CN110167349A - 非间充质人肺干细胞及它们用于治疗呼吸疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的实施方案涉及人的间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的非间充质的c‑kit阳性的肺干细胞(非mhLSC)以及它们在治疗和/或预防肺疾病或病症中的治疗用途。本文提供包含非mhLSC的组合物以及制备和利用非mhLSC治疗和/或预防肺疾病或病症的方法。

Description

非间充质人肺干细胞及它们用于治疗呼吸疾病的方法

本申请要求2016年11月2日提交的美国临时专利申请号62/416,562的优先权和利益。这个申请的内容通过引用整体并入本文。

发明背景

每年超过400,000美国人死于某些类型的肺疾病，并且这个数字在世界范围内更大。此外，归因于肺疾病的死亡率目前正在上升。根据美国肺脏协会，预计到2020年，慢性阻塞性肺病(COPD)将成为第三大死因。

肺疾病是肺功能受损的任何疾病或病症。肺疾病可以由长期和/或即时暴露于吸烟、二手烟、空气污染、职业危害如石棉和硅尘、触发肿瘤生长的致癌物、传染物以及过度反应性免疫防御引起。在一段时间内，包括气道和血管的肺组织受损，从而没有足够的健康组织支持充分的气体交换以为体内所有细胞提供足够的氧气用于基本功能。实质上，这些人缓慢“窒息”至死。因此，肺疾病可以是威胁生命的疾病或疾病状况。

有许多类型的肺疾病，包括：(A)阻塞性肺病如哮喘和COPD，其包括慢性支气管炎和肺气肿。这些全部影响人的气道并限制或阻断空气进出肺部；(B)传染性疾病如肺炎、流感、呼吸道合胞病毒(RSV)和结核病(TB)。细菌或病毒引起这些疾病，这些疾病还可以影响肺周围的膜(或胸膜)；(C)肺癌，其是特征在于异常细胞的不受控制的生长和扩散的疾病；(D)呼吸衰竭、肺水肿、肺栓塞和肺动脉高压。这些疾病状况由肺中正常气体交换和血流的问题引起；以及(E)肺纤维化和结节病。这些是特征在于肺的硬化和结疤的疾病以及由暴露于有害物质引起职业病，如间皮瘤和石棉沉着病。

目前，肺疾病的所有治疗主要是缓和性的，其中重点是通过症状管理保持生活质量。肺移植是已用尽所有其他可用的治疗但没有改善的患有终末期肺疾病的患者的最后治疗措施。在2005年，美国肺移植的最常见原因是：27％慢性阻塞性肺病(COPD)，包括肺气肿；16％特发性肺纤维化、14％囊性纤维化；12％特发性(以前称作“原发性”)肺动脉高压；5％α1-抗胰蛋白酶缺陷；2％替换已失败的以前移植的肺；以及24％其他原因，包括支气管扩张和结节病。

肺移植或肺的移植是外科手术，其中患者患病的肺部分或全部被来自供体的肺代替。虽然肺移植承担一定的相关风险，但是它们也可以延长预期寿命并提高终末期肺病患者的生活质量。通常，进行心肺联合移植，因为两个器官在物理和功能上都是复杂地相连的，并且双移植大大增加移植的成功率。但是，用于移植的两个或甚至单个器官的可用性非常稀少，因为必须满足对于潜在供体的某些标准，例如供体的健康，大小匹配，捐献的一或多个肺必须足够大以为患者充分供氧，但是足够小以适合受体的胸腔，年龄和血型。结果，患者常常在等待名单上时死亡。

即使对于足够幸运接受移植的那些患者，肺移植患者的平均生存期为约5-10年，与其他类型的器官移植相比这是相对低的；对于肺移植分别为53.4％和28.4％，并且对于心-肺移植分别为46.5％和28.3％(摘自2008OPTN/SRTR Annual Report,US ScientificRegistry of Transplant Recipients的数据)。

有时，肺移植不是可选项(option)。不是所有患有肺疾病的患者都是好肺移植的候选者。有时，尽管患者的呼吸状况很严重，但是某些预先存在的疾病状况可能使人不适合做肺移植。这些疾病状况包括：并发慢性病(例如充血性心力衰竭、肾疾病、肝疾病)；当前的感染，包括HIV和肝炎，当前或近期的癌症，当前使用酒精、烟草或非法药物；年龄；在可接受的重量范围内(明显营养不良或肥胖都与死亡率增加有关)；精神状况；违反医疗指令的历史；以及以前多次失败的肺移植。

此外，对于已进行肺移植的那些患者，可能有与移植相关的其他并发症，包括器官排斥、移植后淋巴增生性病症、归因于免疫抑制剂的淋巴瘤形成、胃肠道炎症以及胃和食道溃疡。

对于，例如，等待名单上的那些患者，特别是不符合肺移植条件的那些患者，使这些患者活下来的补充缓解性治疗的其他解决方案是可取的。

WO 2012/047951中公开了人干细胞以及制备和利用它们的方法，为了所有目的，其整体援引加入本文。使患者脱离肺移植等待名单的额外的解决方案也是可取的。

发明概述

本发明的实施方案涉及人干细胞以及制备和利用它们的方法。

本发明的实施方案是基于c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池(pool)的发现，其由一类细胞非间充质hLSC(非mhLSC)以及另一类细胞间充质样hLSC(ml-hLSC)组成，所述非mhLSC是间充质表位CD44、CD73和CD105阴性的，所述ml-hLSC表达这些表位并分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和成纤维细胞。两种细胞类型均具有组织特异性成体干细胞的特征，即自我更新和克隆形成。

本发明的实施方案提供供体肺短缺的问题以及患有肺疾病或未来有发展肺疾病的风险的对象肺移植不合格的问题的解决方案。具体地，通过将非mhLSC植入缺陷和/或受损的肺来解决问题，以便促进肺修复和再生以及延长对象的寿命，在第一种情况下直至供体肺可用或在第二种情况下尽可能长并具有可接受的生活质量。

因此，在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含：富集的来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞群，其中c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)；以及药学可接受的载体。在一实施方案中，所述药物组合物配制用于肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。在另一实施方案中，肺内施用是气管内或鼻内施用。在进一步的实施方案中，将非mhLSC的群进一步离体扩增。

在另一方面，本发明提供一种制备分离的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中非mhLSC在包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)的c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池中，所述方法包括：从对象获得人肺组织；从来自人肺组织的hLSC池选择非mhLSC；以及在培养基中增殖所述细胞。

在另一方面，本发明提供一种增殖分离的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中非mhLSC在包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)的c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池中，所述方法包括：从来自人肺组织样品的hLSC池选择至少一个非mhLSC；将所述至少一个所选择的非mhLSC引入培养基；以及在培养基中增殖所述至少一个所选择的非mhLSC。

在另一方面，本发明提供一种在有需要的对象中修复和/或再生受损肺组织的方法，所述方法包括：从肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；培养并扩增所述非mhLSC的群；以及以对于修复和/或再生受损的肺组织有效的剂量施用所述提取并扩增的非mhLSC群至对象中的受损肺组织区域。

在另一方面，本发明提供一种在有需要的对象中治疗或预防肺疾病或病症的方法，所述方法包括：从有需要的对象或不同对象获得人肺组织；从所述肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；扩增所述非mhLSC群；以及给有需要的对象施用所述扩增的非mhLSC群。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗和/或预防对象中的肺疾病或病症的组合物，所述组合物包含富集的来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞群，其中所述c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)。在一实施方案中，分离的非mhLSC的富集群还包含肺祖细胞和肺前体细胞。在一实施方案中，所述组合物配制用于肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。在另一实施方案中，肺内施用是气管内或鼻内施用。在进一步的实施方案中，将分离的非mhLSC的富集群进一步离体扩增。

在治疗或预防方法的所有方面的一实施方案中，非mhLSC群源自需要治疗或预防的对象。在一实施方案中，非mhLSC群是自体的。

在治疗或预防方法的所有方面的一实施方案中，非mhLSC群源自一个对象并施用至另一对象，表示非mhLSC的供体是与非mhLSC的受体不同的人。对于这样的移植，需要理解供体和受体应当是抗原匹配的，并且匹配标准和方法是本领域公知的。供体非mhLSC理想情况下应当是同种异体的，并且HLA类型与受体匹配。

因此，在一实施方案中，本发明提供一种治疗或预防有需要的对象中的肺疾病或病症的方法，所述方法包括从第一对象获得肺组织样品；从肺组织样品提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；扩增非mhLSC群；以及给第二对象施用非mhLSC群，非mhLSC在肺中定殖(take up residence)并修复/重建/和/或生成第二对象肺中的肺细胞和组织。在这种治疗方法的一实施方案中，第二对象的至少一种HLA类型与第一对象(非mhLSC的供体)匹配。

在所述治疗或预防方法的所有方面的一实施方案中，施用的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群修复、重建或生成对象肺中的肺上皮、肺血管/肺内皮和肺泡。

在所述治疗或预防方法的所有方面的另一实施方案中，施用的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群恢复对象肺中的结构和功能完整性。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，肺组织来自人。在所述组合物和方法的所有方面的另一实施方案中，人肺组织是成体肺组织。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，肺组织样品在选择非mhLSC之前是低温保存的。还可以在培养基中扩增之前对来自肺组织样品的分离的非mhLSC进行低温保存以及对扩增的非mhLSC进行低温保存。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，利用抗c-kit抗体进行非mhLSC的选择。在所述组合物和方法的所有方面的另一实施方案中，非mhLSC的选择进一步包括对间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记负向选择。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，非mhLSC群可以分化为肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞或其组合。在进一步的实施方案中，非mhLSC群是自我更新和克隆形成性的。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，通过流式细胞术选择c-kit阳性细胞。

在所述组合物和方法的所有方面的另一实施方案中，通过用缀合至珠的c-kit抗体免疫磁性选择来选择非mhLSC。

在本文所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞群可以低温保存。

在本文所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，肺疾病和病症是慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)或进行性肺纤维化(PPF)的一种或多种。

在所述治疗或预防方法的所有方面的一实施方案中，治疗方法进一步包括施用至少一种治疗剂，例如，降低肺动脉高压的治疗剂。

在所述治疗或预防方法的所有方面的一实施方案中，治疗方法进一步包括在施用富含非mhLSC的群之前选择患有肺部病症的对象。

在所述治疗或预防方法的所有方面的一实施方案中，治疗方法进一步包括在施用非-mhLSC之前选择需要恢复受损肺的结构和功能完整性的对象。

在所述治疗或预防方法的所有方面的一实施方案中，治疗方法进一步包括在施用非mhLSC之前选择需要治疗、预防或者修复或重建或生成肺血管或肺上皮、肺内皮或肺泡的对象。对象如吸烟和/或已暴露于石棉的那些有高风险发展各种肺疾病，他们会是所述方法的候选人以防止他们的肺疾病发展还有一旦疾病已开始防止疾病进展。

在本文所述治疗方法的所有方面的一实施方案中，施用是肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。

在本文所述治疗方法的所有方面的一实施方案中，肺内施用是气管内或鼻内施用。

附图说明

图1示出肺样品。将对照肺(左上)和IPF/PPF肺(左下)的样本酶促消化以获得单细胞悬浮液。中密度细胞含有人肺干细胞。

图2A示出人肺干细胞(hLSC)类别。点图说明hLSC的区室含有不表达表位CD44/CD73/CD105的非间充质c-kit阳性细胞(非mhLSC)群和一类表达CD44/CD73/CD105的c-kit阳性细胞，即，间充质样hLSC(ml-hLSC)。这两个细胞群存在于对照、IPF/PPF和COPD肺中。

图2B示出非mhLSC和ml-hLSC克隆。来自对照和IPF/PPF非mhLSC的克隆表现出干细胞形成的集落的典型特征。如右侧第三和第四克隆所示，它们具有紧凑的圆形轮廓，仅偶尔有不规则形状。但是，ml-hLSC仅生成具有屈光边缘(refractive edge)的非圆形不规则形状的克隆。

图2C示出非mhLSC和ml-hLSC克隆的免疫组织化学。圆形克隆由c-kit强阳性、高核质比且CD44/CD73/CD105阴性的未分化的细胞组成(左图)。非圆形克隆的特征在于c-kit弱标记、低核质比且CD44/CD73/CD105阳性的细胞(中图和右图)。

图2D示出对照、IPF/PPF和COPD肺中非mhLSC和ml-hLSC的比例；数据为平均值±SD。

图3示出侵袭测定。利用matrigel包被的transwell室(见图3顶部方案)，进行细胞侵袭测定以确定暴露于胎牛血清(FBS)的分化对照以及IPF/PPF非mhLSC和ml-hLSC的侵袭能力。IPF/PPF ml-hLSC以非常高的速率侵袭基底膜matrigel。迁移的ml-hLSC获得成肌纤维细胞表型，并且是α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA；右图，红色)和前胶原(未示出)阳性的。

发明详述

本发明的实施方案基于c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池的发现，其由间充质表位CD44、CD73和CD105阴性的一类细胞非间充质hLSC(非mhLSC)以及表达表位CD44、CD73和CD105的另一类细胞间充质样hLSC(ml-hLSC)组成。两种细胞类型均具有组织特异性成体干细胞的特征，即自我更新和克隆形成。

相关地，克隆的非mhLSC分化为肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，而克隆的ml-hLSC不获得上皮和血管细胞谱系。反而，克隆的ml-hLSC分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和成纤维细胞。重要的是，功能性非mhLSC的亚群(subset)存在于患病的肺中，并且可以在体外收获并繁殖这些细胞。在一实施方案中，可以进行利用非mhLSC的自体细胞疗法以逆转肺疾病的毁灭性结果如特发性肺纤维化/进行性肺纤维化(IPF/PPF)和慢性阻塞性肺病(COPD)。

众所周知，因为其特性，干细胞产生身体的所有细胞和组织。因此，干细胞可以用来修复或加速修复受损和/或有缺陷的肺。如果可以获得足够量的成体肺干细胞(LSC)，这个量的成体(LSC)可以用来通过在肺中构建新组织修复受损和/或有缺陷的肺。在有缺陷和/或受损的肺中，LSC可能很少或不存在。因为成体LSC自我更新，植入的成体LSC会定殖(colonize)并填充缺陷和/或受损的肺中的生态位(niche)。通过克隆、自我更新和能够分化为肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞或其组合，植入的非mhLSC还会分裂并分化以产生所有新肺细胞和组织。因此，分离的非mhLSC群或包含分离的非mhLSC群的组合物可以用于治疗或预防对象中的肺疾病。

因此，通过将非mhLSC植入对象的缺陷和/或受损的肺以促进从头肺修复和再生来解决患有肺疾病的对象在供体肺可用之前或因为肺移植不合格而过早死亡的问题。从头肺修复和再生可以在第一种情况下延长对象的寿命直至供体肺可用，或者在第二种情况下尽可能延长对象的寿命并具有可接受的生活质量。

因此，在一实施方案中，本发明提供来自人肺组织样品的称作非mhLSC的分离的c-kit阳性肺干细胞的富集群，其中所述c-kit阳性肺干细胞间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记是阴性的。在另一实施方案中，分离的细胞群充分富集(substantiallyenriched)了c-kit阳性肺细胞，其主要包含LSC(≥70％)。

在一实施方案中，充分富集了非mhLSC的分离的细胞群还包含非常少量的肺祖细胞和肺前体细胞。

在一实施方案中，本文提供一种药物组合物，其包含：来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞的富集群，其中所述c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)；以及药学可接受的载体。在一实施方案中，所述药物组合物配制用于肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。在另一实施方案中，肺内施用是气管内或鼻内施用。在进一步的实施方案中，将非mhLSC群进一步离体扩增。

在一实施方案中，本文提供一种用于治疗和/或预防对象中的肺疾病或病症的组合物，所述组合物包含来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞的富集群，其中所述c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)。在一实施方案中，分离的非mhLSC的富集群还包含肺祖细胞和肺前体细胞。在一实施方案中，所述组合物配制用于肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。在另一实施方案中，肺内施用是气管内或鼻内施用。在进一步的实施方案中，将分离的非mhLSC的富集群进一步离体扩增。在这种组合物的另一实施方案中，所述组合物进一步包含药学可接受的载体。

在一实施方案中，本发明提供一种制备分离的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中非mhLSC在包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)的c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)的池中，所述方法包括：从对象获得人肺组织；从来自人肺组织的hLSC池选择非mhLSC；以及在培养基中增殖所述细胞。在另一实施方案中，非mhLSC数比所选择的初始量增加至少两倍，优选多于两倍。

在一实施方案中，本发明提供一种从人肺组织样品获得分离的c-kit阳性肺干细胞的富集群的方法，其中c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)，所述方法包括低温保存获得自对象的肺组织样本；稍后解冻低温保存的样本；从肺组织样本选择至少一个c-kit阳性非mhLSC；以及在培养基中增殖所选非mhLSC，从而非mhLSC数比所选的初始量至少加倍，优选多于加倍。

在一实施方案中，本发明提供一种增殖分离的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中非mhLSC在包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)的c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池中，所述方法包括：从来自人肺组织样品的hLSC池选择至少一个非mhLSC；将所述至少一个所选择的非mhLSC引入培养基；以及在培养基中增殖所述至少一各选择的非mhLSC。在一实施方案中，非mhLSC数比所选的初始量增加至少两倍，优选多于两倍。

在另一实施方案中，本发明提供使用这种来自肺组织的分离的非mhLSC群或者使用包含来自肺组织的分离的非mhLSC的富集群的药物组合物的方法。例如，分离的非mhLSC群可以用于修复、再生和/或治疗肺疾病和病症。

本公开的发明人已发现c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池中存在的CD44/CD73/CD105阴性的非间充质人肺干细胞(非mhLSC)能够分化为肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞。c-kit阳性的人肺干细胞(hLSC)池中发现的另一类细胞包含CD44/CD73/CD105阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)。CD73阴性的非mhLSC可能具有较高的形成肺特异性细胞类型的能力，即，肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，防止会在患病的肺中产生进一步损伤的细胞的产生。在这方面，1型和2型肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞形成器官的气体交换单元。不像非mhLSC克隆，克隆的ml-hLSC不获得上皮和血管谱系。反而，克隆的ml-hLSC分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和成纤维细胞。值得注意的是，人的慢性阻塞性肺病(COPD)以及特发性或获得性肺纤维化(PF)的特征在于成纤维细胞积累和组织纤维化。源自对照和患病肺组织的非mhLSC克隆表现出干细胞形成的集落的特征，而源自对照和患病肺组织的ml-hLSC形成非圆形克隆，其特征在于c-kit弱标记、低核质比和CD44/CD73/CD105阳性的细胞。重要的是，非mhLSC和ml-hLSC的比例在对照和患病肺之间显著改变，与对照健康肺组织相比，在患病肺组织中ml-hLSC的量增加而非mhLSC的量减少。此外，来自患病肺的ml-hLSC产生大量的成纤维细胞/成肌纤维细胞，高速侵袭matrigel并获得成肌纤维细胞表型。不希望被任何理论束缚，这些数据表明在肺疾病或病症如COPD、IPF或PPF中，ml-hLSC具有使它们成为肺病理学候选的特征。患有COPD，ml-hLSC的增加和非mhLSC的减少可能减弱COPD肺形成气体交换单元的能力，并且这可能导致肺泡扩增、肺泡壁破坏和呼吸衰竭。相比之下，CD44/CD73/CD105阴性的非mhLSC的圆形克隆由c-kit强阳性的未分化的细胞组成，具有高核质比并大量存在于对照健康肺组织中。因此可以将来自肺组织的分离的非mhLSC群移植或植入受影响/受损的肺用于治疗目的。非mhLSC可以在肺中定殖，生长并分化为肺中通常发现的各种类型的组织，用于恢复并重建受损肺中的肺上皮和肺血管等，例如，上皮、血管、肺泡、分泌细胞等。目的是取代一些由于受影响的肺中的疾病受损的肺组织。取代肺组织用来补充受影响的对象中现有或剩余的肺组织，从而总的来说有足够的组织用于充分的气体交换以维持该对象的生命。

成体干细胞移植已成为一种新的选择以刺激受损组织和器官的修复。在过去十年中，动物和人中的一些研究已记录成体骨髓来源的干细胞，即造血干细胞，分化为非造血细胞类型的扩展的集合(repertoire)的能力，包括脑、骨骼肌、软骨细胞、肝、内皮和心脏。但是，肺和相关呼吸结构对这类治疗方式仍相对抵抗。但是，有报道表明间充质干细胞可以用于肺中的干细胞疗法，并且造血干细胞可以在肺移植中与间充质干细胞共施用。例如，已描述作为非造血细胞从胎肺CD34+细胞分离的间充质细胞的共移植增强造血干细胞的植入(Noort et al.,Exp Hematol 2002；30:870-78)。

几个其他报道也描述了在动物模型中源自骨髓群的间充质干细胞和非造血干细胞在肺疗法中的用途(Krause DS et al.,Cell 2001,105:369-377；Kotton DN,et al.,Development 2001,128:5181-5188；Ortiz LA,et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2003,100:8407-8411；Theise ND et al.,Exp Hematol 2002,30:1333-1338；Abe S et al.,Cytotherapy 2003,5:523-533；Aliotta JM et al.,Exp Hematol 2006,34:230-241；Rojas Metal.,Am J Respir Cell Mol Biol 2005,33:145-152；Gupta N et al.,JImmunol 2007；179:1855-1863；美国专利申请20090274665)。

虽然有证据支持一些类型的骨髓源性干细胞，即间充质干细胞产生肺组织的能力，但是其他报道不能检测到用骨髓细胞显著再生肺组织(Kotton DN et al.,Am JRespir Cell Mol Biol 2005；33:328-334；Wagers AJ,et al.,Science 2002,297:2256-2259；Chang JC,et al.Am J Respir Cell Mol Biol 2005,33:335-342)。此外，其他报道已描述通过鼻内途径施用的源自骨髓的造血干细胞导致肺泡巨噬细胞，并且这个群没有转分化为呼吸道上皮细胞(Fritzell JA et al.,Am J Respir Cell Mol Biol 2009,40:575-587)。

WO 2012/047951公开了肺中正常(legitimate)干细胞的存在以及这些肺干细胞(LSC)在肺疗法中的用途。本发明的优点是有也可以用于自体或同种异体肺疗法的LSC的亚群。使用自体细胞会大大增加疗法的成功率。手术切除患者肺的一部分，例如，在活组织检查期间。只要1立方厘米就足够了。处理组织块以从结缔组织释放单细胞。利用干细胞标记c-kit作为干细胞的指示，选择c-kit阳性细胞。可以将这些c-kit阳性LSC对间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记进一步负向选择。然后将非mhLSC体外扩增以获得治疗需要的足够数量的细胞。当有足够细胞时，收获细胞并注射回相同患者或与非mhLSC的供体遗传匹配的患者。在每个过渡步骤，例如，选择和扩增之间，或者扩增和植入之间，可以将非mhLSC任选地低温保存。在一实施方案中，患者取回已选择并体外扩增的患者自己的非mhLSC。在另一实施方案中，患者获得源自遗传匹配供体的非mhLSC。在一些实施方案，这个方法还可以延伸至具有肺的任何哺乳动物，例如，猫、狗、马、猴等。

因此，本发明提供一种在有需要的对象中治疗或预防肺疾病或病症的方法，所述方法包括：从有需要的对象或不同对象获得人肺组织；从所述肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；扩增所述非mhLSC群；以及给有需要的对象施用所述扩增的非mhLSC群。

在一实施方案中，这里提供一种在有需要的对象中治疗和/或预防肺疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用本文所述包含c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞群的组合物。

在另一实施方案中，本发明提供一种在有需要的对象中治疗或预防肺疾病或病症的方法，所述方法包括：从有需要的对象或不同对象获得人肺组织；从所述肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；扩增所述非mhLSC群；以及给有需要的对象施用所述扩增的非mhLSC群用于修复、重建或生成有需要的对象肺中的肺上皮、肺血管/肺内皮和/或肺泡。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗或预防有需要的对象中的肺疾病或病症的方法，所述方法包括从第一对象获得肺组织样品；从所述肺组织样品提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；扩增所述非mhLSC群；以及向第二对象施用所述非mhLSC的扩增群，非mhLSC在肺中定殖并修复、重建和/或生成第二对象肺中的肺细胞和组织。在这个治疗方法的一实施方案中，第二对象的至少一种HLA类型与第一对象(非mhLSC的供体)匹配。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，主要组成分离细胞群的非mhLSC具有自我更新能力和克隆形成性。这表示单个分离的非mhLSC可以分裂产生更多的非mhLSC，在培养物中形成克隆。当在某些条件下刺激时，非mhLSC可以变成定型的(determinate)(即，选择特定细胞谱系分化)并进一步分化为肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞或其组合。当定型和分化时，这些细胞及其子代会表达上皮和血管细胞谱系的特定细胞标记特征。此外，定型的细胞及其子代会丧失c-kit的表达。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，肺组织来自人。在所述组合物和方法的所有方面的另一实施方案中，人是成年人。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，肺组织在选择非mhLSC之前是低温保存的。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，利用针对c-kit的抗体进行非mhLSC的选择。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，针对c-kit的抗体是单克隆抗体。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，针对c-kit的单克隆抗体是针对人c-kit的抗原表位的小鼠单克隆IgG。

在任何所述方法的一实施方案中，针对c-kit的抗体是荧光染料缀合的。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，针对c-kit的抗体与磁性颗粒缀合。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，所述方法进一步包括对于间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记的负向选择。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，c-kit阳性细胞的选择和/或各种谱系标记阴性的细胞的选择通过流式细胞术进行。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，选择通过荧光激活细胞分选术或高梯度磁性选择进行。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，将非mhLSC进一步离体扩增。在所述方法的所有方面的一实施方案中，将非mhLSC进一步体外扩增。目的是具有足够大量的非mhLSC用于植入以确保植入的非mhLSC成功移植至受损肺的生态位中。基本上，必须有足够的细胞在受损肺中生长和增殖以提供修复和/或取代肺的受损部分所需的所有细胞。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，在扩增或增殖步骤之后非mhLSC的数量至少加倍。在所述方法的所有方面的一些实施方案中，由于扩增或增殖，非mhLSC的数量在增殖期结束时增加至少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍或更多倍是可取的。培养物中的细胞数量可以通过本领域已知的任何方法确定，例如，通过利用库尔特计数器确定。这些方法是本领域技术人员公知的。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，在扩增之前将非mhLSC低温保存用于储存。

在所述方法的所有方面的另一实施方案中，为储存目的将扩增的非mhLSC低温保存。当需要时，将冷冻的细胞解冻然后用于植入有需要的对象。

在所述方法的所有方面的一实施方案中，所述方法进一步包括低温保存分离的非mhLSC群。

对于最近诊断患有肺疾病的人，如果获得对象肺的活组织检查样品用于诊断，则可以根据本文所述方法制备非mhLSC群，然后可以将非mhLSC低温保存用于将来在疾病发展到晚期从而这个人需要肺移植的事件中使用。

相似地，有风险发展肺疾病的人可以受益于早期从他们自己的肺组织制备非mhLSC群并低温保存非mhLSC。例如，烟瘾很大的人和以前暴露于石棉的人会受益。这是因为吸烟相关或石棉相关疾病状况的症状出现可能需要10-40年或更长。有风险发展肺疾病或损伤的其他类型的人包括但不限于携带囊性纤维化基因或诊断患有囊性纤维化的婴儿以及部署至战区的现役军事人员。

在治疗方法的所有方面的一些实施方案中，治疗包括对有需要的对象中受损的肺“恢复结构和功能完整性”。

在所述方法的所有方面的其他实施方案中，治疗包括修复受损或不足的肺。在其他实施方案中，治疗包括修复、重建或生成受损肺中的肺上皮、肺内皮和/或肺泡。

恢复或修复不必达到健康人肺的100％。只要对象中的症状有改善，就完成了恢复或修复。熟练的医生能够在治疗之前和之后评价症状的严重程度并基于比较确定是否有改善。通常，对象能够说出症状是否有改善。一些症状的实例包括但不限于呼吸短促、喘息，或声音嘶哑、持续性咳嗽、胸痛或胸部抽紧(tightening in the chest)以及肺中存在液体。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，预防包括减缓归因于疾病(例如COPD、IPF或PPF)的降低的肺功能和完整性。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，非mhLSC群修复、重建或生成肺上皮、肺血管/肺内皮和/或肺泡。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，分离的非mhLSC群进一步基本上是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，治疗和/或预防肺疾病或病症的方法进一步包括施用至少一种治疗剂。这样的治疗剂在理想情况下是用于治疗肺疾病的那些，并且这些是熟练的医生公知的，例如，肺动脉高压或COPD的疗法。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，治疗和/或预防肺疾病或病症的方法进一步包括在施用非mhLSC群之前选择患有肺疾病或病症的对象，例如，患有COPD或间皮瘤的对象。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，治疗和/或预防肺疾病或病症的方法进一步包括在施用非mhLSC之前选择需要恢复受损肺的结构和功能完整性的对象，例如患有结节病的对象。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，治疗和/或预防肺疾病的方法进一步包括在施用细胞之前选择需要治疗、预防或者修复或重建或产生肺血管或肺上皮、肺内皮或肺泡的对象，例如，患有肺纤维化的对象。

例如，所选对象是对传统治疗完全没有反应或反应不良的那些对象和/或已用尽本领域目前已知的对肺疾病的特定形式或类型的所有治疗方法的对象。所选对象的其他实例是认为不是任何肺移植的合适对象或者已在移植等待名单上很长时间而没有合适供体(也没有活供体)并在病危名单上的对象。

在治疗或预防肺疾病的治疗方法的所有方面的一实施方案中，施用是肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。

在治疗或预防肺疾病的治疗方法的所有方面的一实施方案中，肺内施用是气管内或鼻内施用。

在治疗或预防肺疾病的治疗方法的所有方面的一实施方案中，所述对象是插管的对象。

在治疗或预防肺疾病的治疗方法的所有方面的一实施方案中，非mhLSC是自体细胞。

在治疗或预防肺疾病的治疗方法的所有方面的一实施方案中，非mhLSC是获得自一个或多个供体的同种异体细胞。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，非mhLSC是对细胞的受体对象匹配的人白细胞抗原(HLA)类型的。在一实施方案中，从单一对象分离并扩增非mhLSC，并且祖细胞与受体匹配HLA I类：HLA-A和HLA-B；以及HLA II类：DRB1的6个等位基因中的至少4个。在另一实施方案中，从不同对象分离并扩增非mhLSC，并且祖细胞是与受体对象匹配HLA I类：HLA-A和HLA-B；以及HLA II类：DRB1的6个等位基因中的至少4个的HLA类型。HLA分型的方法是本领域已知的，例如，Bodmer,W.,1973,in Manual of Tissue Typing Techniques,Ray,J.G.,et al.,eds.,DHEW Publication No.(NIH)74-545,pp.24-27，其整体援引加入本文。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，所述方法还包括与非mhLSC一起进一步施用至少一种治疗剂，例如用于治疗囊性纤维化、COPD、肺纤维化和结节病的那些治疗剂。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，所述至少一种治疗剂增强非mhLSC群的归巢、移植或存活。

在治疗方法的所有方面的一实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。在另一实施方案中，所述对象是成年人。在一实施方案中，非mhLSC群是人非mhLSC群。

肺疾病和病症的诊断和预后中的非mhLSC和ml-hLSC

c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)的池包含CD44/CD73/CD105阴性的非间充质人肺干细胞(非mhLSC)和CD44/CD73/CD105阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)。CD73阴性的非mhLSC可能具有较高的形成肺特异性细胞类型的能力，即，肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，防止生成会在患病的肺中产生进一步损伤的细胞。在这方面，1型和2型肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞形成器官的气体交换单元。不像非mhLSC克隆，克隆的ml-hLSC不获得上皮和血管谱系。反而，克隆的ml-hLSC分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和成纤维细胞。值得注意的是，人的慢性阻塞性肺病(COPD)以及特发性或获得性肺纤维化(PF)的特征在于成纤维细胞积累和组织纤维化。重要的是，非mhLSC和ml-hLSC的比例在对照和患病肺之间显著改变，与对照健康肺组织相比，在患病肺组织中ml-hLSC的量增加而非mhLSC的量减少。此外，来自患病肺的ml-hLSC生成大量的成纤维细胞/成肌纤维细胞，高速侵袭matrigel并获得成肌纤维细胞表型。因此，ml-hLSC具有可能使它们成为肺病理学候选的特征。患有COPD，ml-hLSC的增加和非mhLSC的减少可能减弱COPD肺形成气体交换单元的能力，并且这可能导致肺泡扩大、肺泡壁破坏和呼吸衰竭。

COPD是美国的第三大死因。COPD经常在其最初阶段未被诊断出来，强调需要新诊断工具和新治疗策略。人中的COPD和PF的特征在于ml-hLSC的增加和非mhLSC的减少。ml-hLSC和非mhLSC的比例改变可能在过程的早期发生，提供病理状态的早期检测。

在一实施方案中，本发明的另一优点是使用非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合诊断、预测、监测和/或评价个体中的肺疾病或病症。

在一实施方案中，本公开提供一种与健康个体相比评价受影响的个体中普遍存在的肺疾病或病症的方法，所述方法包括：(a)从来自受影响个体的一个或多个肺组织样品分离非mhLSC和ml-hLSC；(b)测量获得自所述受影响个体的肺组织样品中非mhLSC和ml-hLSC的量；以及(c)将非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合与参考值或参考值的范围进行比较，其中参考是一个或多个健康个体，其中非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合的改变指示受影响的个体中盛行肺疾病或病症。

在一实施方案中，本公开提供一种评价治疗个体中的肺疾病或病症的治疗性干预的治疗效力的方法，所述方法包括：(a)在初始时间点从个体获得至少一个初始肺组织样品，其中所述初始时间点在施用治疗性干预之前；(b)在随后的时间点从个体获得至少一个随后的肺组织样品，其中所述随后的时间点在施用治疗性干预之后；(c)从每个所述时间点的至少一个肺组织样品分离非mhLSC和ml-hLSC；(d)测量初始和随后的肺组织样品中的非mhLSC和ml-hLSC的量；以及(e)将至少一个初始肺组织样品中的非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合与至少一个随后的肺组织样品中的非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合进行比较，其中非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合的改变指示治疗个体中的肺疾病或病症的治疗性干预的效力。

在一实施方案中，本公开提供一种确认或否定个体中肺疾病或病症的诊断的方法，所述方法包括：(a)从来自个体的一个或多个肺组织样品分离非mhLSC和ml-hLSC；(b)测量获得自所述个体的肺组织样品中非mhLSC和ml-hLSC的量；以及(c)将非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合与参考值或参考范围进行比较，其中基于非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合的改变确认或否定所述个体中肺疾病或病症的诊断。

在一实施方案中，本公开提供一种监测有需要的个体中的肺疾病或病症治疗的方法，所述方法包括：(a)在初始时间点从个体获得至少一个初始肺组织样品，其中所述初始时间点在肺疾病或病症的治疗性干预方案开始之前；(b)在随后的时间点从个体获得至少一个随后的肺组织样品，其中所述随后的时间点在治疗性干预方案开始之后；(c)从每个所述时间点的至少一个肺组织样品分离非mhLSC和ml-hLSC；(d)测量初始和随后的肺组织样品中的非mhLSC和ml-hLSC的量；以及(e)将至少一个初始肺组织样品中的非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合与至少一个随后的肺组织样品中的非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合进行比较，其中非mhLSC的量、ml-hLSC的量、非mhLSC和ml-hLSC的量、非mhLSC比ml-hLSC的比例或者其组合的改变指示治疗性干预方案的效力。

在一些实施方案中，肺疾病或病症是COPD、IPF或PPF。在一些实施方案中，在患有肺疾病或病症的个体中非mhLSC的量减少。在另一实施方案中，在患有肺疾病或病症的个体中ml-hLSC的量增加。

肺干细胞(LSC)

干细胞是保留通过细胞有丝分裂更新它们自己种类的能力的细胞，并且它们的子细胞可以分化为多样范围的特化细胞类型。两大类哺乳动物细胞是：在胚泡中发现的胚胎干(ES)细胞，以及在成体组织中发现的成体干细胞。在发育的胚胎中，ES可以分化为所有特化的胚胎组织。在成年生物体中，成体干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充特化细胞，还保持再生器官的正常运转，如血液、皮肤和肠组织。多能干细胞可以分化为源自三个胚层中任一个的细胞。

在一些实施方案中，如本文所用的术语“干细胞”是指未分化的细胞，其能够增殖并产生更多祖细胞，所述祖细胞能够产生大量的母细胞，所述母细胞可以转而产生分化的或者已知为前体细胞的可分化的子细胞。子细胞本身可以经诱导而增殖并产生子代，所述子代随后分化为一种或多种成熟细胞类型，同时还保留具有亲代发育潜能的一个或多个细胞。

在一些实施方案中，术语“干细胞”还指祖细胞的亚群，其具有在特定情况下分化为更加特化或分化的表型的能力或潜力，并且在某些情况下还保留增殖而基本上不分化的能力。

本文描述的LSC是与ES相反的成体干细胞。在一优选实施方案中，所述LSC是成体干细胞。

如本文所用，在一实施方案中，术语“c-kit阳性肺干细胞”或“c-kit阳性LSC”涵盖干细胞、祖细胞和前体细胞，其全部是c-kit阳性的。

如本文所用，在一实施方案中，术语“c-kit阳性肺干细胞”或“c-kit阳性LSC”涵盖c-kit阳性/KDR阳性细胞和c-kit阳性/KDR阴性细胞。

如本文所用，在一实施方案中，术语“非mhLSC”或“非间充质人肺干细胞”涵盖强c-kit阳性且CD44/CD73/CD105阴性的肺干细胞。非mhLSC可以分化为肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞或其组合。与患病的肺组织相比，非mhLSC以更大量存在于健康对照肺组织中。

如本文所用，在一实施方案中，术语“ml-hLSC”或“间充质样人肺干细胞”涵盖弱c-kit阳性且CD44/CD73/CD105阳性的肺干细胞。ml-hLSC分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和成纤维细胞。与健康对照肺组织相比，ml-hLSC以更大量存在于患病的肺组织中。

细胞分化是通常通过许多细胞分裂发生的复杂过程。分化的细胞可以源自专能(multipotent)细胞，所述转能细胞本身源自专能细胞等。虽然可以认为这些专能细胞中的每个是干细胞，但是每个可以产生的细胞类型的范围可能变化很大。一些分化的细胞还具有产生更大发育潜能的细胞的能力。这样的能力可能是天然的或者可能在用各种因素处理时人工诱导。在许多生物学实例中，干细胞是“专能的”，因为它们可以产生一种以上不同细胞类型的子代。自我更新是干细胞定义的另一经典部分，并且在本文件中使用时是必不可少的。理论上，自我更新可以通过两个主要机制之一发生。干细胞可以不对称分裂，一个子代保持干细胞状态，而另一个子代表达一些不同的其他特异性功能和表型。或者，群中的一些干细胞可以对称分裂为两个干细胞，因此保持群中的一些干细胞作为整体，而群中的其他细胞仅产生分化的子代。

在一些实施方案中，c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)的池包含两类细胞：间充质表位CD44、CD73和CD105阴性的非间充质hLSC(非mhLSC)；以及表达表位CD44、CD73和CD105的间充质样hLSC(ml-hLSC)。两种细胞类型均具有组织特异性成体干细胞的特征，即自我更新和克隆形成。

在一实施方案中，充分富集非mhLSC的分离的细胞群主要包含LSC(≥70％)以及非常少量的肺祖细胞和肺前体细胞(≤10％)。因此，在一实施方案中，充分富集非mhLSC的分离的细胞群称作分离的非mhLSC群。这表示非mhLSC群可以包括一些c-kit阳性祖细胞和/或c-kit前体细胞。

如本文所用，在一些实施方案中，术语“分离并充分富集非mhLSC的群”，“分离的非mhLSC群”，“非mhLSC群”，“分离的c-kit阳性且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞群”，“c-kit阳性且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞群”或者“富集的来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞群，其中c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的”涵盖非mhLSC和/或肺祖细胞和/或肺前体细胞的异质或同质群。肺祖细胞和肺前体细胞是谱系决定细胞。例如，如果肺祖细胞决定上皮谱系，即，在未来会产生肺上皮细胞，则这个肺祖细胞不会转换并产生血细胞，血细胞是造血谱系的细胞。在一些实施方案中，肺祖细胞和肺前体细胞决定肺上皮谱系、肺内皮谱系或肺泡细胞谱系。包含至少两种不同细胞类型的分离的非mhLSC群在本文中称作“异质群”。本文还考虑在移植之前分离并离体扩增肺干细胞或肺祖细胞。仅包含一种细胞类型(例如，肺干细胞)的分离的非mhLSC群在本文中称作“细胞的同质群”。

成年人肺组织中的肺干细胞表达c-kit，也称作KIT或CD117，其是结合细胞因子干细胞因子(SCF)的细胞因子受体。SCF向细胞发出分裂和生长的信号。一般来说，c-kit在干细胞以及祖细胞和前体细胞类型的表面上表达，祖细胞和前体细胞类型是由干细胞经有丝分裂产生的子代。因此，c-kit是干细胞标记。通过对成年人肺组织中的c-kit免疫染色，发明人发现了这类c-kit阳性细胞(参见WO 2012/047951)。在这个发现之前，没有报道肺中存在干细胞的证据。

在一实施方案中，如本文所用，术语“LSC”是指具有多谱系肺分化潜能和持续自我更新活性的细胞。“自我更新”是指细胞分裂并产生至少一个具有亲代细胞的相同(例如，自我更新)特征的子细胞的能力。第二个子细胞可以投入(commit)特定分化途径。例如，自我更新的LSC分裂并形成一个子代干细胞以及投入肺上皮或肺血管途径中的分化的另一个子细胞。投入的祖细胞通常已丧失自我更新能力，并且在细胞分裂时产生表现出更加分化的(即，受限的)表型的两个子细胞。

因此，如本文所述方法所用，“LCS”涵盖能够分化为呼吸系统的几种细胞类型的所有多能细胞，所述细胞类型包括但不限于，肺细胞1型和II型细胞、肺泡间细胞、平滑肌细胞、肺泡上皮细胞、内皮细胞以及红细胞。

当术语在本文中使用时，“肺祖细胞”是指LSC的亚群，其投入特定肺细胞谱系且一般不自我更新，并且可以通过例如细胞表面标记或胞内蛋白鉴定。例如，表示投入肺上皮谱系的TTF1；或者表示投入肺血管谱系的GATA6和/或Est1。

非mhLSC和/或ml-hLSC的存在可以通过本领域已知的任何方法确定，或者利用本领域技术人员已知的测定或实施例中描述的那些通过检测细胞表面标记来表型确定。

LSC的分离

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，非mhLSC和/或ml-hLSC源自或分离自以下来源的肺组织样品：流产胎儿、胎儿活检组织、刚死亡的对象、来自活对象的组织活检、肺干细胞系。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，非mhLSC和/或ml-hLSC离体源自其他细胞，如胚胎干细胞、经诱导的多能干细胞(iPS细胞)或成体多能细胞。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，可以利用本领域技术人员已知的任何方法或根据本文所述方法分离非mhLSC。例如，从来自活对象的小肺组织样品细针抽吸。

可以通过本领域已知的任何方法从肺组织样品分离非mhLSC和/或ml-hLSC。从组织样品分离单个细胞的方法是本领域已知的，例如，美国专利7,547,674以及美国专利申请2006/0239983、2009/0148421和2009/0180998。这些参考文献整体援引加入本文。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，分离的非mhLSC群是通过以下方法分离的。本领域技术人员能够根据来自不同来源的肺组织的需要对方法进行微调。将最小尺寸为至少1立方厘米的一小块肺组织用胶原酶酶促消化以获得单细胞(Kajstura,J.,et al.,2011,New Engl J Med 364:1795-1806)。将小的完整细胞重悬并用细胞过滤网去除细胞聚集体。这个细胞过滤网步骤是任选的。然后将细胞与小鼠c-kit抗体温育。分离单个c-kit阳性细胞并用抗小鼠IgG包被的免疫磁性珠收集。通过CD44/CD73/CD105标记的负向选择进一步选择非mhLSC。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，然后将获得的分离的非mhLSC通过以下方法培养。本领域技术人员能够根据需要对方法进行微调。培养方法用来生长并扩增非mhLSC的数量。在标准组织培养条件下将分离的非mhLSC平板接种于含有补充了5-10％FBS(GIBCO)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(SIGMA,St.Louis,MO)的F12培养基(GIBCO,Grand island,NY)的改性F12K培养基中。达到汇合之后，利用操作细胞的标准组织培养方案将细胞传代至几个其他板以扩增培养。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在用于本文所述方法之前利用本领域技术人员可接受的任何方法离体扩增本文所述来自肺组织的非mhLSC。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将扩增的非mhLSC进一步分选、分级分离、处理以去除任何不期望的细胞，或者利用本领域技术人员可接受的制备细胞用于移植的任何方法操纵以治疗患者。不期望的细胞的实例是恶性细胞。

在肺组织的样品中通常有非常少量的非mhLSC，例如，可以每百万个细胞仅有1或2个非mhLSC。因此，所选非mhLSC的扩增是必需的，以便增加本文所述治疗用途所需的细胞数量。本文所述治疗用途中移植的更大量的非mhLSC增加其中使用的疗法的成功率。非mhLSC用来修复、重建和生成对象肺中一些受损的组织和细胞。因此，更多移植的非mhLSC表示更多细胞可用来修复、重建和生成新的肺细胞和肺组织。在一些实施方案中，移植疗法的成功可以通过本领域已知的任何方法和本文描述的那些测量，如对象肺功能的改善、血氧饱和度和本领域的医生已知的一般健康状况。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，从对象分离包含LSC的肺组织样品然后进一步加工，例如，通过细胞分选(例如，FACS)，以便获得基本上富集的非mhLSC群。在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，基本上富集的非mhLSC群是指扩增的非mhLSC的体外或离体培养物。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，来自各种来源的肺组织样品是冷冻样品，如在提取或选择非mhLSC之前冷冻或低温保存。肺组织样品获得自对象或本文描述的其他来源，然后用冷冻保护剂低温保存。在所述组合物和方法的所有方面的另一实施方案中，在使用之前将来自肺组织样品的分离的非mhLSC群用冷冻保护剂低温保存。在所述组合物和方法的所有方面的另一实施方案中，在使用之前将已体外培养扩增的分离的非mhLSC群用冷冻保护剂低温保存。用冷冻保护剂低温保存组织和细胞的方法是本领域公知的。解冻低温保存组织或细胞使用的进一步方法也是本领域公知的。

如本文所用，术语“分离”以及“获得或制备的方法”是指从其中最初发现它的对象或肺组织样品取出细胞或细胞群如肺mhLSC群的过程。如本文所用，术语“分离的群”是指已从生物样品取出并分离的细胞群，或者在这样的样品中发现的细胞的混合或异质群。这样的混合群包括例如获得自肺组织样品的非mhLSC群。在一些实施方案中，与分离或富集细胞的异质群相比，分离的群是基本上纯的细胞群。在一些实施方案中，分离的群是分离的非mhLSC群。在本文所述这个方面和所有方面的其他实施方案中，分离的群包含充分富集的非mhLSC群。在一些实施方案中，将分离的细胞或细胞群如非mhLSC群进一步体外或离体培养，例如，在生长因子或细胞因子的存在下，以便进一步扩增分离的细胞群或基本上非mhLSC富集的细胞群中的细胞数量。这样的培养可以利用本领域技术人员已知的任何方法进行。在一些实施方案中，后来将通过本文公开的方法获得的分离或基本上富集的非mhLSC群施用至第二对象，或者重新引入最初分离细胞群的对象(例如，同种异体移植vs.自体施用)。

关于特定细胞群，术语“充分富集”是指关于组成总细胞群的细胞，至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％纯的细胞群。换句话说，关于为了用于本文公开的方法分离的非mhLSC群，术语“充分富集”或“基本上纯化”是指如本文术语定义的，包含少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约9％、少于约8％、少于约7％、少于约6％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、少于约1％或少于1％不是非mhLSC的细胞的非mhLSC群。这些方面的一些实施方案进一步涵盖扩增基本上纯或充分富集的非mhLSC群的方法，其中扩增的非mhLSC还是基本上纯或充分富集的非mhLSC群。

关于细胞群中存在的特定标记，术语“基本上阴性”是指相对于组成总细胞群的细胞，对于该标记不超过约1％、不超过约0.9％、不超过约0.8％、不超过约0.7％、不超过约0.6％、不超过约0.5％、不超过约0.4％、不超过约0.3％、不超过约0.2％、不超过约0.1％阳性的细胞群。

术语“富集(enriching)”或“富集(enriched)”在本文中可交换使用，表示一种类型细胞，如用于本文所述方法的非mhLSC，的量(yield)(级分)相对于起始生物样品、培养物或制品中该类型细胞的级分增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。为了用于本文所述方法而获得的非mhLSC群最优选对于富集非mhLSC至少60％。

在一些实施方案中，非mhLSC特异性的标记用来分离或富集这些细胞。如本文所用，“标记”描述细胞的特征和/或表型。标记可以用于选择包含所关注的特征的细胞。标记会随特定细胞变化。标记是细胞类型特别的特征，无论形态学、功能或生物化学(酶促)的，或者是细胞类型表达的分子。优选地，这类标记是蛋白，并且更优选地，具有本领域可用的抗体或其他结合分子的表位。但是，标记可以由细胞中发现的任何分子组成，包括但不限于蛋白(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态学特征或性状的实例包括但不限于性状、大小、外观(例如，光滑、半透明)和核质比。功能特征或性状的实例包括但不限于粘附至特定基底的能力、吸收或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力以及沿特定谱系分化的能力。标记可以通过本领域技术人员可用的任何方法检测。

因此，如本文所用，“细胞表面标记”是指在细胞表面上表达的任何分子。细胞表面表达通常要求分子具有跨膜结构域。通常在细胞表面上未发现的一些分子可以通过重组技术工程化以在细胞表面上表达。许多天然存在的细胞表面标记命名为“CD”或“分化簇”分子。细胞表面标记常提供抗体可以结合的抗原决定簇。与本文所述方法特别相关的细胞表面标记是CD117或c-kit。根据所述组合物和方法可用的非mhLSC优选表达c-kit，或者换句话说，它们是c-kit阳性的。

细胞可以认定为任何细胞表面标记或其他胞内标记“阳性”或“阴性”的，并且这类认定可用于本文所述方法的实施。如果细胞在其细胞表面或胞内以足以利用本领技术人员已知方法(如使细胞与特异性地结合该标记的抗体接触，随后进行这样的接触细胞的流式细胞术分析以确定抗体是否结合细胞)检测的量表达标记，则认为细胞是细胞表面标记“阳性”的。应当理解虽然细胞可以表达细胞表面标记的信使RNA，但是对于本文所述方法，为了被认为是阳性的，细胞必须在其表面上表达它。相似地，如果细胞不以足以利用本领技术人员已知方法(如使细胞与特异性地结合该标记的抗体接触，随后进行这样的接触细胞的流式细胞术分析以确定抗体是否结合细胞)检测的量表达标记，则认为细胞是细胞表面标记或其他胞内标记“阴性”的。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，负向选择非mhLSC并且选择使用细胞表面标记特异性的物质。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，所述细胞表面标记是间充质基质细胞谱系标记。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在负向选择的上下文中，其中使用谱系标记特异性的物质，所有物质可以包含相同标记或标签，如荧光标签，因此可以排除或去除所有该标记或标签阳性的细胞，留下谱系标记阴性的非mhLSC、肺祖细胞和/或肺前体细胞用于本文所述方法。这是负向选择，选择不与谱系标记特异性的物质接触的那些细胞。

因此，如本文定义的，“细胞表面标记或其他胞内标记特异性的物质”是指可以选择性地与细胞表面标记或其他胞内标记反应或者结合至细胞表面标记或其他胞内标记，但是对另一细胞表面标记、其他胞内标记或抗原具有很少或没有可检测的反应性的物质。例如，c-kit特异性的物质不会鉴定或结合至CD49e。因此，细胞表面标记或其他胞内标记特异性的物质识别标记的独特结构特征。在一些实施方案中，标记特异性的物质结合至标记，但是不引起该标记介导的下游信号事件的起始，例如，非激活抗体。细胞表面分子特异性的物质包括但不限于抗体或其抗原结合片段、天然或重组配体、小分子、核酸序列和核酸类似物、胞内抗体、适配体以及其他蛋白或肽。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，用于分离非mhLSC的细胞表面标记特异性的优选物质是特异性地结合细胞表面标记的抗体物质，并且可以包括多克隆和单克隆抗体，以及它们的抗原结合衍生物或片段。公知的抗原结合片段包括例如单结构域抗体(dAb；其基本上由单个VL或VH抗体结构域组成)，Fv片段，包括单链Fv片段(scFv)，Fab片段和F(ab’)2片段。构建这类抗体分子的方法是本领域公知的。因此，如本文所用，术语“抗体”是指完整免疫球蛋白或者具有Fc(可结晶片段)区的单克隆或多克隆抗原结合片段或者Fc区的FcRn结合片段。抗原结合片段可以通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来制备。“抗原结合片段”包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dAb、和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双特异抗体以及含有足以赋予多肽特异性抗原结合的至少部分免疫球蛋白的多肽。以本领域技术人员已知的标准免疫学含义采用术语Fab、Fc、pFc’、F(ab’)2和Fv，例如，Klein,“Immunology”(John Wiley,New York,N.Y.,1982)；Clark,W.R.(1986)；“The Experimental Foundations of ModernImmunology”(Wiley&Sons,Inc.,New York)；和Roitt,I.(1991)“Essential immunology”,7th Ed.,(Blackwell Scientific Publications,Oxford)。这类抗体或抗原结合片段可商购自供应商如R&D Systems、BD Biosciences、e-Biosciences和Miltenyi，或者可以通过本领域技术人员已知的方法针对这些细胞表面标记或其他胞内标记产生。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，用标签标记细胞表面分子或其他胞内标记特异性的物质，如抗体或抗原结合片段，以便促进肺干细胞的分离。如本文所用，术语“标记”或“标签”是指能够产生可检测信号的组合物，所述可检测信号指示靶标的存在，如生物样品中特异性细胞表面标记的存在。合适的标记包括荧光分子、放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光部分等。照此，标记是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的分离并富集LSC、肺祖细胞和肺前体细胞的方法需要的任何组合物。

如本文所用，术语“标记的抗体”或“标签的抗体”包括通过可检测方式标记的抗体，并且包括但不限于荧光、酶促、放射性和化学发光标记的抗体。还可以用可标记标签标记抗体，如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5或HIS，其可以利用标签特异性的抗体检测，例如，抗c-Myc抗体。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的，并且可以使用。标记抗体用于本发明的方法的荧光标记或标签的非限制性实例包括羟基香豆素、琥珀酰亚胺基酯、氨基香豆素、琥珀酰亚胺基酯、甲氧基香豆素、Cascade Blue、酰肼、Pacific Blue、马来酰亚胺、Pacific Orange、荧光黄、NBD、NBD-X、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物(Cychrome、R670、Tri-Color、Quantum Red)、PE-Cy7缀合物、Red 613、PE-Texas Red、PerCP、多甲藻素叶绿素II蛋白、TruRed(PerCP-Cy5.5缀合物)、FluorX、异硫氰酸荧光素(FITC)、BODIPY-FL、TRITC、X-罗丹明(XRITC)、丽丝胺罗丹明B、德克萨斯红、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7缀合物、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa500、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、Alexa790、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5或Cy7。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，技术人员可获得分离基本上纯或充分富集的非mhLSC群的各种方法，包括免疫选择技术，如利用流式细胞术方法的高通量细胞分选，用标记至磁珠、生物可降解珠、非生物可降解珠的抗体以及淘选至包括皿在内的表面的抗体的亲和方法，以及这类方法的组合。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，非mhLSC群的分离和富集可以利用基于分选机制的珠如磁珠进行。在这类方法中，使消化的肺组织样品与磁珠接触，所述磁珠用针对一种或多种特定细胞表面抗原如c-kit的抗体包被。这使样品中表达各自抗原的细胞附着至磁珠。允许c-kit阳性细胞结合珠一段时间之后，将细胞和珠的混合物暴露于强磁场，如具有磁铁的柱或架。附着至珠的细胞(表达细胞表面标记)留在柱或样品管上，而其他细胞(不表达细胞表面标记)流过或留在溶液中。利用这种方法，可以对于特定细胞表面标记正向或负向分离细胞，或者利用其中的组合。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，磁性活化细胞分选(MACS)策略用于非mhLSC的分离和预选。在一些实施方案中，在人血浆或人血清白蛋白(HSA)如2％HAS的存在下分离非mhLSC。

在所述组合物和方法的所有方面的一些优选实施方案中，利用细胞表面标记c-kit的正向选择分离或富集非mhLSC和/或ml-hLSC。

在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，一种或多种额外的细胞表面标记用于分离和/或富集非mhLSC，利用正向或负向选择方法，或者其中的组合。这类额外的细胞表面标记包括CD44、CD73和CD105。

如本文所定义，“正向选择”是指导致分离或富集表达特定细胞表面标记或胞内蛋白的细胞的技术，而“负向选择”是指导致分离或富集不表达特定细胞表面标记或胞内蛋白的技术。负向选择可以通过本领域已知的任何方法进行。例如，典型的负向选择通过去除表达所关注的标记的细胞进行。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，技术人员可以利用本领域已知的标准技术用抗体包被珠，如商业珠缀合试剂盒。在一些实施方案中，进行负向选择步骤以去除表达一种或多种谱系标记的细胞，然后荧光激活细胞分选术以正向选择表达一种或多种特定细胞表面标记的ml-hLSC。例如，在负向选择方案中，使消化的肺组织样品首先与特异于感兴趣的细胞表面标记如CD2、CD3、CD6、CD8、CD34、CD49e和CD66b的标记的抗体接触，然后使样品与抗体标记特异性的珠接触，并且利用免疫磁性谱系消耗去除表达标记CD2、CD3、CD6、CD8、CD34、CD49e和CD66b的细胞。

许多不同的细胞表面标记在特异性分化的细胞谱系上具有特异性表达，并且为本文所述方法分离的非mhLSC不表达。因此，当使这些谱系细胞标记特异性的物质与非mhLSC接触时，细胞会是“阴性的”。本文所述非mhLSC不表达的谱系细胞标记是CD44、CD73和CD105(对于间充质基质细胞谱系)。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，流式细胞术方法，单独或与基于磁珠的方法组合用来分离或富集非mhLSC。如本文所定义，“流式细胞术”是指通过将微观颗粒如细胞和染色体悬浮于一股流体中并使它们通过电子检测装置来计数和检查微观颗粒的技术。流式细胞术允许每秒多达数千个颗粒的物理和/或化学参数的同时多参数分析，如荧光参数。现代流式细胞仪通常具有多个激光和荧光检测器。增加激光和检测器的数量允许通过多种抗体标记，并且可以通过它们的表型标记更精确地鉴定靶群。某些流式细胞仪可以拍摄单个细胞的数字图像，允许分析细胞内或表面上的荧光信号位置。

流式细胞术的常见变化是利用“荧光激活细胞分选术”基于它们的特性物理分选颗粒，以便纯化所关注的群。如本文所定义，“荧光激活细胞分选术”或“基于流式细胞术的分选术”方法是指从单个生物样品分选细胞的异质混合物至一个或多个容器的流式细胞术方法，一次一个细胞，基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，并且提供来自单个细胞的荧光信号的快速、客观和定量记录以及特别关注的细胞的物理分离。因此，在那些实施方案中，当细胞表面标记特异性的物质是用可以通过流式细胞仪检测的标签标记的抗体时，荧光激活细胞分选术(FACS)可以用于本文所述方法以分离并富集LSC群。

非mhLSC的扩增

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，将分离和充分富集的非mhLSC群进一步扩增以在它们用于本文所述治疗方法之前增加数量。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在施用至有需要的对象之前，利用本领域技术人员已知的方法，将通过利用本文所述方法和技术分离或富集的非mhLSC在培养中扩增，即，细胞数量在对象体外增加。

在所述组合物和方法的所有方面的一实施方案中，将获得的分离的非mhLSC根据以下方法在培养中扩增。本领域技术人员能够根据需要对方法进行微调。在标准组织培养条件下，例如，95％空气、5％CO₂、37℃，将分离的非mhLSC平板接种于包含补充了5-10％FBS(GIBCO)和胰岛素-硒-转铁蛋白混合物(SIGMA,St.Louis,MO)的F12培养基(GIBCO,GrandIsland,NY)的改性F12K培养基中。达到汇合之后，利用操作细胞的标准组织培养方案将来自一个汇合平板的细胞传代至几个其他板以扩增培养。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，这类扩增方法可以包括例如在补充了因子的无血清培养基中和/或在引起LSC扩增的条件下培养非mhLSC，如干细胞因子、IL-3和GM-CSF。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，可以在目的是诱导LSC分化为呼吸上皮细胞的因子和/或条件下进一步培养非mhLSC，如利用小气道生长培养基、改性的小鼠气管上皮细胞培养基或者补充了视黄酸和/或角质形成细胞生长因子的无血清培养基。

在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，如Lu J et al.,“A NovelTechnology for Hematopoietic Stem Cell Expansion using Combination ofNanofiber and Growth Factors.”Recent Pat Nanotechnol.20104(2):125-35中综述的，通过适应不超过约0.5％，纳米技术或纳米工程方法扩增非mhLSC。例如，在一些实施方案中，可以进行干细胞微环境的纳米工程。如本文所用，分泌因子、干细胞–相邻细胞相互作用、胞外基质(ECM)和机械特性共同构成“干细胞微环境”。干细胞微环境纳米工程可以包括使用微/纳米图案化的表面、纳米颗粒以控制释放生长因子和生物化学物质，纳米纤维以模拟胞外基质(ECM)，阵列化的(arrayed)生物材料的纳升级别合成、自组装肽系统以模拟干细胞的信号簇，纳米线、激光组合的纳米槽和纳米相薄膜以扩增LSC。

在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，遗传操作非mhLSC，例如用外源核酸转染。纳米工程可以用于LSC中的转染和遗传操作，如用于体内基因递送的纳米颗粒，用于基因递送至LSC的纳米针，用于LSC转染的自组装肽系统，用于基因递送至LSC的纳米线以及用于LSC电穿孔的微/纳米流体装置。

在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，可以利用生物反应器扩增经分离或富集用于所述方法的非mhLSC。

当用于非mhLSC扩增的上下文时，术语“增加的”、“增加”或“扩增”一般表示非mhLSC的数量增加统计显著的量；为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”、“扩增”表示与参考水平相比，增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或多达并包括100％，或者与对照或参考水平相比，增加至少约2-倍、或至少约3-倍、或至少约4-倍、或至少约5-倍、至少约6-倍、或至少约7-倍、或至少约8-倍、至少约9-倍、或至少约10-倍或者10-倍或更大的任何增加。对照/参考样品或水平在本文中用来描述例如未利用本文所述方法扩增的获得自相同生物来源的细胞群，例如，在扩增培养开始时或者添加至扩增培养的细胞的初始数量。

肺组织样品和/或肺干细胞的储存

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在使用之前，即，在提取、分离或选择其中的非mhLSC之前储存肺组织样品。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在提取或选择其中的非mhLSC之前储存消化的肺组织样品。在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，储存分离的非mhLSC。在所述组合物和方法的所有方面的其他实施方案中，在储存之前首先分离和/或扩增非mhLSC。在一实施方案中，所述储存是通过低温保存进行。在需要时将非mhLSC解冻用于本文所述治疗方法。

在所述组合物和方法的所有方面的一些实施方案中，在用于本文所述方法之前将肺组织样品或分离的非mhLSC(扩增的或其他)冷冻。冷冻样品可以在一种或多种不同冷冻保护剂的存在下进行，以便最小化冻-融过程中的细胞损伤。例如，可以使用二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖或蔗糖。

再生医学中非mhLSC的施用和用途

本文描述的某些实施方案是基于c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池中存在的能够分化为肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞的CD44/CD73/CD105阴性的非间充质人肺干细胞(非mhLSC)的发现。CD73阴性的非mhLSC可能具有较高的形成肺特异性细胞类型的能力，即，肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，防止生成会在受损肺中产生进一步损伤的细胞。在这方面，1型和2型肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞形成器官的气体交换单元。这些观察结果表明分离的非mhLSC可以用于肺血管再生和肺泡发育。

因此，本文提供治疗和/或预防有需要的对象中的呼吸系统/肺疾病或病症的方法。如本文所用，术语“呼吸系统疾病或病症”、“肺疾病或病症”以及“肺病症”可交换使用。这些方法中的一些包括利用肺内施用如鼻内、气管内或静脉内途径向对象施用治疗有效量的分离的非mhLSC。在这些方法的一些方面，利用全身如腹腔内或静脉内途径施用治疗有效量的分离的非mhLSC。在这些方法的其他方面，利用肺内和腹腔内施用施用治疗有效量的分离的非mhLSC。这些方法特别针对患有呼吸系统疾病或病症或者有呼吸系统疾病或病症风险的人类对象的治疗性和预防性治疗，例如，患有COPD的对象。本文所述分离或富集的非mhLSC可以施用至患有任何呼吸系统疾病或病症或者倾向于发展一种的所选对象，施用可以通过导致对象中的有效治疗的任何适当途径。在本文所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在施用细胞之前首先选择患有呼吸系统病症的对象。

术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可交换使用，是指动物，例如，由其可以获得用于本文所述方法的细胞的人(即，供体对象)和/或向其提供用本文所述细胞治疗(包括预防性治疗)的人，即，受体对象。对于特定动物如人类对象特异性的那些疾病状况或病态的治疗，术语对象是指该特定动物。在本文中可交换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物如大鼠、小鼠、兔、羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类。术语“对象”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。但是，有利地，对象是哺乳动物如人，或者其他哺乳动物如家养动物，例如，狗、猫、马等，或者食品生产哺乳动物，例如，牛、羊、猪等。

因此，在本文所述治疗方法的一些实施方案中，对象是受体对象，即，向其施用分离的非mhLSC的对象，或者供体对象，即，由其获得包含非mhLSC的肺组织样品的对象。受体或供体对象可以是任何年龄。在一些实施方案中，对象是“年轻对象”，在本文中定义为小于10岁的对象。在其他实施方案中，对象是“婴儿对象”，在本文中定义为小于2岁的对象。在一些实施方案中，对象是“新生儿对象”，在本文中定义为小于28日龄的对象。在一实施方案中，年轻、婴儿或新生儿受体或供体对象是非成年受体或供体对象。在一实施方案中，大于10岁但不是成年的对象是非成年对象。在一些实施方案中，受体或供体对象是非成年。在一优选实施方案中，所述对象是成年人。

在本文所述治疗方法的一些实施方案中，施用的分离的非mhLSC群包含获得自一个或多个供体的同种异体非mhLSC。如本文所用，“同种异体”是指获得自相同物种的一个或多个不同供体的非mhLSC或包含非mhLSC的肺组织样品，其中在一个或多个基因座的基因不同。例如，施用至对象的分离的非mhLSC群可以获得自肺组织，所述肺组织获得自一个或多个无关供体对象，或者来自一个或多个不同的兄弟姐妹或其他来源。在一些实施方案中，使用同基因分离的非mhLSC群，如获得自遗传相同的动物的那些，或者来自相同的双胞胎。在这个方面的其他实施方案中，分离的非mhLSC是自体非mhLSC。如本文所用，“自体”是指获得或分离自对象并施用至相同对象的非mhLSC或包含非mhLSC的肺组织样品，即，供体和受体相同。

肺疾病是指在肺部发生或导致肺不能正常工作的任何疾病或病症。有3种主要类型的肺疾病。大多数肺疾病实际上包括这些类别的组合：(1)气道疾病--这些疾病影响将氧气和其他气体带入和带出肺部的管(气道)。这些疾病导致气道狭窄或阻塞。它们包括哮喘、肺气肿和慢性支气管炎。患有气道疾病的人有时描述感觉为“试图通过吸管呼吸”。(2)肺组织疾病--这些疾病影响肺组织的结构。组织的结疤或炎症使肺不能完全扩张(“限制性肺疾病”)。其还使肺吸收氧气(氧化)和释放二氧化碳的能力较低。肺纤维化和结节病是肺组织疾病的实例。人们有时描述感觉为“穿着太紧的毛衣或背心”，不允许他们深呼吸。(3)肺循环疾病--这些疾病影响肺中的血管。它们是由肺中血管的凝血、结疤或炎症引起的。它们影响肺吸收氧气和释放二氧化碳的能力。这些疾病还可以影响心脏功能。

最常见的肺疾病包括：哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肺纤维化和结节病。其他肺疾病包括：石棉沉着病、曲霉肿、曲霉病、急性侵袭性肺不张、嗜酸细胞性肺炎、肺癌、转移性肺癌、坏死性肺炎、胸腔积液性尘肺、肺孢子虫病、肺炎、免疫缺陷患者中的肺炎、气胸、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺动静脉畸形、肺水肿、肺栓塞、肺组织细胞增多症X(嗜酸细胞肉芽肿)、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核病、肺静脉闭塞病和类风湿性肺疾病。

本文所述方法可以用来治疗、改善症状、预防和/或减缓许多呼吸系统疾病或它们的症状的发展，如对肺或气道结构导致病理损伤和/或肺泡损伤的那些。术语“呼吸系统病症”、“呼吸系统疾病”、“肺疾病”和“肺部病症”在本文中可交换使用，是指涉及呼吸和/或呼吸系统(包括肺、胸膜腔、支气管、气管、上呼吸道、气道或者呼吸系统的其他组分或结构)的任何疾病状况和/或病症。这类呼吸系统疾病包括但不限于支气管肺发育不良(BPD)，慢性阻塞性肺病(COPD)状况，囊性纤维化，支气管扩张，肺源性心脏病，肺炎，肺脓肿，急性支气管炎，慢性支气管炎，肺气肿，肺炎，例如，过敏性肺炎或与辐射暴露相关的肺炎，肺泡性肺疾病和间质性肺疾病，环境性肺疾病(例如，与石棉、烟雾或气体暴露相关)，吸入性肺炎，肺出血综合征，淀粉样变，结缔组织疾病，系统性硬化症，强直性脊柱炎，肺放线菌病，肺泡蛋白沉积症，肺炭疽，肺水肿，肺栓塞，肺炎症，肺组织细胞增多症X，肺动脉高压，表面活性剂不足，肺发育不良，肺肿瘤，肺诺卡菌病，肺结核病，肺静脉闭塞病，类风湿性肺疾病，结节病，肺切除术后，韦格纳肉芽肿，过敏性肉芽肿，肉芽肿性血管炎，嗜酸性粒细胞增多症，哮喘和气道高反应性(AHR)(例如，轻度间歇性哮喘、轻度持续性哮喘、中度持续性哮喘、严重持续性哮喘、急性哮喘、慢性哮喘、变应性哮喘、过敏性哮喘或特异体质性哮喘)，囊性纤维化和相关疾病状况，例如，过敏性支气管肺曲霉病，慢性鼻窦炎，胰功能不全，肺或血管炎症，细菌或病毒感染，例如，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或RSV感染或者急性或慢性成人或小儿呼吸窘迫综合征(RDS)如I级、II级、III级或IV RDS或者与例如脓毒、肺炎、再灌注、肺不张或胸部创伤相关的RDS。

慢性阻塞性肺病(COPD)包括气道阻塞位于上气道、中等大小的气道、细支气管或实质的疾病状况，其可以表现如下或与如下相关：气管狭窄、气管右心室肥大性肺动脉高压、多软骨炎、支气管扩张、细支气管炎如特发性细支气管炎、纤毛运动障碍、哮喘、肺气肿、结缔组织疾病、慢性支气管炎的细支气管炎或肺移植。

肺纤维化是其中肺部深处的组织随着时间变厚和变硬或者结疤的疾病。疤痕组织的形成称作纤维化。当肺组织变厚时，肺无法适当地将氧气转移至血流中。结果，大脑和其他器官没有获得它们需要的氧气。遗传可能在引起IPF中起作用。无法查明原因的肺纤维化称作特发性肺纤维化(IPF)。IPF是通常影响中老年人的严重疾病。IPF因人而异。在IPF中，结疤从气囊壁和它们周围的空间开始。IPF尚未治愈。许多人在诊断之后仅活约3-5年。与IPF相关的最常见死亡原因是呼吸衰竭。其他死亡原因包括肺动脉高压、心力衰竭、肺栓塞、肺炎和肺癌。IPF的其他名称包括：特发性弥漫性间质性肺纤维化、不明原因的肺纤维化、肺纤维化、隐源性纤维化肺泡炎、普通型间质性肺炎和弥漫性纤维化肺泡炎。

本文所述方法还可以用来治疗或改善急性或慢性哮喘或者它们的症状或并发症，包括气道上皮损伤，气道平滑肌痉挛或气道高反应性，气道粘膜水肿，增加的粘液分泌，过度的T细胞激活，或脱皮(desquamation)，肺不张，肺心病，气胸，皮下肺气肿，呼吸困难，咳嗽，喘息，呼吸短促，呼吸急促，疲劳，减少的第1秒用力呼气量(FEV1)，动脉低氧血症，呼吸性酸中毒，炎症，包括不需要的水平升高的介质如IL-4、IL-5、IgE、组胺、物质P、神经激肽A、降钙素基因相关肽或花生四烯酸代谢物如血栓素或白三烯(LTD4或LTC4)，以及细胞气道壁浸润，例如被嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞或粒细胞浸润。

其他地方描述了任何这些肺疾病和病症，以及其他呼吸系统或肺疾病状况或症状，例如The Merck Manual,17.sup.th edition,M.H.Beers and R.Berkow editors,1999,Merck Research Laboratories,Whitehouse Station,N.J.,ISBN 0911910-10-7，或者在本文整体引用的其他参考文献中。在这些疾病状况的一些中，其中炎症在疾病状况的病理中起作用，与非mhLSC一起使用的治疗剂可以通过减少来自炎症的损伤，如对肺上皮的损伤，改善或减缓疾病状况的发展。在其他情况下，与非mhLSC一起使用的治疗剂可以限制病原体复制或病原体相关的肺组织损伤。

如本文所用，术语“施用”、“引入”、“移植”和“植入”在将本发明的细胞如非mhLSC放置入对象的上下文中可交换使用，通过导致引入的细胞至少部分定位在期望位点如受伤或修复位点的方法或途径，从而产生期望的效果。可以将细胞如非mhLSC或它们的分化的子代(例如，呼吸上皮样细胞)直接植入呼吸道，或者通过任何适当途径施用，所述途径导致递送至对象中的期望位置，在这里至少一部分植入的细胞或细胞的组分保持活力。施用至对象之后细胞的存活期可以短至几小时，例如，24小时，几天，长达几年，即长期植入。例如，在本文所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，通过气管内施用将有效量的分离的非mhLSC的分离或富集的群直接施用至患有支气管肺发育不良的婴儿的肺。在本文所述治疗方法的所有方面的其他实施方案中，通过间接的全身施用途径如腹腔内或静脉内途径施用分离和富集的非mhLSC群。

当预防性提供时，可以在呼吸系统病症的任何症状如哮喘发作或囊性纤维化对象之前施用分离和富集的非mhLSC。因此，分离或富集的非mhLSC群的预防性施用用来预防呼吸系统病症，或者如本文公开的呼吸系统疾病的进一步发展。

当治疗性提供时，在呼吸系统病症的症状或指征发生时(或之后)，例如，在COPD发生时，提供分离或富集的非mhLSC。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善”是指治疗性处理(treatment)，其中目的是逆转、缓解、改善、减少、抑制或减缓与疾病或病症相关的疾病状况的发展或严重程度。术语“治疗”包括减少或缓解与炎性疾病相关的疾病状况、疾病或病症的至少一种不良反应或症状，例如但不限于哮喘。如该术语在本文中定义的，如果一种或多种症状或临床标记减少，治疗一般是“有效的”。或者，如果疾病的发展减少或停止，治疗是“有效的”。即，“治疗”不仅包括症状或标记的改善，而且还包括在治疗不存在下预期的症状发展或恶化的停止或至少减慢。有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解，疾病程度的降低，稳定(即，不恶化)的疾病状态，疾病发展的延迟或减慢，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论部分或完全)，无论可检测或不可检测。在一些实施方案中，“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”还可以表示与如果对象不接受治疗的预期存活相比延长对象的存活。

如本文所用，术语“预防”是指预防或防范措施，其中目的是防止或延迟疾病或病症的发生，或者延迟与疾病或病症相关的症状的发生。在一些实施方案中，“预防”是指减慢与肺疾病或病症相关的疾病状况的发展或严重程度或者肺功能的恶化。

在另一实施方案中，肺疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用缓解(包括缓解性治疗)。例如，会认为患有呼吸系统病症如哮喘的对象中的炎症、支气管痉挛、支气管收缩、呼吸短促、喘息、下肢水肿、腹水、痰咳、咯血或发绀中的任何减少是缓解的症状，不管多轻微。在所述方面的一些实施方案中，与对照或未治疗的对象相比，当施用分离或富集的LSC群时，疾病或病症的症状或测量的参数减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

测量或可测量的参数包括疾病的临床可检测的标记，例如，临床或生物标记的升高或降低的水平，以及疾病或病症的与症状或标记的临床可接受的规模相关的参数。但是，应当理解，本文公开的组合物的总使用由主治医师在健全的医学判断的范围内决定。需要的确切量会根据因素变化，如治疗的肺疾病的类型，损伤程度，目的是治疗或预防或者两者，对象的年龄，可用的细胞量等。因此，本领域技术人员认识到治疗可能改善疾病状况，但是可能不是完全治愈疾病。

在所述治疗方法的所有方面的一实施方案中，如本文所用的术语“有效量”是指缓解呼吸系统疾病或病症的至少一种或多种症状所需要的非分离或富集的mhLSC群的量，并且涉及足够量的药理组合物以提供期望效果，例如，治疗患有支气管肺发育不良的对象。因此术语“治疗有效量”是指当向典型对象施用时，如患有支气管肺发育不良或有支气管肺发育不良的风险的对象，足以引起特定效果的利用如本文公开的治疗方法对非mhLSC分离和富集的量。

在所述方法的所有方面的另一实施方案中，如本文所用的有效量还包括足以防止或延迟疾病症状的发展、改变症状性疾病的过程(例如但不限于减慢疾病症状的发展)或甚至逆转疾病症状的量。特定效果需要的非mhLSC的有效量会随着每个个体变化，并且还会随着解决的肺疾病类型变化。因此，不可能指定确切的“有效量”。但是，对于任何指定情况，本领域技术人员可以利用常规实验确定适当的“有效量”。

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在根据本文所述方法施用细胞之前首先诊断对象患有影响肺组织的疾病或病症。在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在施用所述细胞之前首先诊断对象有发展肺疾病或病症的风险，例如，长期吸烟者、煤矿工人和以前暴露于石棉的人。

为了用于本文所述治疗方法的所有方面，有效量的分离的非mhLSC包含每次施用至少10²、至少5X 10²、至少10³、至少5X 10³个非mhLSC、至少10⁴、至少5X 10⁴、至少10⁵、至少2X 10⁵、至少3X 10⁵、至少4X 10⁵、至少5X 10⁵、至少6X 10⁵、至少7X 10⁵、至少8X 10⁵、至少9X10⁵或至少1X 10⁶个非mhLSC或者其倍数。在一些实施方案中，对对象进行一次以上分离的非mhLSC的施用。分离的非mhLSC的多次施用可以在一段时间内发生。非mhLSC可以分离或富集自一个或多个供体，或者可以获得自自体来源。

用于本文所述方法的示例性施用模式包括但不限于注射、肺内(包括鼻内和气管内)输注、吸入(包括鼻内)和摄食。“注射”包括但不限于静脉内、动脉内、心室内、心内、经气管注射和输注。如本文所用的短语“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”是指不是肠内施用的局部施用的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、心室内、心内、经气管注射和输注。

在所述治疗方法的所有方面的优选实施方案中，通过肺内施用或递送给对象施用有效量的分离的非mhLSC。如本文定义的，肺内施用或肺内递送是指以导致这些细胞与对象的气道直接接触的方式施用分离或富集的非mhLSC群的所有施用途径，包括但不限于经气管、气管内和鼻内施用。在这类实施方案中，将细胞注射入鼻腔通道或气管。在一些实施方案中，对象直接吸入细胞。在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，细胞的肺内递送包括通过置于气管中的管或“气管插管”向插管的对象施用例如作为细胞悬浮液的细胞的施用方法。

如本文所用，“气管插管”是指将软管如塑料管插入气管。本文中命名为“经口气管插管”的最常见的气管插管是借助喉镜，使气管导管经过口、喉和声带，进入气管。然后使管的末端附近膨胀成球状(a bulb is then inflated near the distal tip of the tube)以帮助将其固定到位并保护气道不受血液、呕吐物和分泌物的影响。在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，给具有“经鼻气管插管”的对象施用细胞，经鼻气管插管定义为管经过鼻、喉、声带和气管的气管插管。

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，通过全身施用如静脉内施用给对象施用有效量的分离和富集的非mhLSC。

如本文所用的术语“全身施用”、“全身地施用”、“外周施用”和“外周地施用”是指直接进入肺以外的非mhLSC群的施用，从而其进入对象的循环系统。

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，在对象中使用一种或多种施用途径以达到不同效果。例如，通过气管内和腹腔内施用途径给对象施用分离或富集的非mhLSC群分别用于治疗与修复呼吸上皮以及用于肺血管修复和再生。在这类实施方案中，对于每种施用途径可以使用不同有效量的分离或富集的非mhLSC。

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括施用一种或多种治疗剂，如药物或分子，其可以增强或加强施用分离或富集的非mhLSC介导的效果，如增强非mhLSC的归巢或移植，增加呼吸上皮的修复，或者增加肺血管的生长和再生，即血管再生。治疗剂可以是蛋白质(如抗体或抗原结合片段)、肽、多核苷酸、适配体、病毒、小分子、化合物、细胞、药物等。如本文所定义，“血管再生”是指在损伤或创伤之后，如本文所述，包括但不限于呼吸系统疾病，从头形成新血管或替换受损的血管(例如，毛细血管)。“血管发生”是可以交换用来描述这类现象的术语。

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括施用本领域已知刺激肺组织中的细胞生长、分化和血管发生的一种或多种一起生长、分化和血管发生剂或因子。在一些实施方案中，可以在施用本文所述组合物之前或之后递送这些因子中的任一种。这些因子中任一种的多次后续递送也可以发生以诱导和/或增强移植、分化和/或血管发生。合适的生长因子包括但不限于转化生长因子-β(TGFβ)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素、表皮生长因子(EGF)、骨形态生成蛋白(BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。其他实例描述于Dijke et al.,“Growth Factors for Wound Healing”,Bio/Technology,7:793-798(1989)；Mulder GD,Haberer PA,Jeter KF,eds.Clinicians’Pocket Guide toChronic Wound Repair.4th ed.Springhouse,PA:Springhouse Corporation；1998:85；Ziegler T.R.,Pierce,G.F.,and Herndon,D.N.,1997,international Symposium onGrowth Factors and Wound Healing:Basic Science&Potential ClinicalApplications(Boston,1995,Serono Symposia USA),Publisher:Springer Verlag，并且这些整体援引加入本文。

在一实施方案中，所述组合物可以包括一种或多种生物活性剂以诱导受损组织的愈合或再生，如从周围组织募集血管形成细胞以为新生血管提供连接点。合适的生物活性剂包括但不限于药学活性化合物、激素、生长因子、酶、DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白质、脂质、聚合物、透明质酸、促炎分子、抗体、抗生素、抗炎剂、反义核苷酸和转化核酸或者其组合。其他生物活性剂可以促进细胞生长和细胞分化的有丝分裂。

本领域已知大量生长因子和分化因子刺激干细胞和祖细胞的细胞生长和分化。合适的生长因子和细胞因子包括能够刺激、维持和/或动员祖细胞的任何细胞因子或生长因子。它们包括但不限于干细胞因子(SCF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、基质细胞衍生因子-1、青灰因子(steel factor)、血管内皮生长因子(VEGF)、TGFIβ、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素(Ang)、表皮生长因子(EGF)、骨形态生成蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子(IGF-1)、白介素(IL)-3、IL-lα、IL-1β)、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、和IL-13、集落刺激因子、血小板生成素、促红细胞生成素、fit3-配体和肿瘤坏死因子α。其他实例描述于Dijke et al.,“Growth Factors for Wound Healing”,Bio/Technology,7:793-798(1989)；Mulder GD,Haberer PA,Jeter KF,eds.Clinicians’Pocket Guide to Chronic Wound Repair.4thed.Springhouse,PA:Springhouse Corporation；1998:85；Ziegler T.R.,Pierce,G.F.,and Herndon,D.N.,1997,International Symposium on Growth Factors and WoundHealing:Basic Science&Potential Clinical Applications(Boston,1995,SeronoSymposia USA),Publisher:Springer Verlag。

在所述治疗方法的所有方面的一实施方案中，所述组合物是非mhLSC在合适的生理载体溶液如盐水中的悬浮液。所述悬浮液可以包含额外的生物活性剂，包括但不限于药学活性化合物、激素、生长因子、酶、DNA、RNA、siRNA、病毒、蛋白、脂质、聚合物、透明质酸、促炎分子、抗体、抗生素、抗炎剂、反义核苷酸和转化核酸或者其组合。

在所述治疗方法的所有方面的某些实施方案中，治疗剂是“促血管生成因子”，其是指直接或间接促进新血管形成的因子。促血管生成因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、E-钙粘着蛋白、VEGF、血管生成蛋白、血管生成素-1、成纤维细胞生长因子：酸性(aFGF)和碱性(bFGF)、纤维蛋白原、纤连蛋白、乙酰肝素酶、肝细胞生长因子(HGF)、血管生成素、低氧诱导因子-1(HIF-1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、IGF、BP-3、血小板衍生生长因子(PDGF)、VEGF-A、VEGF-C、色素上皮衍生因子(PEDF)、血管通透性因子(VPF)、玻连蛋白(vitronection)、瘦素、三叶肽(TFF)、CYR61(CCN1)、NOV(CCN3)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、多效生长因子(PTN)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、c-Myc、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、基质衍生因子1(SDF-1)、扩散因子(SF)、骨桥蛋白、干细胞因子(SCF)、基质金属蛋白酶(MMP)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、pleitrophin、增殖蛋白、卵泡抑素、胎盘生长因子(PIGF)、中期因子、血小板衍生生长因子-BB(PDGF)和fractalkine，以及炎性细胞因子和趋化因子(其是血管生成和增加的血管形成的诱导物)，例如，白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、CCL2(MCP-1)、白介素-8(IL-8)和CCL5(RANTES)。一种或多种治疗剂的合适剂量可以包括约0.1-约500ng/ml、约10-约500ng/ml、约20-约500ng/ml、约30-约500ng/ml、约50-约500ng/ml或约80ng/ml-约500ng/ml的浓度。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂的合适剂量是约10、约25、约45、约60、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475或约500ng/ml。在其他实施方案中，一种或多种治疗剂的合适剂量是约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5或约2.0μg/ml。

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括施用一种或多种表面活性剂作为治疗剂，或者可以与一种或多种表面活性剂疗法组合使用。如本文所用，表面活性剂是指任何表面活性物质，包括但不限于湿润剂、表面张力抑制剂、去污剂、分散剂和乳化剂。特别优选来自肺泡表面上的单分子层的那些，包括但不限于脂蛋白、卵磷脂、磷脂酰甘油(PG)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(DPPG)、载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、棕榈酰油酰、磷脂酰甘油棕榈酸和鞘磷脂(sphygomyelin)。示例性表面活性剂包括但不限于表面活性剂蛋白A、表面活性剂蛋白B、表面活性剂蛋白C、表面活性剂蛋白D以及其混合物和组合。可商购的表面活性剂包括但不限于KL-4、牛脂质提取物表面活性剂(BLES)、HL-10、 /ALEC和

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，一种或多种其他标准治疗剂的施用可以与富集的非mhLSC的施用组合以治疗呼吸系统病症或疾病状况，例如，哮喘、RDS或COPD，包括使用抗胆碱能剂、β-2-肾上腺素受体激动剂如福莫特罗或沙美特罗、皮质类固醇、抗生素、抗氧化剂、抗高血压剂、氧化氮、咖啡因、地塞米松和IL-10或者其他细胞因子。在一些实施方案中，所包括的标准治疗剂用于治疗肺疾病的症状。表1示出一些肺疾病的一些标准医学疗法。

例如，在本文所述方法中使用非mhLSC治疗、改善或减慢疾病状况如CF的发展可以任选地与其他合适的治疗或治疗剂组合。对于CF，这包括但不限于口服或气溶胶的皮质类固醇治疗、布洛芬治疗、DNAse或IL-10治疗、饮食控制如维生素E补充、针对病原体如流感嗜血杆菌接种疫苗、胸部物理疗法如胸腔引流或叩诊或者其中的任何组合。

在所述治疗方法的所有方面的一些实施方案中，标准治疗剂是已详细描述的那些，参见，例如，Harrison’s Principles of Internal Medicine,15.sup.th edition,2001,E.Braunwald,et al.,editors,McGraw-Hill,New York,N.Y.,ISBN 0-07-007272-8,especially chapters 252-265at pages 1456-1526；Physicians Desk Reference54.sup.th edition.2000,pages 303-3251,ISBN 1-56363-330-2,Medical EconomicsCo.,Inc.,Montvale,N.J.。任何肺疾病、呼吸系统或肺疾病状况的治疗可以利用本文所述治疗方案完成。对于慢性疾病状况，间歇剂量施用可以用来降低治疗频率。间歇剂量施用方案如本文所述。

对于本文所述方法的临床使用，本文所述富集的非mhLSC的分离或富集群可以与任何药学可接受的化合物、材料、载体或组合物一起施用，这导致对象中的有效治疗。因此，用于本文所述方法的药物制剂可以包含分离或富集的非mhLSC群与一种或多种药学可接受的成分组合。

术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药学载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内施用时，水是优选载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇(propylene,glycol)、水、乙醇等。如果期望，所述组合物还可以包含较小量的湿润剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。所述组合物可以用传统粘合剂和载体如甘油三酯配制为栓剂。口服制剂可以包括标准载体如医药等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药学载体的实例描述于Remington’s PharmaceuticalSciences,18th Ed.,Gennaro,ed.(Mack Publishing Co.,1990)。所述制剂应当适合施用模式。

在一实施方案，术语“药学可接受的”表示联邦或州政府的监管机构批准或者美国药典或其他公认的药典列出用于动物，更特别是用于人。具体地，它是指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医疗判断范围内，适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，具有合理的益处/风险比。

如本文所用的短语“药学可接受的载体”表示药学可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、培养基(例如，干细胞培养基)、包裹材料、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌、或者硬脂酸)、或者溶剂包裹材料，参与维持活性，携带，或者将分离或富集的LSC群从一个器官或身体部分转运至另一器官或身体部分。

在与制剂的其他成分相容的意义上，每种载体必须“可接受”，并且对患者无害。可以用作药学可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)磷酸盐缓冲溶液；(3)不含热原的水；(4)等渗盐水；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂，(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(17)粉状黄芪胶；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨胀剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，如乙醇；(25)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；以及(26)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。湿润剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味(flavoring)剂、加香(perfuming)剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学可接受的载体”等在本文中可交换使用。

定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。这里收集本文说明书、实施例和权利要求书中采用的某些术语。

如本文所用，体内(“活体内”的拉丁语)是指利用完整的活生物体如人对象的那些方法。如本文所用，“离体”(拉丁语：活体外)是指在对象体外进行的那些方法，并且是指其中从活体取下器官、细胞或组织用于手术的那些手术，例如，从获得自供体对象的肺组织分离非mhLSC，然后给受体对象施用分离的非mhLSC样品。如本文所用，“体外”是指在对象外进行的那些方法，如体外细胞培养实验。例如，在根据本文所述方法使用或施用之前，可以在体外培养分离的非mhLSC以扩增或增加非mhLSC的数量，或者指导非mhLSC分化为特定谱系或细胞类型，例如，呼吸上皮细胞。

如本文所用的术语“多能”是指具有这样的能力的细胞，在不同条件下，其定向至一种或多种特定细胞类型谱系并分化为定向谱系的一种以上分化的细胞类型，并且优选分化为全部三个生殖细胞层的细胞类型特征。多能细胞的特征主要在于它们分化为一种以上细胞类型的能力，优选全部三个胚层，例如，利用裸鼠畸胎瘤形成测定。多能性还通过胚胎干(ES)细胞标记的表达证实，虽然多能性的优选测试是证实分化为三个胚层中每个的细胞的能力。应当注意简单地培养这类细胞，靠其自身不会使它们具有多能性。相对于一般在培养中仅有有限数量分裂的能力的原代细胞亲代，重编程的多能细胞(例如，iPS细胞，本文定义了该术语)还具有延长传代而不丢失生长潜力的能力的特征。

如本文所用的术语“祖”细胞是指相对于其通过分化可以产生的细胞具有更原始的细胞表型的细胞(即，沿着发育途径或发展在比完全分化或最终分化的细胞早的步骤)。通常，祖细胞还具有显著或非常高的增殖潜能。祖细胞可以产生多种不同分化的细胞类型或单一分化的细胞类型，取决于发育途径以及其中细胞发育和分化的环境。祖细胞产生特定决定谱系的前体细胞，例如，某些肺祖细胞分裂产生肺上皮谱系前体细胞。这些前体细胞分裂并产生许多最终分化为肺上皮细胞的细胞。

如本文所用的术语“前体”细胞是指这样的细胞，其具有比最终分化的细胞更原始的细胞表型，但是比其相同发育途径上的干细胞或祖细胞较不原始。“前体”细胞通常是“祖”细胞的子代细胞，祖细胞是“干细胞”的一些子代。典型不对称细胞分裂的子代之一承担干细胞的作用。

术语“胚胎干细胞”用来指胚胎胚泡的内细胞团的多能干细胞(参见美国专利号5843780、6200806)。这类细胞可以相似地获得自胚泡的内细胞团，所述胚泡源自体细胞核转移(参见，例如，美国专利号5945577、5994619、6235970)。胚胎干细胞的区别特征定义胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一个或多个独特特征，则其具有胚胎干细胞的表型，从而可以区分该细胞与其他细胞。示例性区分胚胎干细胞特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的反应性等。

术语“成体干细胞”用来指源自非胚胎组织的任何专能干细胞，包括胎儿、青少年和成体组织。在一些实施方案中，成体干细胞可以是非胎儿来源的。干细胞已分离自广泛的成体组织，包括血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰、骨骼肌和心肌。这些干细胞中的每种可以基于基因表达、因子反应性和培养中的形态学表征。示例性成体干细胞包括神经干细胞、神经嵴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞和胰腺干细胞。如上所示，几乎在每个组织中都发现了干细胞。因此，本发明认为干细胞群可以分离自几乎任何动物组织。

在细胞个体发生的上下文中，形容词“分化的”或“分化”是相对术语，表示“分化的细胞”是比其比较的细胞在发育途径上进一步发展的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制性前体细胞(如肺干细胞)，其转而可以分化为途径进一步向下的其他类型的前体细胞(如胸腺细胞，或T淋巴细胞前体)，然后成为最终阶段分化细胞，其在某种组织类型中起特定作用，并且可以保留或不保留进一步增殖的能力。

术语“分化的细胞”表示在其天然形式在不是多能的任何原代细胞，多能如该术语在本文中定义的。换句话说，术语“分化细胞”是指在细胞分化过程中源自较不特化的细胞类型的细胞(例如，干细胞如肺干细胞)的更特化的细胞类型的细胞。不希望被理论限制，正常个体发生过程中的多能干细胞可以首先分化为能够形成造血干细胞的内皮细胞和其他细胞类型。肺干细胞的进一步分化导致形成各种肺细胞类型，包括肺细胞I型和II型细胞类型、内皮细胞类型、平滑肌和上皮细胞。

如本文所用，术语“体细胞”是指形成生物体的任何细胞，与生殖细胞相反。在哺乳动物中，生殖细胞(也称作“配子”)是在受精期间融合产生称作合子的细胞的精子和卵子，整个哺乳动物胚胎由合子发育。哺乳动物身体中的每种其他细胞类型—除了精子和卵子，产生精子和卵子的细胞(配子母细胞)和未分化的干细胞—是体细胞：内部器官、皮肤、骨、血液和结缔组织全部由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，表示体细胞不存在于胚胎中或不获得自胚胎，并且不由这样的细胞体外增殖所致。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，表示存在于胚胎或胎儿以外的生物体或者获得自胚胎或胎儿以外的生物体的细胞，或者由这样的细胞体外增殖所致。

如本文所用，术语“成体细胞”是指胚胎发育之后在整个身体发现的细胞。

术语“表型”是指在一组特定环境条件和因素下定义细胞或生物体的总生物学特征的一个或许多个，无论实际基因型。例如，细胞中细胞表面标记的表达。

术语“细胞培养基”(在本文中也称作“培养基”或“介质”)在本文中是指用于培养细胞的介质，其包含维持细胞活力和支持增殖的营养素。细胞培养基可以包含适当组合的任何以下物质：盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代品以及其他组分如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。

术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中可交换使用，用来指干细胞长期和/或数月至数年通过分裂为相同的非特化细胞类型来更新自己的能力。

在某些情况下，“增殖”是指通过单细胞重复分裂为两个相同的子细胞来扩增细胞。

术语“谱系”在本文中用来描述具有共同祖先的细胞或具有共同发育命运的细胞。

如本文所用的术语“分离的细胞”是指已从其中最初发现它的器官取出的细胞或这样的细胞的后代。任选地，细胞已在体外培养，例如，在其他细胞的存在下。任选地，后来将细胞引入第二生物体或重新引入分离它(或它的下一代细胞)的生物体。

如本文所用关于分离的细胞群的术语“分离的群”是指已从细胞的混合或异质群取出或分离的细胞群。在一些实施方案中，与分离或富集细胞的异质群相比，分离的群是基本上纯的细胞群。

术语“组织”是指一起进行某些特殊功能的一组或一层特化细胞。术语“组织特异性”是指来自特定组织的细胞来源。

术语“减少”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”、“减少”或“抑制”在本文中一般全部用来表示减少统计上显著的量。但是，为了避免疑义，“降低(reduced)”、“降低(reduction)”、“减少”或“抑制”通常表示与参考水平相比减少至少约5％-10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％减少(即，与参考样品相比不存在的水平)，或者与参考水平相比10-90％之间的任何减少。在治疗或预防的上下文中，参考水平是在不存在施用非mhLSC群下对象中的症状水平。

术语“增加的”、“增加”或“增强”在本文中一般全部用来表示增加统计显著的量；为了避免任何疑义，术语“增加的”、“增加”或“增强”表示与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平增加约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％增加或更多或者10-90％之间的任何增加，或者至少约2-倍、或至少约3-倍、或至少约4-倍、或至少约5-倍或至少约10-倍增加，或者与参考水平相比2-倍和10-倍之间的任何增加。在体外非mhLSC扩增的上下文中，参考水平是分离自肺组织样品的非mhLSC的起始数量。

术语“统计上显著”或“显著”是指统计显著性，一般表示低于正常标记浓度两个标准差(2SD)，或者更低。该术语是指有差异的统计证据。其定义为当虚假设是真的时做出拒绝虚假设决定的概率。常利用p-值做决定。

如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”关于本发明至关重要的组合物、方法和各组分使用，允许包含未指定的元素，无论是否必不可少。

术语“由…组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各组分，其不包括实施方案的该描述中未列举的任何要素。

除非另有解释，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学中常用术语的定义可以在Benjamin Lewin,GenesIX,published by Jones&Bartlett Publishing,2007(ISBN-13:9780763740634)；Kendrewet al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by BlackwellScience Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCHPublishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。

除非另有说明，本发明利用本领域技术人员已知的标准方法进行，例如，Maniatiset al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,USA(1989)；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986)；Current Protocols inMolecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel,et al.ed.,John Wiley and Sons,Inc.),Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,et.al.,ed.John Wiley andSons,Inc.),Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacinoet.al.ed.,John Wiley and Sons,Inc.),Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique by R.Ian Freshney,Publisher:Wiley-Liss；5th edition(2005)and AnimalCell Culture Methods(Methods in Cell Biology,Vol.57,Jennie P.Mather and DavidBarnes editors,Academic Press,1st edition,1998)，全部整体援引加入本文。

应当理解本发明并不限于本文描述的具体方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，其仅由权利要求书定义。

除了操作实例，或者另有说明，本文使用的所有表达成分或反应条件量的数字应当理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。当与百分比关联使用时，术语“约”表示±1％。

所有提及的专利和出版物均为了描述和公开的目的明确地援引加入本文，例如，可能关于本发明使用的这类出版物中描述的方法。这些出版物仅提供它们在本发明的提交日期之前的公开。在这方面不应当理解为承认发明人无权凭借先前发明或为了任何其他原因提前这样的公开。截至目前的所有声明或关于这些文件内容的陈述是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

在一些实施方案中，本发明可以在任何以下按字母顺序排列的段落中定义：

[A]一种药物组合物，其包含：富集的来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞群，其中c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)；以及药学可接受的载体。

[B]段落[A]的药物组合物，其中所述肺组织来自成年人。

[C]段落[A]或[B]的药物组合物，其中将所述非mhLSC进一步离体扩增。

[D]一种制备分离的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中所述非mhLSC在包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)的c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)的池中，所述方法包括：从对象获得人肺组织；从来自人肺组织的hLSC池选择非mhLSC；以及在培养基中增殖所述细胞。

[E]一种分离的增殖c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中所述非mhLSC在包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)的c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池中，所述方法包括：从来自人肺组织样品的hLSC池选择至少一个非mhLSC；将所述至少一个所选择的非mhLSC引入培养基；以及在培养基中增殖所述至少一个所选择的非mhLSC。

[F]一种治疗或预防有需要的对象中的肺疾病或病症的方法，所述方法包括：从有需要的对象或不同对象获得人肺组织；从所述肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；扩增所述非mhLSC群；以及给有需要的对象施用所述扩增的非mhLSC群。

[G]一种在有需要的对象中修复和/或再生受损肺组织的方法，所述方法包括：从肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；培养并扩增所述非mhLSC群；以及以对修复和/或再生受损的肺组织有效的剂量施用所述提取并扩增的非mhLSC群至对象中的受损肺组织区域。

[H]段落[D]-[G]中任一段的方法，其中所述人肺组织是成年人肺组织。

[I]段落[D]-[H]中任一段的方法，其中在选择或提取非mhLSC之前，所述人肺组织是低温保存的。

[J]段落[D]-[I]中任一段的方法，其中利用针对c-kit的抗体进行非mhLSC的选择或提取。

[K]段落[D]-[J]中任一段的方法，进一步包括对间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记进行负向选择。

[L]任何段落[D]-[K]的方法，其中所述选择是通过流式细胞术进行的。

[M]任何段落[D]-[K]的方法，其中所述选择是通过用缀合至珠的c-kit抗体的免疫磁性选择进行的。

[N]段落[D]-[M]中任一段的方法，进一步包括低温保存所述非mhLSC。

[O]段落[F]-[N]中任一段的方法，进一步包括施用至少一种治疗剂。

[P]段落[F]-[O]中任一段的方法，其中非mhLSC群修复、重建和/或生成肺上皮、肺血管/肺内皮和/或肺泡。

[Q]段落[F]-[P]中任一段的方法，进一步包括在施用富集的非mhLSC群之前选择患有肺疾病或病症的对象。

[R]段落[F]-[Q]中任一段的方法，进一步包括在施用非mhLSC之前选择需要恢复受损肺的结构和功能完整性的对象。

[S]段落[F]-[R]中任一段的方法，进一步包括在施用所述细胞之前选择需要治疗、预防、修复、重建或生成肺血管或者肺上皮、肺内皮或肺泡的对象。

[T]段落[F]-[S]中任一段的方法，其中所述施用是肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。

[U]段落[T]的方法，其中所述肺内施用是气管内或鼻内施用。

[V]一种用于治疗和/或预防对象中的肺疾病或病症的组合物，所述组合物包含富集的来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞群，其中所述c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)。

[W]段落[V]的组合物，其中所述肺组织来自成年人。

[X]段落[V]或[W]的组合物，其中将所述c-kit细胞进一步离体扩增。

[Y]一种治疗或预防有需要的对象中的肺部病症的方法，所述方法包括施用段落[A]-[C]中任一段的药物组合物。

[Z]一种治疗或预防有需要的对象中的肺部病症的方法，所述方法包括施用段落[V]-[X]中任一段的组合物。

[AA]段落[Y]或[Z]的方法，进一步包括施用至少一种治疗剂。

[BB]段落[Y]-[AA]中任一段的方法，其中非mhLSC群修复、重建和/或产生肺上皮、肺血管/肺内皮和/或肺泡。

[CC]段落[Y]-[BB]中任一段的方法，进一步包括在施用富集非mhLSC的群之前选择患有肺部病症的对象。

[DD]段落[Y]-[CC]中任一段的方法，进一步包括在施用所述细胞之前选择需要恢复受损肺的结构和功能完整性的对象。

[EE]段落[Y]-[DD]中任一段的方法，进一步包括在施用所述细胞之前选择需要治疗、预防、修复、重建或生成肺血管或者肺上皮、肺内皮或肺泡的对象。

[FF]段落[Y]-[EE]中任一段的方法，其中所述施用是肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。

[GG]段落[FF]的方法，其中所述肺内施用是气管内或鼻内施用。

通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当理解为限制性的。本申请中引用的所有参考文献的内容以及图和表援引加入本文。

本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物，不同培养基和补充物可以用来培养扩增分离的细胞。本领域技术人员能够进行测试以评价培养基和补充物的选择。以下权利要求书意图涵盖这类等同物。

本文和整个说明书中引用的参考文献援引加入本文。

实施例

人中的慢性阻塞性肺病(COPD)的特征在于慢性炎症、细支气管和肺泡的扩增、肺泡壁的破坏、纤维化和最终的呼吸衰竭(1-6)。端粒磨损和细胞衰老增加对肺气肿易感性并加重COPD(7-10)。导致肺气肿的吸烟构成额外的负因素，其有助于减少肺扩散能力(11,12)。重要的是，这种疾病的病因是未知的，并且没有能够逆转COPD病理的治疗。在晚期形式中，唯一的希望是肺移植。

另一严重疾病是特发性肺纤维化(IPF)；其主要发生在60岁及以上的患者中，并且死亡率很高(13-15)。已肯定遗传因素、环境危害和病毒感染有助于IPF的发生和发展(14)。已在IPF中发现端粒酶突变和端粒缩短(16-24)。如COPD，目前对IPF没有成熟的治疗，并且没有可用的疗法延长该患者群的生存(25)。相似地，继发性进行性肺纤维化(PPF)具有毁灭性的临床结果(26-29)。不可否认COPD和IPF/PPF需要实施新策略以定义它们的病理生理学并开发创新的治疗形式。

最近，研究了不需要(declined for)移植的对照肺(n＝13)以及IPF/PPF(n＝8)和COPD(n＝7)分离的(explanted)肺(图1)。发明人发现c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)池由以下细胞组成：间充质表位CD44/CD73/CD105阴性的一类细胞，即非间充质hLSC(非mhLSC)，以及表达这些表位(图2A)并分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的另一类细胞，即间充质样hLSC(ml-hLSC)。两种细胞类型均具有组织特异性成体干细胞的特征，即自我更新和克隆形成(图2B和2C)。源自对照和IPF/PPF的非mhLSC的大多数克隆表现出干细胞形成集落的特征；它们具有紧凑的圆形(图2B；左侧两幅)。在对照非mhLSC偶尔发现具有屈光边缘的非圆形不规则形状克隆，但是在IPF/PPF非mhLSC达到29％的值(图2B；右侧两幅)。相反地，对照和IPF/PPF mhLSC仅形成非圆形克隆。重要的是，圆形克隆由c-kit强阳性、高核质比且间充质表位CD44/CD73/CD105阴性的未分化的细胞组成(图2C；左图)。但是，非圆形克隆的特征在于c-kit弱标记、低核质比且CD44/CD73/CD105阳性的细胞(图2C；中图和右图)。对照肺中非mhLSCs(77％)和ml-hLSCs(23％)的比例随着IPF/PPF和COPD显著改变，其中ml-hLSCs和非mhLSC各自接近50％(图2D)。

相关地，克隆非mhLSC分化为肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞(未示出)，而克隆ml-hLSC不获得上皮和血管细胞谱系。来自IPF/PPF肺的ml-hLSC生成大量的成纤维细胞/成肌纤维细胞并高速侵袭matrigel，获得成肌纤维细胞表型(图3)。这些数据表明在IPF/PPF，ml-hLSC具有使它们成为肺病理学候选的特征。患有COPD，ml-hLSC的增加和非mhLSC的减少减弱COPD肺形成气体交换单元的能力，并且这可能导致肺泡扩增、肺泡壁破坏和呼吸衰竭。

重要的是，功能性非mhLSC的亚群存在于IPF/PPF和COPD肺中，并且如这里所示，可以在体外收获并繁殖这些细胞。未来，应当可以努力实施自体细胞疗法以逆转IPF/PPF和COPD的毁灭性结果。

参考文献

Salazar LM,Herrera AM.Fibrotic response of tissue remodeling inCOPD.Lung.2011；189:101-109.

Burgel PR,Bourdin A,Chanez P,Chabot F,Chaouat A,Chinet T,de Blic J,Devillier P,Deschildre A,Didier A,Garcia G,Jebrak G,Laurent F,Morel H,PerezT,Pilette C,Roche N,Tillie-Leblond I,Verbanck S,Dusser D.Update on the rolesof distal airways in COPD.Eur Respir Rev.2011；20:7-22

Hinata N,Martin JG.Mechanisms of airway remodeling.Chest.2013；144:1026-1032.

Sohal SS,Ward C,Danial W,Wood-Baker R,Walters EH.Recent advances inunderstanding inflammation and remodeling in the airways in chronicobstructive pulmonary disease.Expert Rev Respir Med.2013；7:275-288.

Bagdonas E,Raudoniute J,Bruzauskaite I,Aldonyte R.Novel aspects ofpathogenesis and rcgcncration mechanisms in COPD.Int J Citron Obstruct PulmonDis.2015；10:995-1013.

Barnes PJ.Inflammatory mechanisms in patients with COPD.J AllergyClin Immunol.2016；138:16-27.

Tsuji T,Aoshiba K,Nagai A.Alveolar cell senescence in patients withpulmonary emphysema.Am J Respir Crit Care Med.2006；174:886-893.

Tsuji T,Aoshiba K,Nagai A.Alveolar cell senescence exacerbatespulmonary inflammation in patients with chronic obstructive pulmonarydisease.Respiration.2010；80:59-70.

Alder JK,Guo N,Kembou F,Parry EM,Anderson CJ,Gorgy AI,Walsh MF,SussanT,Biswal S,Mitzner W,Tuder RM,Armanios M.Telomere length is a determinant ofemphysema susceptibility.Am J Respir Crit Care Med.2011.

Amsellem V,Gary-Bobo G,Marcos E,Maitre B,Chaar V,Validire P,Stern JB,Noureddine H,Sapin E,Rideau D,Hue S,Le Corvoisier P,Le Gouvello S,Dubois-Rande JL,Boczkowski J,Adnot S,Telomere dysfunction causes sustainedinflammation in chronic obstructive pulmonary disease.Am J Respir Crit CareMed.2011；184:1358-1366.

Viegi G,Sherrill DL,Carrozzi L,Di Pede F,Baldacci S,Pistelli F,Enright P.An 8-year follow-up of carbon monoxide diffusing capacity in ageneral population sample of northern Italy.Chest.2001；120:74-80.

Kapella MC,Larson JL,Covey MK,Alex CG.Functional performance inchronic obstructive pulmonary disease declines with time.Med Sci SportsExerc.2011；43:218-224.

Mulugeta S,Nureki S,Beers MF.Lost after translation:insights frompulmonary surfactant for understanding the role of alveolar epithelialdysfunction and cellular quality control in fibrotic lung disease.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol.2015；309:L507-525.

Elmufdi F,Henke CA,Perlman DM,Tomic R,Kim HJ.Novel mechanisms andtreatment of idiopathic pulmonary fibrosis.Discov Med.2015；20:145-153.

Sgalla G,Bill A,Richeldi L.Idiopathic pulmonary fibrosis:Diagnosis,epidemiology and natural history.Respirology.2016；21:427-437.

Calado RT,Young NS.Telomere diseases.N Engl J Med.2009；361:2353-2365.

Mushiroda T,Wattanapokayakit S,Takahashi A,Nukiwa T,Kudoh S,Ogura T,Taniguchi H,Kubo M,Kamatani N,Nakamura Y；Pirfenidone Clinical Study Group.Agenome-wide association study identifies an association of a common variantin TERT with susceptibility to idiopathic pulmonary fibrosis.J MedGenet.2008；45:654-656.

Cronkhite JT,Xing C,Raghu G.Chin KM,Torres F,Rosenblatt RL,GarciaCK.Telomere shortening in familial and sporadic pulmonary fibrosis.Am JRespir Crit Care Med.2008；178:729-737.

Bone R,Crestani B,Bichat H.Prevalence of telomere shortening infamilial and sporadic pulmonary fibrosis is increased in men.Am J Respir CritCare Med.2009；179:1073.

Waisberg DR,Baibas-Filho JV,Parra ER,Fernezlian S,de Carvalho CR,Kairalla RA,Capelozzi VL.Abnormal expression of telomerase/apoptosis limitstype II alveolar epithelial cell replication in the early remodeling of usualinterstitial pneumonia/idiopathic pulmonary fibrosis.Hum Pathol.2010；41:385-391.

Armanios M.Telomerase and idiopathic pulmonary fibrosis.MutatRes.2012；730:52-58.

Alder JK,Cogan JD,Brown AF,Anderson CJ,Lawson WE,Lansdorp PM,PhillipsJA 3rd,Loyd JE,Chen JJ,Armanios M.Ancestral mutation in telomerase causesdefects in repeat addition processivity and manifests as familial pulmonaryfibrosis.PLoS Genet.2011；7:e1001352.

El-Chemaly S,Ziegler SG,Calado RT,Wilson KA,Wu HP,Haughey M,PetersonNR,Young NS,Gahl WA,Moss J,Gochuico BR.Natural history of pulmonary fibrosisin two subjects with the same telomerase mutation.Chest 2011；139:1203-1209.

Diaz de Leon A,Cronkhite JT,Yilmaz C,Brewington C,Wang R,Xing C,HsiaCC,Garcia CK.

Subclinical lung disease,macrocytosis,and premature graying inkindreds with telomerase(TERT)mutations.Chest.2011；140:753-763.

Canestaro WJ,Forrester SH,Raghu G,Ho L,Devine BE.Drug treatment ofidiopathic pulmonary fibrosis:systematic review and network meta-analysis.Chest.2016；149:756-766.

Veeraraghavan S,Nicholson AG,Wells AU.Lung fibrosis:newclassifications and therapy.Curr Opin Rheumatol.2001；13:500-504.

de Lauretis A,Veeraraghavan S,Renzoni E.Review series:Aspects ofinterstitial lung disease:connective tissue disease-associated interstitiallung disease:how does it differ from IPF？How should the clinical approachdiffer？Chron Respir Dis.2011；8:53-82.

Katzenstein AL.Smoking-related interstitial fibrosis(SRIF),pathogenesis and treatment of usual interstitial pneumonia(UIP),andtransbronchial biopsy in UIP.Mod Pathol.2012；25 Suppl 1:S68-78.

Noble PW,Barkauskas CE,Jiang D.Pulmonary fibrosis:patterns andperpetrators.J Clin Invest.2012；122:2756-2762.

表1.一些肺疾病的标准疗法。

Claims (46)

1.一种药物组合物，其包含：

富集的来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞群，其中所述c-kit阳性肺干细胞是间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的(非mhLSC)；以及

药学可接受的载体。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述肺组织来自任何年龄的对象。

3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述非mhLSC群可以分化为肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞或其组合。

4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述非mhLSC群是自我更新和克隆形成性的。

5.权利要求1-4任一项的药物组合物，其中将所述非mhLSC群进一步离体扩增。

6.权利要求1-5任一项的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。

7.权利要求6的药物组合物，其中所述肺内施用是气管内或鼻内施用。

8.一种制备分离的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中所述非mhLSC在c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)的池中，所述hLSC包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)，所述方法包括：

a.从对象获得人肺组织；

b.从来自人肺组织的hLSC池选择非mhLSC；以及

c.在培养基中增殖所述细胞。

9.一种增殖分离的c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的肺干细胞(非mhLSC)群的方法，其中所述非mhLSC在c-kit阳性人肺干细胞(hLSC)的池中，所述hLSC包含非mhLSC以及c-kit和CD44、CD73和CD105标记阳性的间充质样肺干细胞(ml-hLSC)，所述方法包括：

a.从来自人肺组织样品的hLSC池选择至少一个非mhLSC；

b.将所述至少一个所选择的非mhLSC引入培养基；以及

c.在培养基中增殖所述至少一个所选择的非mhLSC。

10.一种在有需要的对象中治疗或预防肺疾病或病症的方法，所述方法包括：

a.从有需要的对象或不同对象获得人肺组织；

b.从所述肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；

c.扩增所述非mhLSC群；以及

d.给有需要的对象施用所述扩增的非mhLSC群。

11.一种在有需要的对象中修复和/或再生受损肺组织的方法，所述方法包括：

a.从肺组织提取c-kit阳性并且间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记阴性的干细胞(非mhLSC)群；

b.培养并扩增所述非mhLSC群；以及

c.以对修复和/或再生受损的肺组织有效的剂量施用所述提取并扩增的非mhLSC群至对象中受损肺组织的区域。

12.权利要求8-11任一项的方法，其中所述人肺组织是成体或非成体肺组织。

13.权利要求8-12任一项的方法，其中在选择或提取非mhLSC之前，所述人肺组织是低温保存的。

14.权利要求8-13任一项的方法，其中利用针对c-kit的抗体进行非mhLSC的选择或提取。

15.权利要求8-14任一项的方法，进一步包括对间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记进行负向选择。

16.权利要求8-15任一项的方法，其中所述选择是通过流式细胞术进行的。

17.权利要求8-15任一项的方法，其中所述选择是通过用缀合至珠的c-kit抗体的免疫磁性选择进行的。

18.权利要求8-17任一项的方法，进一步包括低温保存所述非mhLSC。

19.权利要求10-18任一项的方法，进一步包括给对象施用至少一种治疗剂。

20.权利要求10-19任一项的方法，其中所述非mhLSC群修复、重建和/或生成肺上皮、肺血管/肺内皮和/或肺泡。

21.权利要求10-20任一项的方法，进一步包括在施用所述非mhLSC群之前选择患有肺疾病或病症的对象。

22.权利要求10-21任一项的方法，进一步包括在施用所述非mhLSC群之前，选择需要恢复受损的肺的结构和功能完整性的对象。

23.权利要求10-22任一项的方法，进一步包括在施用所述非mhLSC群之前，选择需要治疗、预防或修复或重建或生成肺血管或者肺上皮、肺内皮或肺泡的对象。

24.权利要求10-23任一项的方法，其中所述施用是肺内施用、静脉内施用、全身施用或其组合。

25.权利要求24的方法，其中所述肺内施用是气管内或鼻内施用。

26.权利要求10-25任一项的方法，其中所述肺疾病或病症是慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)或进行性肺纤维化(PPF)的一种或多种。

27.权利要求10-26任一项的方法，其中所述非mhLSC群是自体的。

28.权利要求10-26任一项的方法，其中所述非mhLSC群是同种异体的。

29.一种用于治疗和/或预防对象中的肺疾病或病症的组合物，所述组合物包含富集的来自人肺组织样品的分离的c-kit阳性肺干细胞群，其中所述c-kit阳性肺干细胞间充质基质细胞谱系的CD44、CD73和CD105标记是阴性的(非mhLSC)。

30.权利要求29的组合物，其中所述肺组织来自任何年龄的对象。

31.权利要求29或30的组合物，其中所述非mhLSC群可以分化为肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞或其组合。

32.权利要求29-31任一项的组合物，其中所述非mhLSC群是自我更新和克隆形成性的。

33.权利要求29-32任一项的组合物，其中将所述非mhLSC群进一步离体扩增。

34.权利要求29-33任一项的组合物，其中所述组合物配制用于肺内施用、静脉内施用、全身施用或其组合。

35.权利要求34的组合物，其中所述肺内施用是气管内或鼻内施用。

36.权利要求29-35任一项的组合物，其中所述肺疾病或病症是慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)或进行性肺纤维化(PPF)的一种或多种。

37.一种在有需要的对象中治疗或预防肺疾病或病症的方法，所述方法包括施用权利要求1-7任一项的药物组合物。

38.一种在有需要的对象中治疗或预防肺疾病或病症的方法，所述方法包括施用权利要求29-36任一项的组合物。

39.权利要求37或38的方法，进一步包括施用至少一种治疗剂。

40.权利要求37-39任一项的方法，其中所述非mhLSC群修复、重建和/或生成肺上皮、肺血管/肺内皮和/或肺泡。

41.权利要求37-40任一项的方法，进一步包括在施用所述非mhLSC群之前，选择患有肺病症的对象。

42.权利要求37-41任一项的方法，进一步包括在施用所述非mhLSC群之前，选择需要恢复受损的肺的结构和功能完整性的对象。

43.权利要求37-42任一项的方法，进一步包括在施用所述非mhLSC群之前，选择需要治疗、预防或修复或重建或生成肺血管或者肺上皮、肺内皮或肺泡的对象。

44.权利要求37-43任一项的方法，其中所述施用是肺内施用、全身施用、静脉内施用或其组合。

45.权利要求44的方法，其中所述肺内施用是气管内或鼻内施用。

46.权利要求37-45任一项的方法，其中所述肺疾病或病症是慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)或进行性肺纤维化(PPF)的一种或多种。