CN110156863A

CN110156863A - 一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法

Info

Publication number: CN110156863A
Application number: CN201810146308.5A
Authority: CN
Inventors: 韩明; 殷警菲; 陈玮
Original assignee: Jilin Zixin Shentang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jilin Zixin Cangongtang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN110156863B

Abstract

本发明涉及一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，该方法采用反相高效色谱柱分离纯化人参皂苷提取物，洗脱溶剂组成为乙醇与水混合，洗脱方式为等流速或变流速稳压洗脱，并根据检测洗脱液中人参皂苷的含量以及结合吸附模型调整洗脱参数，完成洗脱分离，从而得到较好纯度的人参皂苷Rg1，Rb1和Rd，尤其是得到高纯度的人参皂苷Rd；本发明提供的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法对人参皂苷分离纯度高，分离效率高，节约溶剂，节能降耗，安全环保，提高了产品经济价值，有利于规模化生产。

Description

一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法

技术领域

本发明涉及天然产物中间体反相柱色谱分离纯化工艺过程控制领域，具体涉及人参皂苷Rd反相高效柱色谱自动控制分离纯化方法。

背景技术

人参是我国传统的名贵中药材，人参皂苷是人参的主要有效成分，它具有人参的主要生理活性，现已明确知道的人参皂苷单体约有50余种；在人参中的含量占4％左右，具有促进物质代谢、提高人体免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老等作用。

人参皂苷Rd作为人参提取物中重要的皂苷类物质，具有特异性阻断受体依赖性钙离子通道的功能，在肾功能保护、调节免疫、抑制肿瘤细胞生长、防辐射方面有其他单体皂苷没有的独特作用；在镇痛、神经保护作用方面Rd相对于其他单体皂苷也较强。因此人参皂苷Rd可开发成防辐射，治疗心血管疾病、炎症、创伤以及由损伤引起的体内外出血等方面的药物。

中药大孔吸附树脂层析工艺是一种常见的精制工艺，其被用于人参总皂苷提取物的精制过程中。大孔吸附树脂层析工艺一般包括上样，冲洗和洗脱三个步骤。不同的组分在树脂柱上吸附能力不一，随着流动相分别按顺序流出层析柱。

目前，人参皂苷Rd的提取分离方法主要采用大孔吸附树脂吸附分离和高速逆流色谱法(HSCCC)以及正相硅胶柱层析法。由于人参皂苷之间结构相似，理化性质差别小，单体之间的分配行为接近，因此分离难度大。大孔吸附树脂的洗脱需要大量溶剂，成本高，工业化生产难度大。HSCCC法虽然制备的产品纯度高，分离效率差，不适合大规模工业化生产。正相硅胶柱层析法洗脱机采用氯仿-甲醇-水系统，纯化过程引入有毒试剂氯仿，并且分离纯度不高，溶剂消耗量大，生产过程不宜控制，且生产过程没有质量监控，不适于工业化生产。虽然近年来，关于天然产物分离提取的报道较多，但可应用于工业化生产的方法很少。

可见，获取高纯度人参皂苷Rd单体方法的不足一直是制约人参皂苷单体科学研究和医药临床应用的主要原因。

因此，亟需开发一种分离纯度高、分离效率高、节约溶剂、安全环保的人参皂苷Rd分离纯化方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：采用反相高效色谱柱分离纯化人参皂苷提取物，洗脱溶剂组成为乙醇与水混合，洗脱方式为等流速或变流速稳压洗脱，并根据检测人参皂苷含量的结果以及结合吸附模型调整洗脱参数，完成洗脱分离，而得到较好纯度的人参皂苷Rg1，Rb1和Rd，尤其是得到高纯度的人参皂苷Rd，本发明提供的自动控制分离纯化方法分离纯度高，分离效率高，节约溶剂，安全环保，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供以下方面：

(1)一种人参皂苷Rd分离纯化方法，采用反相高效色谱柱分离纯化人参皂苷提取物，洗脱溶剂组成为乙醇、水中的一种或两种混合，洗脱方式为等流速或变流速稳压洗脱。

(2)一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1：根据色谱柱洗脱能力和洗脱目标设定洗脱参数；

所述洗脱参数包括洗脱溶剂种类、洗脱溶剂体积比、洗脱溶剂流速以及洗脱溶剂用量；

步骤2：用洗脱溶剂对色谱柱进行洗脱；

步骤3：检测洗脱液中人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的含量，得到检测结果；

步骤4：将检测结果与洗脱目标对比，达到洗脱目标，则收集洗脱液馏分；

步骤5：洗脱完成。

根据本发明提供的一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，具有以下有益效果：

1)本发明提供的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法可以实现对人参茎叶提取物和人参提取物中人参皂苷Rd的柱色谱洗脱分离过程的自动控制，定性分析，定量洗脱和产品收集精准控制；

2)本发明提供的自动控制分离纯化方法可以提高人参皂苷Rd批处理纯化过程的可重复性，有利于提高人参皂苷Rd纯化产品的含量，分离纯度高，分离效率高；

3)本发明提供的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法可采用环境友好型洗脱剂，并能大大降低洗脱剂的用量，安全环保，节能降耗；

4)本发明提供的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法简单，适合大规模工业化生产，降低了成本，从而提高了产品的经济价值。

附图说明

图1示出本发明人参皂苷Rd反相高效柱色谱分离纯化过程自动控制系统示意图；

图2示出本发明人参皂苷Rd反相高效柱色谱自动控制分离纯化方法示意图；

图3示出实施例1中上样原料的含量分析谱图；

图4(a)示出实施例1中分离纯化产物Rg1的含量分析谱图；

图4(b)示出实施例1中分离纯化产物Rb1的含量分析谱图；

图4(c)示出实施例1中分离纯化产物Rd的含量分析谱图。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

本发明的第一方面是提供人参皂苷Rd分离纯化方法，采用反相高效色谱柱分离纯化人参皂苷提取物，洗脱溶剂组成为乙醇、水中的一种或两种混合，洗脱方式为等流速或变流速稳压洗脱。

其中，所述反相高效色谱柱为反相高效制备色谱柱，优选为反相ODS填料的高压动态轴向压缩色谱柱。

所述反相高效色谱柱为键合氨基的反相ODS填料高压动态轴向压缩色谱柱，所用填料粒径范围为10～100μm。

所述洗脱溶剂组成为乙醇与水混合，乙醇的体积与乙醇和水的体积之和的比为(5～90)：100，优选为(10～80):100。其中，乙醇和水的体积之和为乙醇的体积加上水的体积，不是混合液的体积，比如，乙醇的体积与乙醇和水的体积之和的比为70：100，即为乙醇与水的体积比为70:30。

其中，色谱柱对人参皂苷的总吸附量与人参皂苷的浓度以及洗脱流速之间关系如下式所示

式中，

Q为色谱柱对人参皂苷Rg1、Rb1和Rd的总吸附量，即色谱柱吸附的人参皂苷Rg1、Rb1和Rd的总质量/色谱柱填料的质量，单位为mg/g；

Q_a、Q_b、Q_c分别为色谱柱对人参皂苷Rg1、Rb1、Rd的单独吸附量，即色谱柱吸附的人参皂苷Rg1、Rb1、Rd的质量/色谱柱填料的质量，单位为mg/g；

C_a、C_b、C_c分别为人参皂苷Rg1、Rb1、Rd的洗脱前的在上样液中的初始浓度；

K_a、K_b、K_c分别为色谱柱对人参皂苷Rg1、Rb1、Rd的吸附解离常数；

F为洗脱溶剂的洗脱流速，单位为mL/min。

其中，

Q_a、Q_b、Q_c这三者是用相应的Rg1、Rb1、Rd的标准品在所用填料上的吸附测量出来的；

上述模型中各常数K_a、K_b、K_c不是固定不变的，当填料不同，柱尺寸不同时，洗脱溶剂体积比、洗脱流速不同时，各常数的数值也不同。

对于人参皂苷Rg1、Rb1、Rd的初始浓度C_a、C_b、C_c来说，每个批次的浓度都不尽相同，但差距不大。

人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，三萜皂苷，主要存在于人参属药材中。现有技术中，人参皂苷的柱色谱分离纯化用洗脱溶剂一般为乙腈/水，或者乙腈/乙醇/水或者乙腈/甲醇/水。

本发明中，可以完全不用乙腈，只采用环境友好型的溶剂乙醇做洗脱溶剂，安全环保。

乙腈和甲醇都是有毒性的。乙腈又名甲基氰，无色液体，极易挥发，有类似于醚的特殊气味，有一定毒性；甲醇(Methanol，CH₃OH)是无色有酒精气味易挥发的液体；人口服中毒最低剂量约为100mg/kg体重，经口摄入0.3～1g/kg可致死；乙腈和甲醇两者都不是安全环保的洗脱溶剂，而乙醇是安全的环境友好型的溶剂。

本发明中能够完全实现用乙醇代替乙腈或者乙腈与醇的混合物，是由本发明的分离纯化方法的特点带来的，是本发明人经过大量研究和探索获得的。

本发明人认为，这主要是因为本发明中采用键合氨基的反相ODS填料高压动态轴向压缩色谱柱，此种填料比表面积大，孔隙率大，对本发明中的人参皂苷Rg1，Rb1，Rd可以选择性吸附。可以选择性吸附的原因是此三种人参皂苷中含有的羟基和羧基的数量更多，可以很好地与本发明中所使用的填料产生较强的氢键作用力，从而可以提高人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的洗脱分离纯度。

本发明中，所用反相高效液相色谱柱为动态轴向压缩柱，内径为50～1200mm，理论塔板数大于10000。

动态轴向压缩柱能在各种规模的柱层析中保持良好分离效果的技术，也是当今制备色谱领域最佳的装柱技术。

本发明中，色谱柱对人参皂苷的总吸附量与人参皂苷的浓度以及洗脱流速之间关系式即吸附模型是本发明人建立的吸附动力学模型，本发明人根据单分子层吸附动力学和多分子层吸附动力学及竞争吸附动力学模型建立，本发明人采用经典的BET(Brunauer-Emmett-Teller)吸附模型和Langmuir吸附模型及E-L(Extended-Langmuir)吸附模型，以洗脱溶剂比例，洗脱流速和洗脱体积为考察参数；以洗脱液中人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的含量为考察目标。

单分子吸附指的是吸附质分子最多只能在吸附剂表面吸附一层分子的吸附，化学吸附都属于单分子吸附，Langmuir吸附等温式是最早的单分子吸附等温式。多分子层吸附是指被吸附了的分子发生再吸附的现象，BET(Brunauer-Emmett-Teller)吸附理论是多分子层吸附理论。

本发明人根据对人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的定量分析结果并结合吸附模型(吸附动力学模型)可以预测最佳的人参皂苷Rd反相高效液相柱色谱分离纯化的洗脱参数，从而可以动态地调整洗脱参数，从而提高分离纯度和分离效率。

本发明的第二方面是提供一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1：根据色谱柱洗脱能力和洗脱目标设定洗脱参数；

步骤2：用洗脱溶剂对色谱柱进行洗脱；

步骤3：检测洗脱液中各人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的含量，得到检测结果；

步骤5：洗脱完成。

其中，

步骤1中，

所述洗脱目标为洗脱液中人参皂苷Rg1的含量高于40％；或洗脱液中人参皂苷Rb1的含量高于40％；或洗脱液中人参皂苷Rd的含量高于80％。

所述洗脱目标为根据实际需要以及人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的含量而设定；

所述洗脱目标需要提前设定，主要是根据企业生产需求(企业生产需要的人参皂苷Rg1含量大于30％，Rb1含量大于40％，Rd含量大于80％)，即根据实际需要，在这个需求基础上，经验结合吸附模型，另外，原料的各组分含量也需要考虑，不同批次的原料，结果是有区别的，但差别不大。

所述吸附模型为下式所示：

其中，

C_a、C_b、C_c分别为人参皂苷Rg1、Rb1、Rd的洗脱前的上样液中的初始浓度；

F为洗脱溶剂的洗脱流速，单位为mL/min。

其中，

Q_a、Q_b、Q_c这三者是用相应的Rg1，Rb1，Rd的标准品在所用填料上的吸附测量出来的；

需要说明的是，该吸附模型的应用是有前提条件的，首先吸附模型并不能完全准确地调节，需要与实验相结合共同来调节洗脱参数。在使用吸附模型时，保持色谱柱、色谱柱填料以及洗脱的原料基本不变，即固定了Q值以及Q_a、Q_b、Q_c值，主要考察洗脱流速以及吸附解离常数。吸附模型应用于设定洗脱参数时，洗脱过程中不使用。吸附模型只是近似模型。

吸附模型的具体应用举例如下：

所用色谱柱为反相高效液相色谱柱为动态轴向压缩柱，内径为50mm，高600mm，所填填料为粒径为10微米的球形ODS填料，湿法装柱，实际分离塔板数为12000；

洗脱样品为80mL的上样液(含人参皂苷提取物80g，Rg1含量为10％，Rb1含量为9％，Rd含量为22％)；

首先，计算出Q值，具体如下：

(1)测出Q_a为35mg/g，Q_b为28mg/g，Q_c为43mg/g；

测出K_a，K_b，K_c分别为1.302，0.92，1.973；

(2)计算出C_a为100mg/mL，C_b为90mg/mL，C_c为220mg/mL，

(3)将得到合格产品时的洗脱流速作为F，然后计算出Q值。

比如，这个洗脱流速为120mL/min，把此洗脱流速作为吸附模型中的F，从而计算出Q值，Q值为0.3289。

需要注意的是：一定要预先得到洗脱合格产品的洗脱参数，从而计算出Q值，然后保持色谱柱、色谱柱填料以及洗脱原料不变，这样吸附模型对于参数调节更具指导价值。

即F为120mL/min时，Q为0.3289，此时产品合格。

然后，当遇到不合格产品需要调节洗脱参数时，则固定Q值和Q_a,Q_b,Q_c值。

当设定洗脱流速F为100mL/min，此时洗脱得到的产品不合格，则根据吸附模型调整的方法为：

方法一：固定Q为0.3289，改变F为120mL/min，使得方程平衡。这样，则相应调整洗脱流速为120mL/min。

方法二：固定Q为0.3289，假设Rg1，Rb1，Rd其中一个不合格，则改变K_a，K_b或K_c中的一个；

假设Rg1含量不合格，试着改变K_a为1.298时，则方程平衡；K_a值变小，说明固定相填料对Rg1的吸附量减小，那么在F值不变的情况下，则说明需要调节洗脱液比例，使得对Rg1的解吸能力增强，从而使得洗脱液中Rg1的含量增加；两个K_a值差距越大，洗脱液体积比提高越多，至于提高多少，需要实验验证，一般提高2％～5％为宜。

如果Rg1，Rb1，Rd三个都不合格，则K_a，K_b，K_c需要一个一个调节。

所述色谱柱为反相高效制备色谱柱，优选为反相ODS填料的高压动态轴向压缩色谱柱，进一步优选为键合氨基的反相ODS填料高压动态轴向压缩色谱柱，所用填料粒径范围为10～100μm。

步骤2中，所述洗脱溶剂为乙醇与水的混合物，所述洗脱为等流速或变流速稳压洗脱；

所述洗脱溶剂为乙醇与水的混合物，乙醇的体积与乙醇和水的体积之和的比为(5～90)：100，优选为(10～80):100。其中乙醇和水的体积之和为乙醇的体积加上水的体积，不是两者混合后的体积。

步骤3中，所述检测结果为HPLC外标定量检测的人参皂苷Rg1的含量，和/或人参皂苷Rb1的含量，和/或人参皂苷Rd的含量；

步骤4中，将检测结果与洗脱目标对比，达到洗脱目标，则收集洗脱液馏分；

当洗脱液中人参皂苷Rg1，或人参皂苷Rb1或人参皂苷Rd的含量合格时，则收集洗脱液馏分。

当检测结果未达到洗脱目标时，则保持色谱柱、色谱柱填料以及洗脱的原料不变，调节洗脱参数中的洗脱溶剂体积比或洗脱溶剂流速。

将检测的含量结果与吸附模型相结合进行分析，从而在下次洗脱时调整洗脱参数中的洗脱溶剂体积比或者洗脱流速(对于吸附模型的应用这里不再赘述)。尤其要注意的是，根据吸附模型调节洗脱参数是有误差的，需结合多次实验结果才能得出最佳条件。

步骤5中，洗脱完成的依据是人参皂苷Rd从色谱柱中完全洗脱，收集合格的洗脱液馏分，其他不合格的洗脱液馏分含大量其他皂苷，浓缩回收后，作其他皂苷的分离原料。

本发明所述洗脱的原料包括人参茎叶提取物和人参提取物，且提取物中人参皂苷Rg1、Rb1和Rd的含量之和高于40％。

上述一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法的实现是通过一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化系统进行的，如图1所示(图1中，1为控制计算机，2为洗脱液输送泵，3为反相高效色谱柱，4为检测器)，所述人参皂苷Rd自动控制分离纯化系统包括控制计算机1，与所述控制计算机1相连接的洗脱液输送泵2，与所述输送泵2相连接的反相高效色谱柱3，与所述反相高效色谱柱3和所述控制计算机1相连接的检测器4，所述色谱柱为反相高效制备色谱柱，优选为反相ODS填料的高压动态轴向压缩色谱柱，进一步优选为键合氨基的反相ODS填料高压动态轴向压缩色谱柱，所用填料粒径范围为10～100μm，且填柱后色谱柱的理论色谱塔板数不低于10000。

其中，

所述控制计算机1为工控机或服务器或可编程逻辑控制器；

所述控制计算机1与所述洗脱液输送泵2通过有线通信网络或无线通信网络连接；

所述洗脱液输送泵2能够接收控制计算机1信号，并能执行所述洗脱液比例参数调整，对反相高效制备色谱柱3进行等流速或变流速稳压洗脱；

所述检测器4包括传感器、近红外光谱检测器、紫外光谱检测器等；

所述检测器4与所述反相高效制备色谱柱3和所述控制计算机1通过有线通信网络或无线通信网络连接；

所述控制计算机1能够根据吸附模型所给参数由控制人员进行调节设定洗脱参数并有效发出信号命令给所述的洗脱液输送泵2和所述检测器4。

本发明提供的一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法的示意图如图2所示，图2更直观地呈现了本发明的分离纯化过程。具体过程描述如下，参照图1和图2所示：

控制计算机1根据反相高效色谱柱3洗脱能力和洗脱目标设定洗脱参数(包括洗脱溶剂种类，洗脱溶剂体积比，洗脱流速，洗脱溶剂用量等)，并将洗脱参数指令传送到洗脱液输送泵2；

所述洗脱液输送泵2执行所述洗脱参数，对反相高效色谱柱3进行等流速或变流速稳压洗脱；

检测器4检测洗脱液中人参皂苷Rg1，和/或人参皂苷Rb1，和/或人参皂苷Rd的含量，并将检测结果传输到所述控制计算机1中；所述控制计算机1根据上述检测结果以及洗脱目标，判断洗脱液中人参皂苷Rg1，或Rb1，或Rd含量是否合格，合格则收集洗脱液馏分，并传送到所述洗脱液输送泵2；然后执行洗脱及后续步骤，直至洗脱完成；

若根据上述检测结果以及洗脱目标，判断洗脱液中人参皂苷Rg1，或Rb1，或Rd含量是不合格的，所述控制计算机1根据上述检测结果并结合吸附模型制定新的洗脱参数。

本发明中所述人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的含量均为HPLC外标定量含量。

与现有技术相比，本发明提供的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法以及分离纯化自动控制系统，不仅可以对人参茎叶提取物和人参提取物中的人参皂苷Rd的洗脱过程进行自动监控，适应高纯度天然产物中间体规模化生产的需求，还可以在总皂苷原料的洗脱工艺过程中进行预测控制，实现人参皂苷Rd的定性分析，定量洗脱和高纯度产品收集的精准控制，大大提高了以不同人参皂苷提取物为原料制备人参皂苷Rd的产品纯化效果的一致性，有利于洗脱过程节能减耗，提高产品经济价值，有效提高工业纯化过程的自动化能力。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明。不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

洗脱工艺条件的探索实验

首先通过实验来建立反相高效液相色谱柱洗脱液中三种皂苷含量和洗脱参数工艺条件的关联关系，可以预测比较好的洗脱参数，共做了15组实验，如下表1和表2所示(表1为设计的洗脱参数表，表2为根据表1相应得到的三种皂苷的含量表格)。

表1设计的洗脱参数表

表2根据表1洗脱参数洗脱后得到的三种皂苷含量表

说明：建立的洗脱参数和三种皂苷含量的关联关系，对于调整洗脱参数时具有很好的参考和指导作用。

表1中共15组分离纯化实验，每一组实验所用的色谱柱和上样原料都是相同的。所用反相高效液相色谱柱均为动态轴向压缩柱，内径为50mm，高600mm，所填填料为粒径为10微米的球形ODS填料，湿法装柱，实际分离塔板数为12000。每一组实验所用上样原料均为80mL的上样液(含人参皂苷提取物25g)。

然后根据表1设计的不同洗脱参数进行洗脱纯化。同时对每一个实验的洗脱液馏分进行在线监测，当Rg1含量高于10％时，收集该洗脱液馏分，Rb1和Rd洗脱液馏分的收集标准和Rg1相同；并将最终收集的三种皂苷的洗脱液分别进行浓缩干燥，以及对三种皂苷成分的HPLC外标定量分析，从而得到表2。

反过来，可以根据表2的定量分析结果并结合吸附模型(吸附动力学模型)预测最佳的人参皂苷Rd反相高效液相柱色谱分离纯化洗脱参数，也就是说根据表2的结果可预测较合适的洗脱参数。

例如，各皂苷定量含量结果为实验编号2的结果：Rg1 45％，Rb1 37％，Rd10％，如果要提高Rd的含量，那么，要优化调节洗脱参数时，即可将洗脱参数调节为实验编号12的洗脱参数，即洗脱参数调整为(在三种皂苷含量合格的情况下，以洗脱溶剂量最小为目标)洗脱溶剂比例为乙醇/水为70:30，洗脱流速为150mL/min。

表2中，这15组实验洗脱过程中洗脱参数保持不变；Rg1含量高于10％时，收集该洗脱液馏分，Rb1和Rd洗脱液馏分的收集标准和Rg1相同；然后将收集的人参皂苷Rg1，Rb1，Rd洗脱液馏分浓缩干燥后，分别用HPLC外标定量，各含量分别标记为D1，D2，D3；将收集到的人参皂苷的洗脱液馏分进行分别浓缩干燥后，得到相应的人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的质量，分别标记为M1，M2，M3，相应计算三种皂苷总含量为(M1×D1+M2×D2+M3×D3)/(M1+M2+M3)，即得到表2中最后一列数据。

需要再次强调的是，表1和表2的数据只是起到参考和指导作用。

实施例1

采用反相高效色谱柱分离纯化人参皂苷提取物，80mL的上样液(含人参皂苷提取物80g，其中，Rg1含量为10％，Rb1含量为9％，Rd含量为22％，原料谱图如图3所示，其中，Rg1出峰时间为34.9min，Rb1出峰时间为44.5min，Rd出峰时间为53.1min)，洗脱溶剂为乙醇/水，乙醇与乙醇和水的体积之和的比为(10～60)：100(乙醇和水的体积比实时地在提高，梯度洗脱)，洗脱流速为120mL/min，所用色谱柱为反相高效液相色谱柱为动态轴向压缩柱，内径为50mm，高600mm，所填填料为粒径为10微米的球形ODS填料，湿法装柱，实际分离塔板数为12000；等流速洗脱。

共消耗洗脱溶剂体积为12000mL，收集合格洗脱液馏分为7300mL，其中收集合格的人参皂苷Rg1洗脱液馏分为1300mL，合格的人参皂苷Rb1洗脱液馏分为1300mL，合格的人参皂苷Rd洗脱液馏分为3700mL，分离纯化得到的人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的HPLC外标含量分别为45％,43％,83％，将三者洗脱液馏分别浓缩干燥后，分别得到人参皂苷Rg1的质量为9克，人参皂苷Rb1的质量为8克，人参皂苷Rd的质量为18克。

产物人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的HPLC谱图如图4(a)，图4(b)，图4(c)所示，

其中，

图4(a)为分离出来的Rg1的谱图，Rg1出峰时间为19.544min；

图4(b)为分离出来的Rb1的谱图，Rb1出峰时间为38.75min；

图4(c)为分离出来的Rd的谱图，Rd出峰时间为21.64min。

需要说明的是：原料、分离产物所用的HPLC的分析条件是不一样的。

实施例2

(1)根据所用色谱柱以及所要洗脱的人参皂苷中皂苷Rg1,Rb1,Rd的目标含量设定洗脱参数；

洗脱样品：80mL的上样液(含人参皂苷提取物80g，Rg1含量为10％，Rb1含量为9％，Rd含量为22％)，并将其上样入色谱柱；

洗脱目标为人参皂苷Rg1的含量高于40，或Rb1的含量高于40％，或人参皂苷Rd的含量高于80％；

设定洗脱参数为洗脱溶剂为乙醇与水的混合物，乙醇体积与乙醇和水的体积之和比为(15～60)：100，洗脱流速为120mL/min，洗脱体积为12000mL。

(2)对反相高效色谱柱按照洗脱参数设置的洗脱溶剂比例以及流速进行洗脱；

(3)将洗脱液进行在线监测，测得人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的含量，得到检测结果；

其中，HPLC在线监测合格人参皂苷Rg1出峰时间为39min，含量为40％；合格Rb1出峰时间为57min，含量为40％；合格Rd出峰时间为71min，含量为80％；

(4)达到洗脱目标，收集洗脱液馏分收集到Rg1，Rb1，Rd的合格产品；

(5)洗脱完成。

100min时完成对合格Rd馏分的洗脱和收集，115min时完成洗脱。

所用洗脱溶剂总体积为12000mL，其中收集合格馏分的洗脱液体积之和为7500mL；其中，合格Rg1洗脱液馏分为2100mL，合格Rb1的洗脱液馏分体积为2100mL，合格Rd洗脱液馏分体积为3300mL。

收集得到的三种皂苷洗脱液中三种皂苷的含量检测结果为：Rg1含量为44％，Rb1含量为42％，Rd含量为83％。

洗脱完成后，三种皂苷洗脱液分别浓缩干燥后，相应得到人参皂苷Rg1为9克；人参皂苷Rb1为9克；人参皂苷Rd为17克。

实施例3

(1)根据所用色谱柱以及所要洗脱的人参皂苷中各皂苷Rg1,Rb1,Rd的目标含量设定洗脱参数；

洗脱样品：80mL的上样液(含人参皂苷提取物80g，Rg1含量为11％，Rb1含量为8％，Rd含量为21％)，并将其上样入色谱柱；

洗脱目标为人参皂苷Rg1的含量高于40,或人参皂苷Rb1的含量高于40％，或人参皂苷Rd的含量高于80％。

设定洗脱参数为洗脱溶剂为乙醇与水的混合物，乙醇体积与乙醇和水的体积之和的比为(17～62)：100，洗脱流速为125mL/min，洗脱溶剂体积为11000mL。

其中，HPLC中合格人参皂苷Rg1出峰时间为30min，含量为40％；合格Rb1出峰时间为47min，含量为40％；合格Rd出峰时间为68min，含量为80％；

(4)达到洗脱目标，则收集洗脱液馏分；

(5)洗脱完成。

85min时完成洗脱。

所用洗脱溶剂总体积为11000mL，其中收集合格馏分的洗脱液体积之和为7800mL，其中，合格Rg1洗脱液馏分为1800mL，合格Rb1的洗脱液馏分体积为1800mL，合格Rd洗脱液馏分体积为3600mL。

收集得到的三种皂苷的含量检测结果为：Rg1含量为44.5％，Rb1含量为42％，Rd含量为82％。

洗脱完成后，三种皂苷洗脱液分别浓缩干燥后，得到人参皂苷Rg1质量为6克；人参皂苷Rb1质量为6克；人参皂苷Rd为13克。

实施例4

1、所用色谱柱、色谱柱填料以及洗脱原料与实施例2相同，洗脱参数中只有洗脱溶剂体积比与实施例2不同，乙醇体积与乙醇和水的体积之和的比为(18～65)：100，洗脱完成后，Rg1含量为35％，Rb1含量为40％，Rd含量为83％；

Rg1未达到洗脱目标，则将不合格的检测结果与吸附模型相结合分析，进而调整洗脱参数。

根据吸附模型的应用，Q_a为35mg/g，Q_b为28mg/g，Q_c为43mg/g；K_a，K_b，K_c分别为1.302，0.92，1.973；C_a为100mg/mL，C_b为90mg/mL，C_c为220mg/mL，F为120mL/min，计算出Q值为0.3289；

固定Q值为0.3289，根据方法二，洗脱流速保持不变仍为120mL/min，调节K_a值。

Rg1含量不合格，试着改变K_a为1.3005时，则方程平衡；K_a变小，说明固定相填料对Rg1的吸附量减小，那么在F值不变的情况下，则说明需要调节洗脱液比例，使得对Rg1的解吸能力增强，才能使得洗脱液中Rg1的含量增加。

因此，调整洗脱溶剂体积比，减小乙醇的体积比至15：100，然后再逐步增加至62：100，进行洗脱。

调节洗脱参数后，将洗脱的原料加入色谱柱，开始洗脱，此时，人参皂苷Rg1，Rb1，Rd都达到洗脱目标，洗脱完成。

所用洗脱溶剂总体积为12000mL，其中收集合格馏分的洗脱液体积之和为7200mL；其中，合格Rg1洗脱液馏分为2000mL，合格Rb1的洗脱液馏分体积为2000mL，合格Rd洗脱液馏分体积为3200mL。

收集得到的三种皂苷洗脱液中三种皂苷的含量检测结果分别为：Rg1含量为43％，Rb1含量为42％，Rd含量为83％。

洗脱完成后，三种皂苷洗脱液分别浓缩干燥后，相应得到人参皂苷Rg1为7克；人参皂苷Rb1为7克；人参皂苷Rd为16克；115min时完成洗脱。

对比例

对比例1

对比例1与实施例2步骤相同，所用洗脱原料相同，其区别在于所用洗脱溶剂不同，对比例1所用洗脱溶剂为乙腈/水。

对比例1与实施例2对比可知，本发明提供的人参皂苷自动控制分离纯化方法具有很大的优势，本发明实施例2所用洗脱溶剂乙醇/水相比于传统溶剂乙腈/水洗脱分离人参皂苷Rd时，分离效率高(本发明中实施例2大大节约了时间；而对比例1的分离纯化需要至少4小时)，并且大大节约溶剂。

对比例1的具体步骤如下：

洗脱样品：80mL的上样液(含人参皂苷提取物80g)，并将其上样入色谱柱；

洗脱目标为人参皂苷Rg1、或人参皂苷Rb1的含量高于40％，或人参皂苷Rd的含量高于80％。

设定洗脱参数为洗脱溶剂为乙腈与水的混合物，乙腈体积与乙腈和水的体积之和的比为(30～70):100，洗脱流速为200mL/min，洗脱体积为48000mL。

(3)将洗脱液进行在线监测，测得人参皂苷Rg1，Rb1，Rd的含量，得到检测结果；其中，HPLC中人参皂苷Rg1含量为40％；Rb1含量为40％；Rd含量为80％；

(4)达到洗脱目标，则收集洗脱液馏分；

(5)洗脱完成。

洗脱完成时共得到合格的洗脱液馏分体积为45000mL，其中，合格的Rg1和Rb1洗脱液馏分体积分别为12000mL，Rg1含量为44％，Rb1含量为43％，合格的Rd洗脱液馏分为21000mL，Rd含量为81％；分别浓缩后得到Rg1质量为8克，Rb1质量为7克，人参皂苷Rd为20克。洗脱溶剂乙腈/水用量为48000mL，总洗脱时间为240min。

以上实施例1～实施例4以及对比例1中，都是等流速梯度洗脱，洗脱溶剂乙醇和水的体积比是实时逐渐增加的。

由此说明，本发明人参皂苷Rd反相高效柱色谱自动控制分离纯化方法，通过构建反相高效柱色谱分离纯化洗脱液中皂苷浓度和洗脱参数工艺条件的关联模型，动态地调整反相高效柱色谱洗脱工艺条件，并以洗脱过程的溶剂消耗最小为过程优化目标，同时达到预期的洗脱要求。

本发明可提高人参皂苷单体的纯度及不同种类人参提取物制备人参皂苷Rd纯化效果的一致性，有利于洗脱过程节能减耗，提高产品经济价值，有效提高工业纯化过程的自动化能力。

本发明不仅可以对人参茎叶提取物和人参提取物中的人参皂苷Rd的洗脱过程进行自动监控，适应高纯度天然产物中间体规模化生产的需求，还可以在总皂苷原料的洗脱工艺过程中进行预测控制，实现人参皂苷Rd的定性分析，定量洗脱和高纯度产品收集的精准控制。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种人参皂苷Rd分离纯化方法，其特征在于，采用反相高效色谱柱分离纯化人参皂苷提取物，洗脱溶剂组成为乙醇、水的一种或两种混合，洗脱方式为等流速或变流速稳压洗脱。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述反相高效色谱柱为反相高效制备色谱柱，优选为反相ODS填料的高压动态轴向压缩色谱柱。

3.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于，所述反相高效色谱柱为键合氨基的反相ODS填料高压动态轴向压缩色谱柱，所用填料粒径范围为10～100μm。

4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱溶剂为乙醇与水的混合液，乙醇的体积与乙醇和水的体积之和的比为(5～90)：100，优选为(10～80):100。

5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，色谱柱对人参皂苷的总吸附量与人参皂苷的浓度以及洗脱流速之间关系如下式所示

其中，

F为洗脱溶剂的洗脱流速，单位为mL/min。

6.一种人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：根据色谱柱洗脱能力和洗脱目标设定洗脱参数；

步骤2：用洗脱溶剂对色谱柱进行洗脱；

步骤5：洗脱完成。

7.根据权利要求6所述的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，其特征在于，

步骤1中，所述洗脱目标为：洗脱液中人参皂苷Rg1的含量高于40％，或洗脱液中人参皂苷Rb1的含量高于40％，或洗脱液中人参皂苷Rd的含量高于80％；

步骤3中，所述检测结果为HPLC外标定量检测的人参皂苷Rg1的含量，和/或人参皂苷Rb1的含量，和/或人参皂苷Rd的含量。

8.根据权利要求6所述的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，其特征在于，

所述色谱柱为反相高效制备色谱柱，优选为反相ODS填料的高压动态轴向压缩色谱柱，进一步优选为键合氨基的反相ODS填料高压动态轴向压缩色谱柱，所用填料粒径范围为10～100μm；

所述洗脱溶剂为乙醇与水的混合物，乙醇的体积与乙醇和水体积之和的比例为(5～90)：100，优选为(10～80):100。

9.根据权利要求6所述的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，其特征在于，

10.根据权利要求6至9任一所述的人参皂苷Rd自动控制分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱的原料包括人参茎叶提取物和人参提取物，且提取物中人参皂苷Rg1、Rb1和Rd的含量之和高于40％。