情況下组装在一起，即可以办到从头测序。
在一个实施方案中，将一个长的dsDNA输入一个室1410内，所述室1410包括用于在特定酶切位点链裂至少一条DNA链的酶1402。在一个实施方案中，dsDNA在被酶链裂后被拉直。图14示出了拉直dsDNA的不同实施方式。用于链裂dsDNA的酶包括突变的第2型S核酸内切酶，例如基于fokI的切口酶,以及New England BioLab’s REBASE数据库中包括的其他新发现的切口酶或人工制造的切口酶；CRISPR/cas9衍生的切口酶；如同TALEN的基于fokI的切口酶。被酶所链裂的DNA随后在酶活作用发生的下游位置或在单独的室中被解离成短链ssDNA，例如通过加热或酶所破坏。由于DNA即使被链裂后仍能保留其长双螺旋结构，链裂后的长DNA可被运至解离区(例如通过引导电极)，并以受控制的方式从长dsDNA上解离ssDNA的短链。其解离可以通过加热或螺旋酶等酶来达至。在一个实施方案中，所述酶包括T7噬菌体基因产物4或gp4，野生型蛋白或突变体衍生物。ssDNA短链将通过单一入口到达多个出口向下游进发。从入口通向出口的每条路径的总长度被设计为相同，使得ssDNA到达出口处的时间可暗示其在原始dsDNA上的顺序。引导电极将分派ssDNA通过入口到不同的通道。在一个实施方案中，引导电极将沿着整个通道以确保ssDNA到达出口。在一个实施方案中，该组通道具有H树状结构。图15示出了一个H树结构的的示例。在每个出口处，ssDNA将穿过纳米孔以读取序列。由于原始长链DNA上的ssDNA的顺序是已知的，因此在读取单个ssDNA后，整个序列可以容易地拼凑在一起。图16示出了在不使用参考序列情况下用连接算法组装寡核苷酸序列的一个示例。
使用一组八台的计算机服务器，每台服务器都有双重四核心至强中央处理器(2.4GHz)和12GB RAM，Lin及其同事对七种从头装配算法进行了比较，并注意到就秀丽隐杆线虫而言(20.9兆碱基对)，这七种算法的装配时间从几分钟到几个小时不等。[参考文献:Lin,Yong,et al.,“Comparative studies of de novo assembly tools for next-generation sequencing technologies,”Bioinformatics,2011Aug 1；27(15):2031-2037.]
为了证明上述切口酶样品制备和相关的装配算法所带来的进步，在具有双核i5处理器(2.5GHz)和16GB RAM的MacBook Pro笔记本电脑中使用Python模拟了切口活动和汇编算法。为了与其他的七种从头组装算法公平对比，首先随机产生长度为20Mbp的dsDNA序列，然后根据预定义酶切位点的模式生成沿dsDNA两条链的多个切口，最后根据缩短的ssDNA序列产生文库(哈希表)。与其他七种从头组装算法一致，模拟几种情况时是顺序执行ssDNA的读取和组装，即，直到获得ssDNA的所有结果时才开始组装过程。使用本发明方法的典型组装时间小于5分钟，这意味着使用便携式系统对样品DNA进行实时分析是可行的。如图16中的流程图所示，如果同时处理ssDNA的读取和组装，则预计组装时间将大大缩短。
在一个实施例中，如在液体活检的情况下以及无细胞DNA分析，在纳米孔处读取DNA序列前先以数字PCR，dPCR，扩增稀有等位基因的序列或超低丰度的序列。在另一个实施例中，dPCR与测序系统分开存在。本发明的dPCR包括一组具有如上所述的H树结构的通道。在一个实施例中，该组通道填充有疏水性流体，具有比水更高的沸点，例如，来自3M的合成油Fluorinert或矿物油。将DNA样品与基于水的PCR测定试剂混合，然后进料到H-树通道组的单个入口，其将少量DNA样品和试剂分配到多个出口中的每一个的井中。在一个实施例中，井是在硅晶片上制造的孔阵列。在另一个实施方案中，每个井的直径范围为10至1000μm。为实现对PCR所需的温度的控制，可以将传感器和加热元件嵌入具有井阵列的硅晶片中或将整个晶片放置在具有受控温度的环境中。在一个实施方案中，每个井有与其耦合的CMOS或CCD记录来自每个井的荧光信号。对于测序系统内的dPCR，来自一个或多个选定井的样品将向下游的漏斗形纳米孔进发，并进行读取DNA序列所需的程序。当dPCR作为单独的装置存在时，位于H树结构通道出口的井阵列被膜密封，如果要取回DNA样品则可以将膜移除。图17和18显示了本发明中单独的dPCR的一个实施方案。在该实施方案中，dPCR由孔阵列和H树微流体网络组成。H树微流体网络的每个出口在制造时连接到井阵列上的一个相应井。未连接到微流体网络的井阵列1701的一侧由透明膜覆盖以形成顶部通道，而未连接到井阵列的H树微流体网络1702的一侧覆盖有支撑板。为清楚起见，图17中省略了透明薄膜和支撑板。图17中也省略了I/O端口。图18显示完整的实时dPCR模块，示出了油和样品的输入端口以及剩余的容器，但省略了透明薄膜。在一个实施方案中，dPCR的样品加载方法如下：1)用合成油部分填充模块，2)将液体样品加载到通道中，和3)泵入更多的合成油以将液体样品推入井中。如果流体通道被适当地设计和制造，液体样品应当均匀地分布到每个孔中，例如，H树微流体网络。装载后，液体样品被困于前面和后面的油之间，水分不会蒸发，试剂在整个样品加载过程中保持一致的浓度。由于输入液体样品的体积有限并且预计会小于阵列中所有井的总体积，因此液体样品的初始体将在流体网络分层中的每个节点上分解成更小但相等的体积。最后，最终的“液滴”将被分进不同的井。在温度循环之前，期间和之后，每个液滴在阵列中的位置都是固定。可以用外部成像装置捕获温度循环中每个循环的不同波长的荧光图像。这意味着可以实时监测PCR的进展，即实时dPCR。当需要时，可以使用针刺穿透明薄膜并使用注射器或中空光纤从井中提取感兴趣的液滴用于进一步处理。根据井的大小，dPCR芯片可以基于以下一种或多种技术制造。在一个实施方案中，可以使用3D打印或模塑制造直径为几百微米的井。在另一个实施方案中，可以使用纳米3D打印或微模塑制造直径为数百至数十微米的孔。在另一个实施方案中，使用纳米压印在热塑性塑料上或半导体制造技术在硅上制造直径为数十至数微米的孔。如果使用硅芯片，可以将加热元件集成到芯片上以实现快速热循环。
本领域技术人员将容易认识到H树架构也可以用在其他应用中。在一个实施方案中，除DNA分子外，也可以将其他生物物质(例如单个细胞)分送到不同的井中以进行多个单细胞实验。
基于纳米孔的测序器
基于纳米孔的测序器提供了便携式基因检测和分析系统。在一些实施方式中，基于纳米孔的测序器包括两个主要部件，即硬件和软件。下面讨论高级架构和子单元的一些实施方式。
Α、硬件系统
在一些实施方式中，基于纳米孔的测序器的硬件系统包括两个主要单元，即计算、通信和控制单元和基于纳米孔的测序生物芯片接口单元，以及各种模块。高级架构的一个实施方式如图19所示。下面将进一步解释各种元件的细节。
I、计算、通信和控制单元
在一个实施方式中，硬件系统1900包括具有显示设备的便携式计算系统1910。这可以通过使用图形输入板、便携式电脑、上网本、一体化台式计算机、智能电话、个人数字助理(PDA)或任何手持计算设备等来实现。其用作用于运行操作系统(OS)、执行数据分析软件、存储数据、控制基于纳米孔的测序生物芯片的操作以及从基于纳米孔的测序生物芯片收集数据的中央单元。
在一个实施方式中，硬件系统1900进一步包括网络通信模块1920。网络通信模块1920包括WiF1、WiMAX、以太网、蓝牙、电话能力、卫星链路和全球定位系统(GPS)等中的一者或多者。网络通信模块1920用作通信集线器，该通信集线器用于与用于数据共享、程序更新、数据分析等的中央计算系统进行通信，用于与其他计算设备进行通信以便数据能够被共享以及能够在多个计算设备中并行地运行数据分析，用于与其他蓝牙使能的设备(例如，蜂窝电话、打印机等)、数据共享、程序更新等进行通信，以及用于发送并接收GPS信号。
在一个实施方式中，硬件系统1900还包括输入设备1930。输入设备1930可以包括键盘、触摸屏、鼠标、跟踪球、红外(IR)定点设备和语音设备设备等中的一者或多者。输入设备1930用作用于命令输入和数据输入的人机接口。
在一个实施方式中，硬件设备1900还包括输入/输出端口1940，其可以包括闪存卡接口、IEEE1394接口和通用串行总线(USB)接口等。I/O端口1940用作与其他电子设备的串行接口、次级数据存储接口以及用于基于纳米孔的测序生物芯片的测量数据I/O。
II、基于纳米孔的测序生物芯片接口单元
在一些实施方式中，基于纳米孔的测序(nSeq)生物芯片接口单元1950親合到nSeq电子模块1960、流体控制模块1970、化学存储和流体I/0连接模块1980以及nSeq流体控制和样本I/O连接模块1990。nSeq电子模块1960控制核酸模块的分布，控制纳米流体通道的流速率，收集测量数据以及向计算、通信和控制单元输出数据。
在一些实施方式中，流体控制模块1970经由缓冲器入口/出口连接器和片上或片外微栗和微阀门的使用来控制化学存储和nSeq生物芯片之间的流体流。化学存储和流体I/O连接模块1980能够在需要时向nSeq生物芯片供应化学药品，并且还能够用作化学和/或生物废品存储器。nSeq流体控制和样本I/O连接模块1990能够控制nSeq生物芯片中的流体和样本流，以及控制nSeq生物芯片的样本入口和出口。例如，返回参照图10B，如果人们希望在测量腔室#11处执行检测，则用于分支#1的缓冲器出口将被打开，而所有的其他缓冲器出口都被关闭。结果，流体将从样本入口流向分支#1，并且与沿着微流体通道的样本引导电极同步工作来向测量腔室#11提供样本。
B、软件架构
图20示出了用于基于纳米孔的测序器的一个实施方式中的操作系统和基因分析软件的软件和相关硬件部件的高级结构。所示出的软件架构中的各种逻辑处理模块可以由用于执行嵌入在计算机可读介质中的指令的处理设备(诸如图19中的便携式计算系统1910)来实现。计算机可读介质包括用于提供(S卩，存储和/或传送)计算机(例如，服务器、个人计算机、网络设备、个人数字助理、制造工具、具有一个或多个处理器组的任何设备等)可访问形式的信息的任何机构。例如，计算机可读介质包括可记录/不可记录媒体(例如，只读存储器(ROM)；随机存取存储器(RAM)；磁盘存储媒体；光存储媒体；闪存设备等)等。
如上面提到的，操作系统2010被安装在计算、通信和控制单元中。操作系统2010可以包括WindowS、LinUX或者适用于计算设备的任何操作系统。除了安装在计算、通信和控制单元中的操作系统2010之外，基因分析软件还包括五个处理模块，即图形用户接口(GUI)2020、数据观察器2030、基因数据分析器接口2040、基因数据分析器2050和基因数据库2060。操作系统2010、上面的处理模块2020-2060和其他硬件部件之间的交互的一些实施方式将在下面参照图20进行讨论。
在一些实施方式中，基因数据分析器接口2040用作基因分析软件架构中的数据流控制单元。在从输入设备获得了命令和/或输入数据之后，操作系统2010通过基因数据分析器接口2040将该信息传送给基因数据分析器2050。基因数据分析器2050之后相应地进行动作。通过采用恰当的命令(例如，GET、ADD等)，基因数据分析器接口2040控制I/0端口2070与基因数据库2060之间的数据流，从而存储在数据库2060中的数据能够被发送出去或更新。类似地，分析器软件能够经由I/O端口2070和/或输入设备2080被周期性地更新。基因数据分析器接口2040还耦合到nSeq生物芯片接口2090，以监控nSeq生物芯片。nSeq生物芯片的状态被监控并经由分析器接口2040在显示单元(诸如图19中的便携式计算系统1910的显示设备)中被显示。基因数据分析器接口2040还从基因数据分析器2050获取结果，并将它们在显示单元中显示。
在一些实施方式中，基因数据分析器2050是基因分析软件的主要数据分析单元。其从nSeq生物芯片获取测量结果，执行分析并之后将这些结果与存储在数据库2060中的数据进行比较以识别生物主体。分析结果能够在显示单元中被显示，并存储在数据库2060中供后续参考。
基因数据库2060是用于存储现有的生物主体和新发现的核酸序列的数据储藏室。数据观察器2030包括从其他单元中的一些或所有单元中获取数据和信息的软件例程，并将他们在显示识别上进行显示。
因此，已经描述了用于分子的便携式实时分析和识别的方法和装置。根据前面的描述显而易见的是，本发明的各个方面可以至少部分地在软件中得到体现。也就是说，可在计算机系统或其它数据处理系统中响应于其处理器执行存储器中包含的指令序列来实现所述技术。在各种实施方式中，可以将硬连线电路与软件指令结合使用来实施本发明。因此，所述技术并不局限于硬件电路和软件的任何具体组合或局限于由数据处理系统执行的指令的任何特定源。另外，在整个说明书中，将各种功能和操作描述为由软件代码执行或导致，以简化描述。然而，本领域技术人员应当意识到，这种表述的意思是，所述功能是由处理器或控制器对代码的执行引起的。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于保持从带切口的双链DNA解离而成短链的单链DNA顺序的装置，所述装置包括：一个解离区，用于将所述带切口的双链DNA解离成短链的单链DNA；一组通道，包括单个入口和多个出口，其中从所述入口到所述多个出口中的任何一个的通道的长度是每个均相同，并且所述入口在所述离解区的下游；以及在所述通道组内的一组引导电极，其中所述引导电极将每个寡核苷酸分配到所述通道组中的单独通道中。
在一个实施方案中，所述解离区包括用于校直所述带切口的双链DNA的机构。在另一个实施例中，所述机构包括微柱或纳米柱阵列。在进一步的实施方案中，所述机制包括DNA泵。
在一个实施方案中，所述解离区包含加热源。
在一个实施方案中，所述解离区包含解旋酶。
在一个实施例中，所述通道组具有一个H树结构。
在一个实施例中，所述装置在每个所述出口处包括一个井。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于数字PCR的装置，包括：一个解离区，用于将带切口的双链DNA解离成短链的单链DNA；一组通道，包括单个入口和多个出口，其中从所述入口到所述多个出口中的任何一个的通道的长度是每个均相同，并且所述入口在所述离解区的下游；在所述通道组内的一组引导电极，其中所述引导电极将每个寡核苷酸分配到所述通道组中的单独通道中；和一个井阵列，所述井阵列包括两面，其中一面包括多个井，每个井分别连接到所述一组通道的其中一个出口，另外一面包括透明膜。
在一个实施方案中，所述解离区包含用于校直所述带切口的双链DNA的机构。在另一个实施例中，所述机构包括微柱或纳米柱阵列。在进一步的实施方案中，所述机制包括DNA泵。
在一个实施方案中，所述解离区包含加热源。
在一个实施方案中，所述解离区包含解旋酶。
在一个实施例中，所述通道组具有一个H树结构。
在一个实施方案中，本发明提供了一种装载本发明装置的方法，包括用合成油部分地填充该组通道；将液体样品加入所述通道组的入口；以及泵入更多的合成油以将所述液体样品推入井中。
在一个实施方案中，本发明提供了一种纳米孔测序仪，其包括：一个解离区，用于将所述带切口的双链DNA解离成短链的单链DNA；一组通道，包括单个入口和多个出口，其中从所述入口到所述多个出口中的任何一个的每个通道的长度是相同的，并且所述入口在所述离解区的下游；在所述通道组内的一组引导电极，其中所述引导电极将每个寡核苷酸分配到所述通道组中的单独通道中；以及包含多个纳米孔的纳米孔阵列晶片，其中所述多个纳米孔中的每一个分别与所述多个出口中的一个出口连接。
在一个实施方案中，所述解离区包含用于校直所述带切口的双链DNA的机构。
在一个实施方案中，所述解离区包含加热源或解旋酶。
在一个实施例中，所述通道组具有一个H树结构。
在一个实施方案中，本发明提供了一种基于纳米缝的测序方法，包括：在便携式分子分析仪中获得纳米缝测序芯片的测量数据，所述测量数据与输入到所述便携式分析仪的分子样品相关；分析测量数据以识别样品中的分子，基于纳米缝的测序芯片被配置为测量所述分子样品的一个或多个电特性，并且包括具有多个纳米缝的纳米缝阵列晶片，每个纳米缝包括至少一对嵌入式感应电极，每对所述嵌入式感应电极位于所述纳米缝的相对侧。
在一个实施方案中，所述纳米缝测序芯片通过使用所述多个纳米缝中的至少一对嵌入式感应电极检测电阻变化、电容变化、相变或电流变化来获得测量数据。在一个实施例中，所述电流包括隧道电流。
在一个实施方案中，所述多个纳米缝中的每一个纳米缝与一个或多个纳米流体通道和一个或多个微流体通道流体连通。
在一个实施方案中，所述纳米缝测序芯片通过使用所述多个纳米缝中的至少一对嵌入式感应电极执行电压捕获以控制分子通过纳米缝的易位速度来获得测量数据。
在一个实施方案中，所述纳米缝测序芯片通过使用所述多个纳米缝中的至少一对嵌入式感应电极施加交流电以在分子通过纳米缝期间检测电信号。
在一个实施方案中，所述纳米缝测序芯片通过使用纳米缝以外的电极施加电压电势来获得测量数据。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于执行权利要求1的测序方法的便携式分子分析仪，包括：一个用于接收样品的样品入口；一个基于纳米缝的测序芯片，用于测量样品的一个或多个电特性；其中所述基于纳米缝的测序芯片与所述样品入口流体连通，所述基于纳米缝的测序芯片包括具有多个纳米缝的纳米缝阵列晶片，每个纳米缝包括至少一对嵌入式感应电极，其中每对所述嵌入式感应电极位于所述纳米缝的相对侧。
在一个实施方案中，所述多个纳米缝中的每一个纳米缝包括由不同材料制成的多个层。
在一个实施例中，每对所述嵌入式感应电极包括第一电极和第二电极，所述第一和第二电极处于所述纳米缝内相同深度。
在一个实施例中，所述多个嵌入式感应电极由所述至少一个纳米缝内至少两个层组成。
在一个实施例中，所述多个嵌入式感应电极是用于检测至少一个纳米缝中的电阻变化、电容变化、相位变化或电流变化。
在一个实施例中，所述电流包括隧道电流。
在一个实施方案中，所述便携式分子分析仪还包括：一个置于所述多个纳米缝中的至少一个纳米缝上方的顶部电极，一个置于所述至少一个纳米裂缝下方的底部电极，其中所述至少一个纳米缝提供了用于顶部电极和底部电极之间的电连通的路径。
在一个实施例中，底部电极或顶部电极与一个集成电路电连通。
在一个实施例中，所述集成电路包括电压偏置方案或电流感测电路。
在一个实施方案中，所述基于纳米缝的测序芯片包括具有多个纳米缝的纳米缝阵列晶片，每个纳米缝与一个或多个纳米流体通道和一个或多个微流体通道流体连通。
在一个实施方案中，所述一个或多个微流体通道包括用于在所述一个或多个微流体通道内引导样品的引导电极，或所述一个或多个纳米流体通道包括用于在所述一个或多个纳米流体通道内引导样品的引导电极。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于执行测序方法的便携式分子分析仪，包括：一个用于接收样品的样品入口；一个用于测量样品的一个或多个电特性的基于纳米孔测序芯片；其中所述基于纳米孔测序芯片与所述样品入口流体连通，所述基于纳米孔测序芯片包括一个具有多个纳米孔的纳米孔阵列晶片，每个纳米孔包括至少一对嵌入式感测电极，其中每对所述嵌入式感测电极位于所述纳米孔的相对侧。
在一个实施方案中，所述基于纳米孔的测序芯片是：一个基于纳米孔测序芯片，包括：第一组的一个或多个样品引导电极，用于将样品引导至测量室；第二组的一个或多个样品引导电极，用于将样品引导离开测量室；一个包括多个纳米孔的纳米孔阵列晶片；一个置于纳米孔阵列晶片顶侧的顶部晶片；一个置于纳米孔阵列晶片底侧的底部晶片；一个或多个由顶部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的纳米流体通道；一个或多个由底部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的微流体通道；以及多个测量室，其中所述多个测量室中的每一个测量室包括一个纳米孔，一个顶部驱动电极和一个底部驱动电极；或一种基于纳米孔测序芯片，包括：一个纳米孔阵列晶片，所述纳米孔阵列晶片包括两层导电材料包夹着一层介电材料和多个完全穿过所述纳米孔阵列晶片厚度的纳米孔；一个置于纳米孔阵列晶片顶侧的顶部晶片；一个置于纳米孔阵列晶片底侧的底部晶片；一个或多个由顶部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的纳米流体通道；一个或多个由底部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的微流体通道；其中，在所述两层导电材料之间施加AC感应电流，以检测通过所述多个纳米孔的分子。
应当意识到，整个说明书中提及的“一个实施方式”或“实施方式”意味着结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，应当强调或者应当意识到，在本说明书的各个部分中，对“一些实施方式”或“一个实施方式”或“可替代实施方式”的两次或更多次提及并非必须都参考同一实施方式。另外，特定的特征、结构或特性可以被组合为适用于本发明的一个或多个实施方式。另外，虽然已经就几个实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员将意识到，本发明并不局限于所描述的实施方式。本发明的实施方式能够用位于所附权利要求的范围内的修改和替换来实践。因此，说明书和附图应当被认为是说明性的而非用于限制本发明。

Claims (21)

1.一个基于漏斗状纳米孔的测序方法，包括：
a.在便携式分子分析仪中获得漏斗状纳米孔测序芯片的测量数据，所述测量数据与输入到所述便携式分析仪的分子样品相关；以及
b.分析测量数据以识别样品中的分子，
基于漏斗状纳米孔的测序芯片被配置为测量所述分子样品的一个或多个电特性，并且包括具有多个漏斗状纳米孔的漏斗状纳米孔阵列晶片，每个漏斗状纳米孔包括至少一对嵌入式感应电极，每对所述嵌入式感应电极位于所述漏斗状纳米孔的相对侧。
2.根据权利要求1所述的测序方法，所述漏斗状纳米孔测序芯片通过使用所述多个漏斗状纳米孔中的至少一对嵌入式感应电极检测电阻变化、电容变化、相变或电流变化来获得测量数据。
3.根据权利要求2所述的测序方法，所述电流包括隧道电流。
4.根据权利要求1所述的测序方法，所述多个漏斗状纳米孔中的每一个漏斗状纳米孔与一个或多个纳米流体通道和一个或多个微流体通道流体连通。
5.根据权利要求1所述的测序方法，所述漏斗状纳米孔测序芯片通过使用所述多个漏斗状纳米孔中的至少一对嵌入式感应电极执行电压捕获以控制分子通过漏斗状纳米孔的易位速度来获得测量数据。
6.根据权利要求1所述的测序方法，所述漏斗状纳米孔测序芯片通过使用所述多个漏斗状纳米孔中的至少一对嵌入式感应电极施加交流电以在分子通过漏斗状纳米孔期间检测电信号。
7.根据权利要求1所述的测序方法，所述漏斗状纳米孔测序芯片通过使用漏斗状纳米孔以外的电极施加电压来获得测量数据。
8.根据权利要求1所述的测序方法，所述电特性包括样品内分子的开启电压、电导或电流中的一种或多种。
9.一种用于执行权利要求1的测序方法的便携式分子分析仪，包括：
a.一个用于接收样品的样品入口；
b.一个基于漏斗状纳米孔的测序芯片，用于测量样品的一个或多个电特性；
其中所述基于漏斗状纳米孔的测序芯片与所述样品入口流体连通，所述基于漏斗状纳米孔的测序芯片包括具有多个漏斗状纳米孔的漏斗状纳米孔阵列晶片，每个漏斗状纳米孔包括至少一对嵌入式感应电极，其中每对所述嵌入式感应电极位于所述漏斗状纳米孔的相对侧。
10.根据权利要求9所述的便携式分子分析仪，所述多个漏斗状纳米孔中的每一个漏斗状纳米孔包括由不同材料制成的多个层。
11.根据权利要求9所述的便携式分子分析仪，每对所述嵌入式感应电极包括第一电极和第二电极，所述第一和第二电极处于所述漏斗状纳米孔内相同深度。
12.根据权利要求9所述的便携式分子分析仪，所述多个嵌入式感应电极由所述至少一个漏斗状纳米孔内至少两个层组成。
13.根据权利要求9所述的便携式分子分析仪，所述多个嵌入式感应电极是用于检测至少一个漏斗状纳米孔中的电阻变化、电容变化、相位变化或电流变化。
14.根据权利要求13所述的便携式分子分析仪，所述电流包括隧道电流。
15.根据权利要求9所述的便携式分子分析仪，所述便携式分子分析仪还包括：一个置于所述多个纳米缝中的至少一个漏斗状纳米孔上方的顶部电极，一个置于所述至少一个漏斗状纳米孔下方的底部电极，其中所述至少一个漏斗状纳米孔提供了用于顶部电极和底部电极之间的电连通的路径。
16.根据权利要求15所述的便携式分子分析仪，所述底部电极或顶部电极与一个集成电路电连通。
17.根据权利要求16所述的便携式分子分析仪，所述集成电路包括电压偏置方案或电流感测电路。
18.根据权利要求9所述的便携式分子分析仪，所述基于漏斗状纳米孔的测序芯片包括具有多个漏斗状纳米孔的漏斗状纳米孔阵列晶片，每个漏斗状纳米孔与一个或多个纳米流体通道和一个或多个微流体通道流体连通。
19.根据权利要求9所述的便携式分子分析仪，所述一个或多个微流体通道包括用于在所述一个或多个微流体通道内引导样品的引导电极，或所述一个或多个纳米流体通道包括用于在所述一个或多个纳米流体通道内引导样品的引导电极。
20.一种用于执行测序方法的便携式分子分析仪，包括：
a.一个用于接收样品的样品入口；
b.一个用于测量样品的一个或多个电特性的基于纳米孔测序芯片；
其中所述基于纳米孔测序芯片与所述样品入口流体连通，所述基于纳米孔测序芯片包括一个具有多个纳米孔的纳米孔阵列晶片，每个纳米孔包括至少一对嵌入式感测电极，其中每对所述嵌入式感测电极位于所述纳米孔的相对侧。
21.根据权利要求20所述的便携式分子分析仪，所述基于纳米孔的测序芯片是：
i.一个基于纳米孔测序芯片，包括：
第一组的一个或多个样品引导电极，用于将样品引导至一个测量室；
第二组的一个或多个样品引导电极，用于将样品引导离开所述测量室；
一个包括多个纳米孔的纳米孔阵列晶片；
一个置于纳米孔阵列晶片顶侧的顶部晶片；
一个置于纳米孔阵列晶片底侧的底部晶片；
一个或多个由顶部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的纳米流体通道；
一个或多个由底部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的微流体通道；以及
多个测量室；
其中所述多个测量室中的每一个测量室包括一个纳米孔，一个顶部驱动电极和一个底部驱动电极；
ii.一种基于纳米孔测序芯片，包括：
一个纳米孔阵列晶片，所述纳米孔阵列晶片包括两层导电材料包夹着一层介电材料和多个完全穿过所述纳米孔阵列晶片厚度的纳米孔；
一个置于纳米孔阵列晶片顶侧的顶部晶片；
一个置于纳米孔阵列晶片底侧的底部晶片；
一个或多个由顶部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的纳米流体通道；
一个或多个由底部晶片和纳米孔阵列晶片限定而成的微流体通道；
其中，在所述两层导电材料之间施加AC感应电流，以检测通过所述多个纳米孔的分子。
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