CN110144419B - 一种柑橘遗传背景鉴定用pcr引物、试剂盒及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物，引物的核酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，另外本发明还提供了一种包含上述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物的试剂盒及柑橘遗传背景的鉴定方法。本发明提供的柑橘遗传背景鉴定用PCR引物特异性高，扩增效率好，仅需一对引物即可快速鉴定柑橘的遗传背景，成本低，省时省力。

Description

一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法。

背景技术

柑橘类水果是世界上产量最大的水果。柑橘可跨种属杂交，种属间杂种多，遗传背景复杂，目前还有很多未知的柑橘变种亟待鉴定。采用简便的技术方法弄清柑橘的遗传背景，可以为砧木资源的挖掘提供思路，加快人工杂交品种的选育进程。尽管柑橘可根据枝叶形态等鉴别其属种，但是柑橘的形态学标记较少，种间差异不明显。随着分子生物学的发展，DNA分子标记鉴定因快速准确、不受环境影响等优点逐渐发挥重要作用。在柑橘的研究中，越来越多的分子标记被开发，但是多数鉴定需要几对甚至十几对引物才能确定，而利用一对引物鉴别柑橘遗传背景的方法鲜有报道。

发明内容

本发明为解决上述问题提供一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物，包括上游引物Citrus-F和下游引物Citrus-R，其序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

其中SEQ ID NO:1的序列为TGCTCTAGTATGCCAATCTGTGTCA。

SEQ ID NO:2的序列为TGATCACTGAGCAGTTTATGGGG。

本发明还提供了一种柑橘遗传背景鉴定用试剂盒，包括上述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物。

进一步，所述试剂盒还包括TaqDNA聚合酶、buffer缓冲液和dNTP。

本发明还提供了一种柑橘遗传背景鉴定方法，使用上述试剂盒，方法为，提取柑橘待测样品的DNA，用所述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。当扩增产物中出现一条扩增条带时，若条带大小为1.8K判定为具有柚的遗传背景；若条带大小为1.4K判定为具有橘的遗传背景；若条带大小为1K判定为具有原始柑橘的遗传类型；当扩增产物中出现两条扩增条带时，根据孟德尔遗传规律进行判定。

进一步，所述原始柑橘包括枳、莽山野柑、枸橼、宜昌橙。

进一步，所述待测样品为待测柑橘的叶片。

进一步，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，56℃复性15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。

本发明的有益效果是：本发明提供的柑橘遗传背景鉴定用PCR引物特异性高，扩增效率好，仅需一对引物即可快速鉴定柑橘的遗传背景，成本低，省时省力。本发明能对未知柑橘和已知柑橘品种进行鉴定，对柑橘资源的挖掘和保护有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1不同柑橘种PCR扩增凝胶电泳结果图；

图2为本发明实施例2中A、B、C、D的PCR扩增凝胶电泳结果图；

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明的供试材料采自华中农业大学脱毒楼、丹江口砧木繁育基地和陕西城固县斗山柑橘专业合作社。

实施例1

选取不同的柑橘种，香橙、枳、陕西红桔、摩洛哥酸橙、泸酸橙、枸橼、桠柑、莽山野柑、山金柑、红心柚、沙田柚、高班柚、枳雀、老酸橙、温州蜜柑、宜昌橙、纽荷尔脐橙、暗柳橙、伏令夏橙、城固酸橙、城固冰糖橙、南丰蜜桔、克里曼丁和本地早，取不同柑橘种的叶片，采用CTAB法提取DNA组，用上游引物Citrus-F(SEQ ID NO:1TGCTCTAGTATGCCAATCTGTGTCA)和下游引物Citrus-R(SEQ ID NO:2TGATCACTGAGCAGTTTATGGGG)分别对提取的不同柑橘种的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为：ddH₂O18ul，2×Phanta Max Buffer 25ul，Citrus-F2ul，Citrus-R 2ul，dNTP Mix(10mM each)1ul，待检测DNA 1ul，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1ul。PCR反应程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，56℃复性15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图1所示，不同泳道的条带具有多态性，根据条带大小可分为1.8K，1.4K，1K三种类型。根据报道，现代栽培柑橘的三个祖先分别是橘、柚和香橼，对应的条带大小分别为1.4K，1.8K，1K。橘和柚杂交形成酸橙或其他杂柑，城固酸橙、老酸橙、泸酸橙、摩洛哥酸橙的条带为1.8K和1.4K，本地早、克里曼丁橘、椪柑等也是1.8K和1.4K的类型；南丰蜜桔、温州蜜柑、陕西红桔为1.4K的橘类型，已知南丰蜜桔为我国特有的纯种宽皮橘；高班柚、沙田柚、红心柚为1.8K的柚类型；值得说明的是甜橙类，甜橙是酸橙在进化的过程中受到柚基因组的渗入而产生的，因此伏令夏橙、暗柳橙和纽荷尔脐橙等甜橙类为1.8K的纯合类型。在橘、柚和香橼之前的柑橘类型，划入原始类型，目前报道的宜昌橙和莽山野柑，这些原始类型的柑橘，条带均为纯合的1K，因此认为含有1k的序列具有原始柑橘的遗传背景。柑橘复杂的遗传背景不限于此，枳属的枳为柑橘生产上最常用的砧木，同样为1K类型。枳的叶片为三出复叶，据此特征可判断柑橘是否有枳的背景。根据电泳结果，再结合生产实际，使用我们的引物鉴定的柑橘遗传背景与文献报道的结论一致。。

实施例2

分别取A、B、C、D四种柑橘，A和B是陕西城固保存的枳资源，C为资阳香橙、D为衢州香橙，取叶片，采用CTAB法提取DNA组，并用上游引物Citrus-F和下游引物Citrus-R进行PCR扩增，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图2所示，A、C、D泳道均为两条带(1.4K,1K)，已知香橙是橘(1.4K)和宜昌橙(1K)的杂交种，说明A可能具有橘的遗传背景，为枳和橘的杂交种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种柑橘遗传背景鉴定用PCR引物、试剂盒及鉴定方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctctagta tgccaatctg tgtca 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgatcactga gcagtttatg ggg 23

Claims (3)

1.一种柑橘遗传背景鉴定方法，其特征在于，使用包含柑橘遗传背景鉴定用PCR引物的试剂盒 ，该方法为：提取柑橘待测样品的DNA，用所述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物中出现一条扩增条带时，若条带大小为1.8K判定为具有柚的遗传背景，若条带大小为1.4K判定为具有橘的遗传背景，若条带大小为1K判定为具有原始柑橘的遗传类型，当扩增产物中出现两条扩增条带时，根据孟德尔遗传规律进行判定，所述柑橘遗传背景鉴定用PCR引物包括上游引物Citrus-F和下游引物Citrus-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述原始柑橘包括枳、莽山野柑、枸橼、宜昌橙。

2.根据权利要求1所述的一种柑橘遗传背景鉴定方法，其特征在于，所述待测样品为待测柑橘的叶片。

3.根据权利要求2所述的一种柑橘遗传背景鉴定方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，56℃复性15秒，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。

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