CN110150326A - 一种源于无患子果实的除草活性成分及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种源于无患子果实的除草活性成分及其制备方法，属于植物源农药领域。本发明是从无患子果实中发现了一种具有显著除草活性的皂苷成分,该除草活性皂苷是从无患子果实中提取，经大孔树脂AB‑8和薄层色谱分离获得，在除草活性实验中，对供试植物的根长具有显著的抑制作用。与现有技术相比，本发明的除草皂苷成分来源于植物材料，具有良好的环境相容性，安全高效，除草效果好等特点，可直接用作植物源除草剂的有效成分，或作为先导化合物进行结构修饰用于新型除草剂开发，应用前景广阔。

Description

一种源于无患子果实的除草活性成分及其制备方法
技术领域
本发明属于植物源农药领域，具体是从无患子果实中鉴定出一种具有除草活性的皂苷成分及其制备方法。
背景技术
杂草是影响农业产值的重要因素之一。全球每年因杂草危害造成农业产值损失达13.2％，其中，我国每年因杂草造成的经济损失超过140亿美元。目前，对杂草的防治方法主要物理除草、化学除草和生物除草等方法，其中化学除草剂是最有效且使用量最多的方法，但化学除草剂的大量施用，造成环境水体污染和食品安全等问题日趋严重。植物源除草剂由于具有易生物降解、杀草谱广、靶标特异性高等优点，有望补充或部分替代化学合成除草剂的使用。因此，从天然植物中寻找新的除草活性成分并开发成植物源除草剂成为农业的发展趋势。
无患子(Sapindus mukurossi Gatren)是无患子科(Sapindaceae)无患子属(Sapindus)的一种落叶乔木，在我国资源丰富。无患子皂苷是无患子中重要的活性成分之一，主要存在于果实部位，是一种天然的非离子型表面活性剂，具有良好的起泡和去污性能，已被开发成洗发露、洗手液和洗洁剂等日化产品。在农药领域，无患子皂苷具有杀菌和杀虫活性，主要作为复配助剂、乳化剂和增效剂应用于杀菌剂和杀虫剂。据报道，无患子提取物对野燕麦和反枝苋的生长具有较强的抑制作用。无患子皂苷对杂草生长具有一定的抑制作用。本课题组前期也开展了无患子活性筛选和大田试验等方面的初步研究，上述研究验证了无患子皂苷具有除草活性作用，但无患子除草活性组分尚不明确，影响了无患子在除草剂领域的深加工利用，及其产品标准的研制。
经检索文献资料，关于无患子除草活性的中国专利有2项，包括申请人所在课题组获中国发明专利(ZL201210166838.9)和李文斌的(ZL201310555253.0)公开了无患子提取物制备除草剂粉剂的方法。在已公开的学术论文上，雒东的硕士论文报道了无患子提取物防除玉米田间杂草的研究。陶吴群的硕士论文报道了无患子外种皮95％乙醇提取物具有较好的除草活性。付磊磊的硕士论文报道了无患子乙醇提取物具有良好的除草活性，其中石油醚相的除草活性较好。
进一步检索表明，目前尚未明确无患子果实中具体的除草活性皂苷成分，造成产品质控无法量化检测等问题。本发明通过活性追踪的方法，经过系统研究，最终确定具有除草活性的皂苷成分，本发明的除草皂苷成分来源于植物材料，具有良好的环境相容性，安全高效等特点，可直接用于植物源除草剂的有效成分，或作为先导化合物进行结构修饰用于新型除草剂开发，应用前景广阔。
发明内容
本发明提供了一种源于无患子果实的除草活性成分及其制备方法。
本发明的一种源于无患子果实的除草活性成分，为三糖常春藤皂苷，即三糖常春藤皂苷作为除草活性成分的应用。
一种源于无患子果实的除草活性成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将无患子果实干燥后，除去果核并粉碎，在粉碎后的无患子粉末中加入提取剂，料液比即无患子粉末:提取溶剂的质量比为1:3～1:9，室温条件下浸提4-6h，重复3-4次，合并无患子提取液，然后在45℃条件下经旋转蒸发仪浓缩至膏状，冷冻干燥得到棕黄色固体，即无患子粗提取物；将冻干后的无患子粗提物按照1:1(g/mL)溶于蒸馏水中，上大孔树脂进行柱层析，采用乙醇:水的体积比范围是0:100～95:5的混合液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，将收集的各馏分分别浓缩、冷冻干燥，备用；
(2)对步骤(1)体积百分含量为70％乙醇洗脱馏分进一步开展薄层色谱分离；
取冻干后的70％乙醇馏分,按照20:1(g/L)比例溶于甲醇中，在薄层板上点样后，在玻璃缸中展开，展开溶剂为正丁醇:水:乙酸的体积比为84:14:7，展开后的薄层板在碘蒸气中显色，得到六道斑点，通过刮板的方式分别收集各显色的斑点，用甲醇超声洗脱，离心过滤，合并滤液浓缩，冷冻干燥，获得6个样品(自下向上依次分别命名为F1、F2、F3、F4、F5和F6)，以红三叶为靶标植物，采用24孔板滤纸法开展除草活性实验，其中样品F1对红三叶根长抑制作用最强，经薄层色谱化学显色结合高分辨质谱解析，初步鉴定出具有显著除草活性的成分为三糖常春藤皂苷。
本发明步骤(1)所述的提取剂为：甲醇、乙醇、丙酮和水等中的一种或多种混合物。优选乙醇或乙醇水溶液，优选体积百分含量为95％的乙醇。
上述步骤(2)在薄层板上点样时，每个点的点样量为2-6μL。
本发明涉及的一种具有除草活性的皂苷成分，其特征在于：该除草活性成分的骨架结构为常春藤皂苷，即所述的三糖常春藤皂苷为在常春藤皂苷骨架上含有三个单糖。
本发明所述的常春藤皂苷骨架上三个单糖的分子量选自：164和150；优选为2个150，一个164。
本发明有以下优点：该除草活性皂苷是从无患子果实中提取，经大孔树脂AB-8和薄层色谱分离获得，在除草活性实验中，对供试植物的根长具有显著的抑制作用；从无患子植物发现一种具有除草活性的皂苷成分，该成分来源于植物，对环境友好，无残留问题；本发明中除草活性成分的分离制备方法简单，对设备条件要求低。与现有技术相比，本发明的除草皂苷成分具有安全高效，除草效果好等特点，可直接用于植物源除草剂的有效成分，或作为先导化合物进行结构修饰用于新型除草剂开发，应用前景广阔。
附图说明
图1除草活性皂苷成分F1-F6的薄层色谱图；
图2除草活性皂苷成分三糖常春藤皂苷的二级质谱图。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1:无患子除草活性皂苷的制备
将无患子果实在25-40℃干燥后去除果核，粉碎样品，按料液比1∶5加入提取溶剂(具体提取溶剂为95％乙醇)，浸渍提取4h，重复3次，提取液经浓缩后，利用AB-8大孔树脂柱进一步分离，用乙醇水溶液(乙醇:水的体积比范围是1:100～100:5)(具体为依次用纯水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液)进行梯度淋洗，把70％乙醇水溶液所洗脱获得洗脱馏分浓缩、冷冻干燥，再按照20:1(g/L)比例溶于甲醇中，在薄层板上每个斑点的点样量为2μL，在玻璃缸中展开，展开溶剂为正丁醇:水:乙酸(84:14:7,v/v)，展开距离为7cm。碘蒸气显色，通过刮板的方式收集显色的斑点，用甲醇超声洗脱，离心，上清液过0.22μm滤膜，合并滤液浓缩，冷冻干燥，获得6个样品(F1、F2、F3、F4、F5和F6)见图1，其中F1为除草活性皂苷成分，经与常春藤皂苷元标准品进行比对，F1化合物为三糖常春藤皂苷，其二级质谱图，见图2。
实施例2:无患子皂苷的除草活性实验
以从薄层板上获得6个样品(F1、F2、F3、F4、F5和F6)为供试样品，以红三叶为靶标植物，以甲草胺为阳性对照，采用24孔板滤纸法开展除草活性实验，结果见表1。
表1薄层色谱分离皂苷组分的毒力测定
由表1可知，无患子皂苷F1对红三叶根长抑制作用最强，其半数有效浓度(EC50)值为0.017g/L，小于70％乙醇馏分样品的EC50值(0.031g/L)，说明70％乙醇馏分经薄层色谱分离纯化后，除草活性组分得到富集和浓缩。阳性对照甲草胺对红三叶根的EC50值为0.002g/L。综合分析可知，无患子除草活性组分不是单一化合物，是一系列皂苷类化合物，F1-F6共6种组分样品均表现出一定的植物毒性，其中F1毒性最高，且存在良好的剂量-效应关系。

Claims (7)

1.一种源于无患子果实的除草活性成分，为三糖常春藤皂苷，即三糖常春藤皂苷作为除草活性成分的应用。
2.按照权利要求1所述的一种源于无患子果实的除草活性成分，其特征在于，三糖常春藤皂苷为在常春藤皂苷骨架上含有三个单糖。
3.按照权利要求2所述的一种源于无患子果实的除草活性成分，其特征在于，常春藤皂苷骨架上三个单糖的分子量选自：164和150。
4.按照权利要求3所述的一种源于无患子果实的除草活性成分，其特征在于，三个单糖的分子量为2个为150，一个164。
5.权利要求1-4任一项所述的一种源于无患子果实的除草活性成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将无患子果实干燥后，除去果核并粉碎，在粉碎后的无患子粉末中加入提取剂，料液比即无患子粉末:提取溶剂的质量比为1:3～1:9，室温条件下浸提4-6h，重复3-4次，合并无患子提取液，然后在45℃条件下浓缩至膏状，冷冻干燥得到棕黄色固体，即无患子粗提取物；将冻干后的无患子粗提物按照1:1(g/mL)溶于蒸馏水中，上大孔树脂进行柱层析，采用乙醇:水的体积比范围是0:100～95:5的混合液进行乙醇浓度逐渐增加的梯度淋洗，将收集的各馏分分别浓缩、冷冻干燥，备用；
(2)对步骤(1)体积百分含量为70％乙醇洗脱馏分进一步开展薄层色谱分离；
取冻干后的70％乙醇馏分,按照20:1(g/L)比例溶于甲醇中，在薄层板上点样后，在玻璃缸中展开，展开溶剂为正丁醇:水:乙酸的体积比为84:14:7，展开后的薄层板在碘蒸气中显色，得到六道斑点，通过刮板的方式分别收集各显色的斑点，用甲醇超声洗脱，离心过滤，合并滤液浓缩，冷冻干燥，获得6个样品，自下向上依次分别命名为F1、F2、F3、F4、F5和F6，其中F1为三糖常春藤皂苷。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的提取剂为：甲醇、乙醇、丙酮和水等中的一种或多种混合物。优选乙醇或乙醇水溶液，优选体积百分含量为95％的乙醇。
7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)在薄层板上点样时，每个点的点样量为2-6μL。
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