CN110169977A - 促进LncMAAT基因表达的应用 - Google Patents

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CN110169977A CN201910268444.6A CN201910268444A CN110169977A CN 110169977 A CN110169977 A CN 110169977A CN 201910268444 A CN201910268444 A CN 201910268444A CN 110169977 A CN110169977 A CN 110169977A
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amyotrophic
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肖俊杰
李进
花雪娇
杨婷婷
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Abstract

本发明涉及一种LncMAAT基因的应用。本发明通过LncRNA芯片技术，qRT‑PCR技术发现在多种肌肉萎缩模型中，包括失神经性肌萎缩、饥饿性肌萎缩、血管紧张素II诱导的肌萎缩、过氧化氢诱导的肌萎缩和TNFa诱导的肌萎缩中，LncMAAT表达明显下降，进一步的功能性实验发现促进LncMAAT基因的表达可以治疗多种肌肉萎缩的作用。据此，可将LncMAAT应用于肌肉萎缩的临床诊断或开发抑制肌肉萎缩的药物。

Description

促进LncMAAT基因表达的应用
技术领域
本发明涉及一种促进LncMAAT基因表达在制备治疗肌萎缩药物中的应用。
背景技术
肌肉萎缩是一种严重危害人类健康的疾病，是肌肉活动功能减退的一种反应。失神经性肌萎缩、饥饿性肌萎缩、血管紧张素II诱导的肌萎缩等是临床常见的肌萎缩类型。失神经肌萎缩主要特点是神经轴突损伤后，使靶源性神经影响因子不能进行逆行输送，导致神经元缺乏营养而出现萎缩。饥饿引起的肌肉萎缩中，自噬发挥着至关重要的作用，目前有研究表明，一些自噬相关基因的表达，如Atg7、Atg5及营养缺失自噬因1，能够导致肌肉萎缩，改变自噬相关基因的表达能够引起肌肉功能的紊乱。血管紧张素II对于骨骼肌损伤的影响主要体现在改变酶活性，细胞的氧化活性，基因水平的改变，最终导致肌肉重量的减轻，例如杜氏肌营养不良症。
肌萎缩早期临床症状及辅助检查不是很明显，后期主要表现为运动终板丧失、肌原纤维蛋白含量下降，超微结构改变主要表现为肌纤维排列紊乱、核固缩、线粒体肿胀变性。为防止肌肉萎缩，目前临床上的治疗方式主要有运动疗法和营养疗法，但治疗效果不佳。因此，探索肌肉萎缩的发生机制，从分子水平寻找早肌萎缩的诊断指标与干预靶点具备重要的临床意义。
近年研究发现，非编码RNA多样化的调控了几乎所有基因的表达。LncRNA是一类转录本超过200nt的RNA分子，不编码蛋白，而是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控及转录后调控等多层面上调控基因表达。既往研究表明，LncRNA在肌肉生长和分化中也起着重要作用。如Lnc-mg促进肌细胞再生；Lnc-YY1通过转录因子YY1促进肌肉细胞分化和再生；在肌细胞分化和再生过程中Lnc-Dum通过和Dumts相互作用调节Dppa2蛋白的表达，在失神经肌萎缩中，长链非编码RNA如：Meg3、H19及Neat1的表达也有明显变化，具体机制尚不清楚。在此之前朱大海等在2014年建立了一种涉及Lnc-RAM在治疗肌肉疾病中的用途，参见中国专利CN104189921A。具体地，本发明涉及Lnc-RAM在制备治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和横纹肌肉瘤的药物中的用途，本发明还涉及Lnc-RAM制备促进肌肉干细胞分化的药物中的用途，制备促进成纤维细胞转变为成肌细胞试剂及药物中的用途。目前尚无其他关于Lnc-RAM对肌肉萎缩诊断与治疗的发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进LncMAAT基因表达在制备治疗肌萎缩药物中的应用。
所述的肌萎缩为：失神经性肌萎缩、饥饿性肌萎缩、血管紧张素II诱导的肌萎缩、过氧化氢诱导的肌萎缩和TNFa诱导的肌萎缩。
该发明中LncMAAT是一种对肌肉萎缩有调控作用的长链非编码RNA，为一段3374bp长度的核苷酸序列。所描述的LncMAAT序列如下：
制备具有治疗不同类型肌萎缩靶向药物，该药物的主要成分为LncMAAT表达的激动剂，所述激动剂能够促进细胞和组织中LncMAAT的表达、能够维持细胞和组织中LncMAAT的稳定性、能够提高细胞和组织中LncMAAT的活性或能够增加细胞或者组织中LncMAAT的有效作用时间；激动剂选自以下组:蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体,最终激动剂疗效为能促进细胞或组织内的LncMAAT的表达量为准。
在2014年，朱大海等建立了一种涉及Lnc-RAM在治疗肌肉疾病中的用途(公开号：CN104189921A)，继而申请获批了Lnc-RAM应用于制备肌肉损伤和横纹肌肉瘤的药物的专利许可。此次基于LncMAAT这个创新性的发现，拟开发用于肌萎缩的LncMAAT相关的诊断工具和靶向药物。
本发明通过LncRNA芯片技术，qRT-PCR技术发现在多种肌肉萎缩模型中，包括失神经性肌萎缩、饥饿性肌萎缩、血管紧张素II诱导的肌萎缩、过氧化氢诱导的肌萎缩和TNFa诱导的肌萎缩中，LncMAAT表达明显下降，进一步的功能性实验发现促进LncMAAT基因的表达可以治疗多种肌肉萎缩的作用。据此，可将LncMAAT应用于肌肉萎缩的临床诊断或开发抑制肌肉萎缩的药物。
附图说明
图1为各个动物肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达量下降。(a)切神经(Den)导致的肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达下降；(b)血管紧张素II(AngII)诱导的肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达下降；(c)饥饿(Fasting)诱导的肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达下降。*，p<0.05。
图2为各个细胞水平肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达量下降。(a)血管紧张素II(AngII)诱导的的肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达下降；(b)过氧化氢(H2O2)诱导的的肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达下降。(c)肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导的肌肉萎缩模型中，LncMAAT的表达下降。*，p<0.05，**，p<0.01。
图3为增加LncMAAT的表达能够抑制细胞水平肌肉萎缩的发生。(a)增加LncMAAT的表达能够抑制血管紧张素II(AngII)诱导的的肌肉萎缩的发生；(b)增加LncMAAT的表达能够抑制过氧化氢(H2O2)诱导的的肌肉萎缩的发生；(c)增加LncMAAT的表达能够抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导的肌肉萎缩的发生。*，p<0.05，**，p<0.01。标尺100μm。
图4为增加LncMAAT的表达能够抑制切神经诱导的肌肉萎缩的发生。a为增加LncMAAT的表达能够减缓肌肉重量的减轻；b为增加LncMAAT的表达能够减缓肌纤维变小；c为增加LncMAAT的表达能够抑制肌肉萎缩特异性泛素化酶(Atrogin-1和MuRF-1)的升高。
具体实施方式
实施例一：参见图1—图4，以下结合具体实施例,来进一步说明本发明的技术方案。应理解,以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。
1.肌细胞培养：细胞培养在10％FBS+1％PS的高塘培养基中。进行分化为肌管细胞时，更换为分化培养基，即含2％马血清+1％PS的高糖培养基，分化4-5天。
2.肌萎缩模型建立：在分化好的肌管细胞中，分别用分化培养基配置500nMAngII或100ng/ml TNF-α或400μM H2O2，孵育24h或48h。
(1)切神经诱导的肌肉萎缩模型，即C57BL/6小鼠切除坐骨神经中断，对照组进行相同的操作，但不切断神经。
(2)血管紧张素II诱导的肌肉萎缩模型，即C57BL/6小鼠植入含有AngII(2μg/μL)的minipump(1.5μg/kg/min，7day)，对照组进行相同的操作，但minipump不含有AngII。
(3)饥饿诱导的肌肉萎缩模型，即将C57BL/6小鼠剥夺食物，给予正常饮水48小时，对照组正常饲养。
3.细胞和组织RNA提取：利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取细胞核组织中的总RNA。采用华大公司设计的qPCR Primer，利用SYBR法进行检测LncMAAT，MuRF-1和Atrogin-1的相对表达量。以18S作为内参引物，采用2-ΔΔCt法进行计算。
4.肌萎缩细胞LncMAAT过表达病毒干预：细胞用的LncMAAT过表达质粒由上海捷瑞公司合成。利用捷瑞公司合成的LncMAAT过表达质粒进行慢病毒包装，达到过表达LncMAAT的目的。然后进行各种细胞水平肌肉萎缩模型的保护作用，具体分组为：转染对照组+肌萎缩模型对照组，转染对照组+肌萎缩模型组，转染LncMAAT过表达病毒组+肌萎缩模型对照组，转染LncMAAT过表达病毒组+肌萎缩模型组。
实验结束后，首先免疫荧光染色，采用抗体MF-20(DSHB)，特异性用于标记肌管，便于统计肌管的直径；最后提取肌管细胞的RNA，荧光定量PCR检测肌肉萎缩特异性基因Atrogin-1和MuRF-1的表达变化。从而判断肌肉萎缩是否发生。
5.肌萎缩小鼠LncMAAT过表达病毒干预：将上海捷瑞公司合成的LncMAAT过表达质粒在psPAX2和PMD2.G载体的辅助下包被成慢病毒。计算病毒滴度，以108TU/小鼠将病毒直接注射入腓肠肌，三天后进行肌肉萎缩模型的构建。具体分组为：对照组病毒+肌萎缩模型对照组，对照组病毒+肌萎缩模型组，转染LncMAAT过表达病毒组+肌萎缩模型对照组，转染LncMAAT过表达病毒组+肌萎缩模型组。
实验结束后，分离小鼠的腓肠肌，首先用分析天平分析小鼠腓肠肌的重量的变化；然后取OCT包埋的肌肉样本进行冰冻切片，WGA染色可用于统计肌纤维的大小变化；最后提取腓肠肌组织的RNA，用于荧光定量PCR检测肌肉萎缩特异性基因Atrogin-1和MuRF-1的表达变化。以此来判断肌肉萎缩是否发生。
序列表
<110> 上海大学
<120> 促进LncMAAT基因表达的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3374
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
aggcgggtgg ttttatgaaa cgcaccctga taaaagcgtt tttagtaggc tgtcacatga 60
ttgtcattgt cttggggcgg aggataagca gacgcacaca ctttactgtt gtgactgaaa 120
aggaaattag agataaagtt ctagtatgac attactattc agaattttag catggcatga 180
attaacagcc ttgataaaca gtttctgtag aaaaatggcc tagtaagtaa aaactgagtt 240
gcctctcctg tctgtctgct taggacggac ttggggctga gatggcctgg gtgtactaat 300
tacagggaaa gtaaagtagg gtgcacttgg agggccttga ctctaataac tttccagtct 360
gttagaaata taataaaatg ccttatttat tcattatact ctattgaacg tattagaaag 420
gatatcatat tgtagcattt tgtgaggatg tgccagatac agccatcaca tagcctacct 480
ttagaacaac ctgatgggaa agatgctgtc actaccgttg tgttgcagag gagtcagagc 540
agagcaagag atgggaggta gcctatcctt gctgtagaga tacactctgc catttggctt 600
ctcatttccc aagtatagta attctctaac aaatgctgtc cgcaaatgaa atagggcagc 660
atctgaaaca gttttcttcc ccaatcttcc taaagaaaac acaggattct taatgcatga 720
ctgttagttg attaatggga ctcaaatagt ctgagaagaa gaatgccaac atagtaatta 780
ttaataggta acaatattca aagcattaag aggatatgct tcaagctgag ctacttgctc 840
aaaactgctc attcccttga aagtttgcgt agttttttta tacttgtatt ttgtcatttt 900
gtttttcttt ccatgaagag ctgcttgtga gttttgtcat ttgcctttgc tacttcctag 960
gacaatctct cctgtgttat gtgcattcct gatagaagtg agcatgccct tggttctgtt 1020
cccaagatct aagtcattgt cacagtcata gttggggcct gaaataggaa acatgcatgt 1080
gcctctttct gctctgcagt gtgattccag aacttaaaca cacgcacgca cgcacgcacg 1140
cacgcacgca cgcacgcaca cacacacaca catgcacgca cacataagca cacacactca 1200
cacataaaca cacacacagg catgcatgca cacatacaac cttggtgctc cttggagcac 1260
tggagggcga aatccatgaa aggaatgcct acagttcttt tctcaaggtt gatactatgg 1320
ttatttagag attaaagcca cattccatct tcaactgaat tttgattttc ctctgaggta 1380
aaattggtct aattcagcta ggatcttgac tttgttcttc ttgttatatc tttttctcca 1440
tttctacaat ttgtcacaca ataaagtgat ttcagatttg tttataatcc cttagaagac 1500
ctagcaatgg cagtaccaaa agggatacaa aggtctgaag ttgcaaagta ggaacccagt 1560
agacactgct tgtaaggtag ttaactacat atgcttggtt tgtcagacca gcttcatgtc 1620
gcttatttgt aaaatttgag tatttgcctg atttatatgt aatgtcatag agcatgtaaa 1680
tcatgcattg acttctaaca gcagcctaaa taagtattga aatacttatt tttaaaatgt 1740
atgtgcatat atagtgcaca tcatatattc acagctgctg tatcagtatg cttatccact 1800
cattgttgga tattattatg aagattgtat gttctgtacc gtatagctca gactggtttt 1860
ctctgaaagt gaggcaagtc tgttagtcac taaagagacg ctcctagaat tccgttttgt 1920
gatctctgga tcctttctgt aatgtccatg tattaattta atgcccaaag gagtatctta 1980
agaaattatt acactgtgta caaatattag aaattgctaa cctttaggtc atgcctgtgt 2040
ttcatgacaa aacattggta gtaataaaaa tcgacatgta aagaatcaca gtcatttttc 2100
atggtgcaaa ataaatgtat ggacccattt attctacaat ctctagtagg gagctatact 2160
gcatgtcctt caagttaacg ttattgtgaa tatccatgaa gccttttact tctctattac 2220
caagggccaa aaagggacct cataagagta aatctaaact cataactgct accctttaat 2280
tttaaatgtc aagttgtcaa cctgctaata aattaacgag tcacagaaag atacattctt 2340
gcacagatat ttttagggta gaattatgac ataagtcatg acactccaga ggaatagttt 2400
aaacatctgt taacattcct tttggggaca tgtttaggtc ttagtcattc cagcctcaaa 2460
acatgttatc ttgattgtac ttgtggacat ggtgcagggt agtctagact tggtggagac 2520
tagcatcact tggggtagta gtttaagtgt gggacctcat ccatatagac ttttaggtca 2580
ctggtgggtc tcaggaatta ttgtcactta tcagacaagt gattgcaaag ggaaaatgta 2640
aagcggttgc ttgtaacccc caacttttca ccagtccttc gttatgagtg actgaactga 2700
aatgcacttc tattaatgct cagaccttag cgtgggtttc tacattgctg aaggattcta 2760
gatactggga cacctattaa agtagttcat accgcccact gaggagccac ctcagtggct 2820
gcgtgtttca aagacttact aagacgttag atagctattt ggttaattaa atgcaccatt 2880
ttatatcatc accctttgtg agaagaacat gttaaatatt ccaaacaagc tgagcaaact 2940
ccttgccgcc tcctgttttc aggtggggct tgtttttaaa taaacaactc ttgttctgtg 3000
agggcattat tttttttaaa gtaatagaaa tacaagtttc tactttactg gaatgcaagc 3060
atgtgctaat tctttacata taggcaaatt ttaatataat tcttatgact tggacacaga 3120
gtattatttg aaagccacat agaagaaaca agaatatata gattggtatt ttagtgagtt 3180
taatgaattt agtattatat taaagcaaaa gtccccagct attgatggtt ctccacttaa 3240
gctcttttac tcgtcttcca gaggacccat gtgactcaca actgcctgcc aatccaagtc 3300
caagggattc tagtgccctt ttatagcctc tgtgggctct acattcatgt gtgcaaaccc 3360
acacatggac actt 3374

Claims (2)

1.一种促进LncMAAT基因表达在制备治疗肌萎缩药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，特征在于所述的肌萎缩为：失神经性肌萎缩、饥饿性肌萎缩、血管紧张素II诱导的肌萎缩、过氧化氢诱导的肌萎缩或TNFα诱导的肌萎缩。
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