CN110146570A - 酶电极及其制备方法、酶传感器、监测装置和治疗设备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有较高灵敏度的酶电极及其制备方法、酶传感器、监测装置和治疗设备。该酶电极包括依次设置的基底电极和碳负载阵列，基底电极和碳负载阵列通过导电胶固定，碳负载阵列上通过交联剂固定有酶。本发明通过导电胶将碳负载阵列连接到基底电极上作为酶的固定载体，立体三维的碳负载阵列具有极高的比表面积，能够为生物酶提供更多的吸附点，提高了酶的固定密度；同时，碳负载阵列可以大大提高检测液和酶电极的接触面积，有效提高电化学反应的电子传导速率；从而能够实现更高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种酶电极及其制备方法、酶传感器、监测装置和治疗设备。
背景技术
人体内无时不刻都在进行着各种代谢活动，例如糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢等，各类代谢的正常进行是人体健康的必要保证，代谢异常则会引起人体各类疾病，例如糖尿病、痛风、心脑血管病、脂肪肝、苯丙酮尿症等等。临床上，常常需要抽血检测人体的各类代谢物的指标，从而进行各类疾病的诊断以及后续的治疗。
目前，针对人体代谢物的检测手段主要是体外诊断，例如生化诊断、免疫诊断和分子诊断。体外诊断技术的优势在于能快速检测，成本较低。然而，体外诊断往往是在人体提取完检测液后才能进行一次检测，也就是说，只能得到该次检测液的一个测试值。但是，患者往往是在发现自已的病情症状后才会到医院进行此类诊断，此时疾病大多数已经形成，很可能已经错过了最佳的治疗时期。这种情况尤其体现在一些慢性疾病中，例如糖尿病、高脂血症、脑卒中、冠心病等等。这些慢性非传染性疾病病程长、起病隐匿，造成人体脑、心、肾等重要器官的损坏，影响人体身体健康和生活质量，而且该类疾病的医疗费用往往相当昂贵，极大增加了家庭负担。
与此相反，针对人体的在体连续性监测技术可以长期监测相应指标的变化，能够起到预防疾病、进行早期治疗和术后监控复发的功能，弥补了体外诊断的短板，也是未来人体代谢物检测的主要发展方向。人体代谢物在体连续性监测的核心在于需要能特异地、稳定地且连续地进行工作的代谢物传感器，而生物酶催化就恰好符合这些特点。生物酶催化反应是指由酶作为催化剂进行催化的生物化学反应，它能特异性加快化学反应的速率而不改变反应的平衡点，在反应前后酶的质和量没有改变，酶催化的特点是微量高效、高度特异性、酶活可调。以生物酶进行人体代谢物的检测特异性好、简便、快速、成本低廉。但在实际的在体监测酶传感器的设计和实验中研究人员发现，酶电极在工作过程中的电子传导效率较低、酶催化反应效率较低，难以达到预期的灵敏度要求。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于如何提供一种具有较高灵敏度的酶电极及其制备方法、酶传感器、监测装置和治疗设备。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种酶电极，根据本发明的实施例，该酶电极包括依次设置的基底电极和碳负载阵列，基底电极和碳负载阵列通过导电胶固定，碳负载阵列上通过交联剂固定有酶。
其中，酶的非限制性实例可以是氧化还原酶、水解酶、转移酶、异性化酶等。氧化还原酶至少可以是葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、乳酸氧化酶等。交联在碳负载阵列上的酶可以是一种或几种，同时，可以是作用于相同的标的物或不同的标的物。碳负载阵列是指由包括石墨烯、碳纳米管或其它本领域所熟知的一些具有类似电学性能、比表面积和吸附性能的碳材料形成的阵列，具体可以是多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、石墨烯片等。
根据本发明的实施例，该酶电极至少具有以下有益效果：
本发明通过导电胶将碳负载阵列连接到基底电极上作为酶的固定载体，立体三维的碳负载阵列具有极高的比表面积，能够为生物酶提供更多的吸附点，提高了酶的固定密度；同时，碳负载阵列可以大大提高检测液和酶电极的接触面积，有效提高电化学反应的电子传导速率，提高酶催化效率；通过交联剂固定到碳负载阵列上的酶也能够保证其具有比较完整的活性；从而使酶电极能够实现更高的检测灵敏度。
本发明通过导电胶固定碳负载阵列和基底电极，碳负载阵列可以由外部根据实际需要选择添加，避免了采用原位生长方式时存在的大规模生产较为困难的问题，使得制备过程更加简便。
另外，根据本发明的实施例，该酶电极的制备方法还可以具有如下的附加技术特征：
在本发明的一些实施例中，碳负载阵列由直立碳纳米管、直立石墨烯中的至少一种形成阵列。
在本发明的一些实施例中，直立碳纳米管为直立多壁碳纳米管。
在本发明的一些实施例中，碳负载阵列的所述直立碳纳米管的直径为50-200nm，间距为100-200nm。
在本发明的一些实施例中，交联剂选自戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、聚乙二醇、柠檬酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸、壳聚糖、全氟磺酸中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，导电胶选自导电银胶、导电金胶中的至少一种。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种酶电极的制备方法，根据本发明的实施例，酶电极的制备方法包括以下步骤：
将碳负载阵列固定到基底电极上；
将酶溶液滴加到碳负载阵列中，使酶溶液覆盖碳负载阵列，干燥后将交联剂滴加到碳负载阵列中。
现有技术中通过强硝酸氧化处理打开碳链，使其羧基化后与酶键合的固定方式会使碳负载阵列的比表面积有所降低，缺陷增加，从而导致其导电性大大降低，影响了酶电极的灵敏度。而本方案利用交联剂使酶通过物理沉积并交联的方式固定到碳负载阵列上，保证了碳负载阵列的完整性，避免了导电性的下降，从而使酶电极的灵敏度得到了有效提升。
在本发明的一些实施例中，酶电极的制备方法包括以下步骤：
通过导电胶将碳负载阵列固定到基底电极上；
将酶溶液滴加到碳负载阵列中，使酶溶液覆盖碳负载阵列，干燥，将交联剂滴加到碳负载阵列中，反应后清洗。
在本发明的一些实施例中，酶电极的制备方法包括以下步骤：
通过导电银胶将碳负载阵列固定到基底电极上；
将酶溶液滴加到碳负载阵列中，摇床低速混匀，使酶溶液覆盖碳负载阵列，将交联剂滴加到碳负载阵列中，反应后清洗。
在本发明的一些实施例中，酶电极的制备方法包括以下步骤：
将壳聚糖和碳负载阵列混匀固定到基底电极上；
将酶溶液滴加到碳负载阵列中，摇床低速混匀，使酶溶液覆盖所述碳负载阵列，将交联剂滴加到碳负载阵列中，反应后清洗。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种酶传感器，根据本发明的实施例，该酶传感器包括上述的酶电极。
在本发明的一些实施例中，酶传感器包括作为工作电极的酶电极、参比电极、辅助电极以及固定于上述三电极下方的酶传感器基底。其中，参比电极是指一个已知电势的接近于理想的不极化的电极，其可逆性好、交换电流密度高、具有良好的电势稳定性和重现性。辅助电极又称为对电极，对电机与工作电极组成回路，使工作电极上的电流畅通，以保证所研究的反应在工作电极上发生，在三电极体系工作的时候参比电极基本上没有电流通过。
该酶传感器能特异、稳定、连续地检测人体相应的代谢物浓度水平。本发明所提供的酶传感器能为人体提供早期监测预防、早期疾病治疗和术后复发监控提供相应的技术支持，解决了当前体外诊断技术的痛点。
在本发明的一些实施例中，基底电极、参比电极、辅助电极可以使用铂、金、碳基电极等材料，传感器基底可以使用硅片、硅胶、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等材料。
根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种监测装置，根据本发明的实施例，该监测装置包括上述的酶电极或酶传感器中的任一种。通过设有一种或多种能够监测若干代谢物指标的多通道酶传感器，实现对使用对象的一项或多项健康指标实现实时监控。
本发明所提供的监测装置可以广泛地应用于人体代谢物的检测，针对不同的使用对象的群体，设置不同的酶传感器，可以实现糖尿病患者的血糖动态监测与管理、痛风患者的尿酸监测、基于乳酸的运动体能检测以及其它一些基于体液的代谢物的分析、监测和管理，通过该监测装置可以实现使用对象的连续性监测，从而能够更精准地管理分析病情，及时调整对象的健康管理策略。
根据本发明的第五个方面，本发明提供了一种治疗设备，根据本发明的实施例，该治疗设备包括上述的酶电极或酶传感器中的任一种。通过设有一种或多种能够检测若干代谢物指标的多通道酶传感器，实现针对使用对象的生理指标的实时监控，调节药物递送的时间和使用量，从而更精准地实现治疗目的。例如，可以将酶传感器与胰岛素泵结合，调节患者的胰岛素注射剂量。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的酶传感器的结构示意图。
图2是本发明的图1所示实施例的酶传感器的酶电极的截面局部示意图。
图3是本发明的图1所示实施例的酶传感器的酶修饰效果的共聚焦图。
图4a是本发明的图1所示实施例的酶传感器的直立多壁碳纳米管的电子显微镜扫描图。
图4b是本发明的图1所示实施例的酶传感器的直立多壁碳纳米管经葡萄糖氧化酶修饰后的电子显微镜扫描图。
图5是本发明的又一个实施例的酶传感器的结构示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。
实施例1：
图1是本发明的一个实施例的酶传感器的结构示意图。如图1所示，该酶传感器为矩形结构的酶传感器，包括传感器基底4、辅助电极1、参比电极2、酶电极3，酶电极3为矩形形状。酶电极3上固定有直立多壁碳纳米管形成的直立多壁碳纳米管阵列33。以硅片作为传感器基底4、辅助电极1、参比电极2、酶电极3的基底电极均为铂材料。该酶电极的具体结构见图2。图2是本发明的图1所示实施例的酶电极的截面局部示意图。如图2所示，该酶电极以铂作为基底电极31、基底电极31上设有导电银胶层32、导电银胶层32上设有直立多壁碳纳米管经阵列而成的直立多壁碳纳米管阵列33，在直立多壁碳纳米管上交联有葡萄糖氧化酶34。
该酶传感器的制备方法具体如下：
(1)根据传感器结构制作相应的掩膜板；
(2)在超净间中清洗硅片，待干燥后用正性光刻胶进行甩胶处理以获得光刻胶基体，并进行前烘处理；
(3)在光刻机中对光刻胶基体进行曝光处理；
(4)曝光后在相应光刻胶的显影液中进行显影；
(5)移至蒸镀设备，在硅片上先蒸镀Cr，再蒸镀Pt，形成基底电极和其它两种电极；
(6)在湿式蚀刻清洗台对硅片进行去胶处理，获得预设的传感器结构；
(7)选择直径大小50-200nm、间距100-200nm、高度50-150μm的多壁碳纳米管阵列切割出10mm2左右的方形大小；
(8)采用导电银胶将切割后的多壁碳纳米管阵列固定到传感器的基底电极上，形成直立多壁碳纳米管阵列，测量工作电极的电阻为2-20Ω，密封保存。
(9)称取适量的葡萄糖氧化酶溶于去离子水中，形成葡萄糖氧化酶溶液；
(10)取制得的葡萄糖氧化酶溶液，将其缓慢滴到传感器的直立多壁碳纳米管阵列中，使其刚好覆盖，常温干燥后继续滴定，重复多次；
(11)将戊二醛溶液缓慢滴到直立多壁碳纳米管阵列中，并置于摇床中处理，随后于4℃冰箱中过夜处理；
(12)取氨丁三醇缓冲液清洗直立多壁碳纳米管阵列；
(13)清洗完毕后采用磷酸缓冲液(pH＝7.0)覆盖直立多壁碳纳米管阵列，并存密封放在保存于4℃冰箱中，等待取用。
本实施例提供的固定有葡萄糖氧化酶的酶传感器植入人体后，含有葡萄糖的血液(或其它类别的体液如唾液、组织液等)流经酶传感器的直立多壁碳纳米管阵列，葡萄糖会充分与碳纳米管上的葡萄糖氧化酶接触，在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖被氧化，酶传感器的三电极体系可以检测到电化学反应中的电子转移，其电子转移的数目大小与反应物葡萄糖的浓度相关，因而可以根据检测到的电流大小获取相应的葡萄糖的浓度值(例如，可以得到人体的血糖浓度)。
本实施例还提供一种监测装置或系统，可以监测使用对象的健康状况。通过上述的酶传感器进行人体代谢物在体连续监测技术，结合特定的数据传输和显示模块可实时显示被检测代谢物的浓度。在葡萄糖的检测中，血液流经酶传感器，并在传感器上生物酶的催化下发生电化学反应；反应产生的电流信号经转化得到相应代谢物的浓度值；该浓度值通过处理，上传至显示模块，通过连续的检测得到多组数据，形成血糖浓度随时间变化的曲线，从而更好地实时监测使用者的血糖水平，是广大糖尿病患者的福音。
实施例2：
酶电极制备结果验证
1.免疫荧光结果
为评估葡萄糖氧化酶是否固定在直立多壁碳纳米管阵列中，采用酶联免疫吸附测定方法对葡萄糖氧化酶进行标记，然后在共聚焦显微镜下进行成像。图3是本发明的图1所示实施例的酶传感器的共聚焦图。如图3所示，荧光部分代表的是吸附在直立多壁碳纳米管上的葡萄糖氧化酶，可见在碳纳米管上有荧光，而传感器其他位置没有明显的荧光，说明葡萄糖氧化酶成功固定在碳纳米管阵列上。
2.电子扫描显微镜结果
图4a是本发明的图1所示实施例的酶传感器的直立多壁碳纳米管的电子显微镜扫描图。图4b是本发明的图1所示实施例的酶传感器的直立多壁碳纳米管经葡萄糖氧化酶修饰后的电子显微镜扫描图。如图4a和图4b所示，采用ZEISS电子扫描显微镜(放大倍数1200倍)观测直立多壁碳纳米管阵列区域，图4a中没有修饰葡萄糖氧化酶的表面可以看到细丝管状的碳纳米管阵列，而修饰完葡萄糖氧化酶后的碳纳米管阵列表面覆盖有葡萄糖氧化酶的团簇。该结果表明葡萄糖氧化酶成功固定到直立多壁碳纳米管阵列上。
实施例3：
一种酶电极，该酶电极以金作为基底电极、基底电极上设有导电银胶层、导电银胶层上设有直立石墨烯阵列，在直立石墨烯上交联有尿酸氧化酶。
实施例4：
一种监测装置，包括酶传感器，该酶传感器具有一酶电极，该酶电极以金作为基底电极、基底电极上设有导电银胶层、导电银胶层上设有直立石墨烯阵列，在直立石墨烯上交联有乳酸氧化酶。
实施例5：
一种酶电极，该酶电极以金作为基底电极、基底电极上设有导电银胶层、导电银胶层上设有直立石墨烯阵列，在直立石墨烯上交联有核酸酶组。
实施例6：
图5是本发明的又一个实施例的酶传感器的结构示意图。如图5所示，该酶传感器的传感器基底4上的辅助电极1和参比电极2均为扇形，酶电极3的主体为扇形和圆形的结合，其圆形部分固定有同样呈圆形的直立多壁碳纳米管阵列33。
实施例7：
一种酶传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)取柔性PET基底切割成特定的大小和形状，清洗干燥；
(2)将电极材料银粉、银粉/氯化银粉分别与粘结剂混合，均匀涂抹于柔性PET基底上形成三电极形状，烘箱干燥，得到预设的传感器结构；
(3)选择特定直径、间距和高度的多壁碳纳米管阵列切割出r＝1mm的圆形大小；
(4)将切割后的多壁碳纳米管阵列分散到胶粘剂溶液中，滴加到传感器的基底电极上以固定形成直立多壁碳纳米管阵列，密封保存；
(5)称取适量的乳酸氧化酶溶于去离子水中，形成乳酸氧化酶溶液；
(6)取制得的乳酸氧化酶溶液，将其缓慢滴到传感器的直立多壁碳纳米管阵列中，使其刚好覆盖，常温干燥后继续滴定，重复多次；
(7)将聚乙二醇溶液缓慢滴到直立多壁碳纳米管阵列中，并置于摇床中处理，随后于4℃冰箱中过夜处理；
(8)取氨丁三醇缓冲液清洗直立多壁碳纳米管阵列；
(9)清洗完毕后采用磷酸缓冲液覆盖直立多壁碳纳米管阵列，并存密封放在保存于4℃冰箱中，等待取用。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种酶电极，其特征在于，包括依次设置的基底电极和碳负载阵列，所述基底电极和所述碳负载阵列通过导电胶固定，所述碳负载阵列上通过交联剂固定有酶。
2.根据权利要求1所述的酶电极，其特征在于，所述碳负载阵列由直立碳纳米管、直立石墨烯中的至少一种形成阵列。
3.根据权利要求2所述的酶电极，其特征在于，所述直立碳纳米管为直立多壁碳纳米管。
4.根据权利要求2所述的酶电极，其特征在于，所述碳负载阵列的所述直立碳纳米管的直径为50-200nm，间距为100-200nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的酶电极，其特征在于，所述交联剂选自戊二醛、顺丁烯二酸酐、聚乙二醇、柠檬酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸、壳聚糖、全氟磺酸中的至少一种。
6.根据权利要求1-4任一项所述的酶电极，其特征在于，所述导电胶选自导电银胶、导电金胶中的至少一种。
7.权利要求1-6任一项所述的酶电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将碳负载阵列固定到基底电极上；
将酶溶液滴加到所述碳负载阵列中，使所述酶溶液覆盖所述碳负载阵列，干燥后将交联剂滴加到所述碳负载阵列中。
8.一种酶传感器，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的酶电极。
9.一种监测装置，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的酶电极、权利要求8所述的酶传感器中的任一种。
10.一种治疗设备，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的酶电极、权利要求8所述的酶传感器中的任一种。
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