CN110140043A - 电化学传感器及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供一种传感器，包括：a.支撑基底；b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂也适于接触包含所述目标分析物的所述样本。本发明还涉及此类传感器的生产和使用方法。

Description

电化学传感器及其使用方法
技术领域
本发明涉及用于检测溶液中目标分析物的传感器。更具体地，本发明涉及电化学传感器，其检测目标分析物与阵列上捕获剂的结合。
背景技术
对生物或生化过程进行更精确和可再现的测量将使许多医疗、生物和生物技术应用受益。然而，由于将电子设备直接连接到生物化学环境的复杂性，很难将关于生物事件的信息转换成可检测的电子信号。由于能够将生物化学事件直接转换为电信号，电化学传感器为实现样本含量的定量分析提供了一种有吸引力的手段。
电化学传感器被设计成具有高度靶向性，以检测样本中目标分析物(TA)的存在(优选浓度)。电化学传感器通常涉及使用固定在传感器基底上的靶向性结合剂。结合剂可以包括酶、核酸、抗体、全细胞或受体。
虽然有许多诊断传感器可供使用，但通常局限于实验室环境中由熟练操作人员操作的高成本设备。在许多情况下，实现即时检测/传感设备的主要限制是使转换原理小型化的能力，以及缺乏成本效益高的生产方法(Grieshaber等人，2008年)。患者或医疗专业人员在该领域使用的廉价手持设备的使用是有限的。
电化学传感依赖于目标分析物与传感器表面相互作用并影响/破坏电子路径的可测量特性。图1描述了一种常见的方法，其中金电极被混合自组装单层膜覆盖。结合剂(X)通过自组装单层膜附着到电极表面(图1A和1B)。TA/TA-辣根过氧化物酶(HRP)混合物暴露于所述结合剂，并以取决于每种组分浓度的比例与所述结合剂竞争性结合(图1C)。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(图1D)并用辣根过氧化物酶氧化,从而使得金电极上的3,3',5,5'-四甲基联苯胺减少。由于3,3',5,5'-四甲基联苯胺的减少可以恒电流测量(即通过电极上的电流)，可以测量样本中目标分析物的浓度。辣根过氧化物酶和3,3',5,5'-四甲基联苯胺通常用于Elisa检测，其中显色3,3',5,5'-四甲基联苯胺是光学测量的，而不是恒电流测量的。
由于样本处理、稀释误差和/或样本基质(如牛奶、血液或海水)的干扰等多种因素，用于检测样本中目标分析物的试验的校准可能很复杂，并且容易出现误差。在目前的试验中，熟练的技术人员尽量将这些因素的影响降至最低，以确保观察到的响应是准确的，并且与标准的比较是浓度的真实反映。
本发明的目的是提供一种电化学传感器和检测目标分析物的方法，其克服或改善了现有技术的至少一个缺点。或者，本发明的目的是向公众提供一个有用的选择。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂也适于接触包含所述目标分析物的所述样本。
在一个实施例中，所述结合区域处的所述结合层是附着到所述支撑基底的平面层。
优选地，所述传感器适于在所述目标分析物与附着于所述结合层的结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
在另一方面，本发明提供了一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂也适于接触包含所述目标分析物的所述样本；并且其中所述传感器适于在所述目标分析物与附着于所述结合层的结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
在另一实施例中，所述结合剂以静电的、共价的方式或通过所述结合剂已经附着于其上的磁珠附着到所述结合区域。
在另一实施例中，所述结合区域处的所述结合层是磁性粒子上的功能表面，其中所述磁性粒子通过磁场附着到所述支撑基底。
优选地，所述传感器包括磁性元件，所述结合区域处的所述结合层是磁性粒子上的功能表面，其中所述磁性粒子通过由所述磁性元件产生的磁场附着到所述支撑基底。
在另一实施例中，本发明提供一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于静电、共价或磁性地附着至少一种结合剂；
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
优选地，可检测响应包括电化学可检测响应，其包括电流、电压、电容、电阻、电导、阻抗、磁通量或电场的变化。优选地，目标分析物与结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导所述可检测响应。优选地，标记的目标分析物与结合剂的结合与未标记的目标分析物的结合竞争、取代未标记的目标分析物的结合或者被未标记的目标分析物的结合取代，从而产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导所述可检测响应。
优选地，所述支撑基底包括聚合物、硅或玻璃。优选地，所述支撑基底包括单层或多层。
优选地，所述至少一个表面结构与所述支撑基底成一体。
优选地，所述电极层沉积在所述表面结构的上表面上。
优选地，所述电极层包括厚度基本恒定的层。优选地，所述电极层覆盖所述表面结构，以及可选的，所述支撑基底。
优选地，所述电极层的厚度在大约1nm和500nm之间，更优选地在大约40和500nm之间或者在大约50和100nm之间。更优选地，约5nm至30nm、50nm至100nm厚、70nm至400nm厚、900nm至300nm厚。
优选地，两个或多个表面结构的所述上表面上的所述电极层在所述传感器内电连接。可以在所述结合层或惰性层下电连接。
优选地，所述传感表面在所述电极层的上表面上。
优选地，所述传感表面在从所述支撑基底突出的表面结构上的电极层的上表面上。
优选地，所述表面结构包括由所述支撑基底上所述裸露的电极层的范围限定的传感表面。优选地，所述传感表面由所述电极层上的惰性层限定。优选地，所述惰性层存在于所述表面结构之间。优选地，所述传感表面通过惰性层与其他传感表面分开。优选地，一个电极层上的传感表面电连接到同一电极层上的至少一个另外的传感表面。优选地，在所述惰性层下面电连接到所述至少一个另外的传感表面。
优选地，所述传感器包括多个表面结构，每个表面结构在所述电极层上具有传感表面。
优选地，多个传感表面经由所述电极层电连接以形成传感组。在一个实施例中，所述传感器包括两个或多个传感组，其中每个传感组与其他组电隔离。
优选地，所述传感表面不因与电活性物质相互作用而被电化学钝化。所述可检测响应的电化学钝化或衰减可能由所述结合剂、所述结合区域或所述样本诱导的基质效应引起。
优选地，所述传感表面包括保护涂层。优选地，所述保护涂层包括自组装单层膜或蛋白质。
优选地，所述保护涂层是可移除的。
优选地，所述表面结构突出穿过所述惰性层。优选地，所述表面结构从所述支撑基底突出。
优选地，所述表面结构包括位于所述表面结构顶部的顶点。在一些实施例中，所述顶点的表面结构具有带波形表面的上部和带不同波形表面的至少一个下部。在一些实施例中，所述表面结构或其上部是圆顶形、锥形、金字塔形、乳头状、脊形或多面体形。
优选地，脊部沿横截面具有凸形、乳头状、锥形、三角形或多边形轮廓，该横截面沿大致平行于支撑基底顶面的轴线。
本领域技术人员将理解，当以非常高的放大率(例如原子或纳米尺度)观察时，任何具有顶点的表面结构都可能是平坦的。因此，本文提供的形状和测量旨在指所述表面结构的整体形状，而不是精确的几何描述。
优选地，所述表面结构包括具有凸形上表面的上部。优选地，所述上部的表面逐渐变细或变圆至顶点。
优选地，所述表面结构沿着垂直于所述支撑基底顶面的平面的横截面是三角形、凸半圆形或乳头状。
优选地，所述表面结构沿着平行于所述支撑基底顶面的平面的横截面基本上呈三角形、基本上呈圆形或基本上呈正方形。
优选地，所述表面结构的横截面积沿着垂直于所述支撑基底顶面的轴线减小。
在一个实施例中，所述表面结构均匀布置在所述支撑基底上。在一个实施例中，所述表面结构随机布置在所述支撑基底上。
优选地，所述表面结构包括光滑表面。优选地，所述表面结构是规则的形状。优选地，所述表面结构具有至少一条对称线，并且优选地具有两条对称线。优选地，所有或多个表面结构的形状基本相同。优选地，所有或多个表面结构的表面积基本相同。
在一个实施例中，所述结合层作为平面层沉积在所述惰性层或支撑基底的上表面上。优选地，所述结合层邻近所述电极层，可选地，在所述结合层和所述电极层之间具有隔离材料或间隙。
优选地，所述结合层的范围限定孔，所述传感表面通过所述孔暴露于所述样本。
优选地，所述结合层沉积在所述表面结构周围，使得所述表面结构的上部突出，其上具有裸露的传感表面。
优选地，所述结合层包括平坦表面，所述至少一个表面结构突出穿过所述平坦表面。
优选地，所述结合层包括与结合剂相结合的材料。优选地，所述材料具有适于结合结合剂(如抗体)的分子功能。优选地，所述结合层粘附到所述支撑基底的所述顶面。优选地，所述结合层是导电的。优选地，所述结合层电连接到电极(或适于电连接)，例如能够施加电位的测量电极。
优选地，所述结合剂包括对特定目标分析物特异的适体或抗体。优选地，所述结合剂选自抗原、抗体、抗体片段、单链可变片段、生物素化蛋白质、肽、核酸(例如，DNA、ssDNA、mRNA、miRNA、适体)、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、含有多组氨酸或谷胱甘肽硫转移酶的重组表达蛋白质、大或小含胺分子、含巯基分子或表达谷胱甘肽硫转移酶的蛋白质、金属和金属盐(例如铅、磷酸铅、铬、铂、钯、铱、铜等)。
优选地，所述结合层包括保护涂层(该涂层与基质的结合可忽略不计，并且使得所述结合剂的识别部分可用于结合)。
当所述结合层在惰性层的表面上时，优选所述结合层包括交联聚合物、光致抗蚀剂或自组装单层膜。优选地，所述交联聚合物是光致抗蚀剂，例如SU-8、AZ40XT、Shipley3612、聚酰亚胺。优选地，所述结合层通过旋涂、喷涂、浸涂、擦拭或涂漆来沉积。优选地，所述结合层通过旋涂沉积在所述支撑基底上。
在磁性粒子用作所述结合层的实施例中，所述结合区域包括所述支撑基底的适于附着一个或多个磁性粒子的区域。
优选地，所述结合区域在所述支撑基底之上、之中或之下具有至少一个磁性元件。所述磁性元件吸引所述磁性粒子，使其附着在所述结合区域。
优选地，所述结合区域与所述传感表面分开一个分隔距离，其中所述分隔距离足以允许在所述传感表面处检测所述可检测响应。优选地，所述分隔距离使得可以在所述传感表面处检测所述可检测响应，而不会被所述结合层或结合剂削弱。
优选地，所述分隔距离在大约1nm和50mm之间。在特定实施例中，所述分隔距离在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
优选地，所述粒子直接附着到所述支撑基底的上表面。
优选地，所述粒子附着在所述支撑基底上的惰性表面上。
优选地，所述磁性粒子与所述传感表面相隔如上所定义的分隔距离。
优选地，所述传感表面和结合区域容纳在微流体系统中。
优选地，所述传感表面和所述结合区域位于所述微流体系统的不同隔室中。
优选地，所述结合区域对施加到所述传感器上的所述样本的成分是惰性的。
优选地，所述结合区域由所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立的磁场区域限定。
在一个实施例中，所述结合层包括附着到所述支撑基底的一个或多个磁性粒子上的功能表面。优选地，所述粒子是铁磁或顺磁性粒子。
优选地，所述磁性粒子到所述支撑基底的附着是通过磁性元件和所述磁性粒子之间的磁引力实现的。
优选地，所述传感表面突出于所述粒子之上，使得在使用中，所述表面结构暴露于所述样本。优选地，所述传感表面突出穿过粒子层，使得在使用中，所述表面结构暴露于所述样本。
优选地，所述粒子附着到所述表面结构周围的表面，使得所述表面结构的上部突出，其上具有裸露的传感表面。
优选地，所述粒子附着在所述表面结构周围的表面上，并覆盖所述表面结构本身。优选地，所述磁性元件包括产生磁场的元件。优选地，所述元件包括电磁体或铁磁体。优选地，所述磁性元件固定到所述传感器上或者是可移除的。
优选地，所述磁性元件定位成将所述粒子附着在所述表面结构周围，使得所述表面结构的上部突出穿过所述粒子，其上具有裸露的传感表面。
优选地，所述磁性元件定位成所述将粒子附着在所述电极层附近，可选地在所述粒子和所述电极层之间具有隔离材料或间隙。
优选地，所述磁性元件定位成所述将粒子附着到与所述传感表面分离的所述结合区域。
优选地，所述粒子上的所述功能表面包括与结合剂相结合的功能材料。优选地，所述功能材料具有适于结合结合剂(如抗体)的分子功能。
优选地，所述磁性粒子包括功能表面，所述功能表面包括羧酸盐、胺化的、生物素化的或蛋白质A或G涂层。优选羧基化的。
优选地，所述结合层包括保护涂层以消除非特异性结合。
优选地，所述结合层的一部分被封闭剂封闭。优选地，所述封闭剂是乙醇胺或表面活性剂(例如吐温)、蛋白质、OVA、BSA或磷酸盐。
优选地，适于附着到所述粒子上的所述结合剂包括对特定目标分析物特异的抗原或抗体。优选地，所述结合剂选自抗原、抗体、适体、抗体片段、单链可变片段、生物素化蛋白质、肽、核酸、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、含有多组氨酸或谷胱甘肽硫转移酶的重组表达蛋白质、大或小含胺分子、含巯基分子或表达谷胱甘肽硫转移酶的蛋白质、金属和金属盐(例如铅、磷酸铅、铬、铂、钯、铱、铜等)。
在一个实施例中，所述传感器包括两个或多个适于检测所述目标分析物与结合剂结合的响应的传感组。
在另一实施例中，所述传感器包括通过所述电极层电连接到一个或多个传感表面或传感组的测量电极。
优选地，所述测量电极连接到测量装置，所述测量装置测量电流、阻抗、电压、电容、电阻、电导、磁通量或电场中的一个或多个的变化。
优选地，所述传感器包括传感器系统的一部分，所述传感器系统包括适于将所述样本保持在所述传感器表面上的样本容器。优选地，所述传感器系统还包括参比电极。优选地，所述传感器系统还包括反电极。优选地，在检测所述可检测响应期间，所述反电极和所述参比电极接触所述样本。
在一个实施例中，所述传感器适于设置在无流动环境中。在另一实施例中，所述传感器适于设置在流动环境中。
优选地，所述传感器具有单个磁性结合区域和单个传感表面。
优选地，所述传感器具有对应多个传感表面的多个结合区域，对应单个传感表面的多个结合区域。
在另一实施例中，所述结合层或所述结合区域邻近第一电极层上的第一传感表面；以及
其中所述第一传感表面邻近第二电极层上的第二传感表面；以及
其中所述第一传感表面与所述结合层或所述结合区域的第一分隔距离小于所述第二传感表面与所述结合层或所述结合区域的第二分隔距离；以及
其中所述第一和第二电极层彼此电隔离。
优选地，所述传感器适于在目标分析物与结合剂结合后在所述第一和第二传感表面处检测可检测响应。
优选地，与所述第一传感表面相邻的所述结合区域由所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立的磁场区域限定。
优选地，所述传感器还包括分别位于第三、第四、第五或其他电极层上的第三、第四、第五或其他传感表面，其中所述电极层彼此电隔离；
其中所述结合层或所述结合区域与所述相应传感表面之间的分隔距离随着电极层数量的增加而逐渐增加。
优选地，所述传感器适于在目标分析物与结合剂结合之后至少在所述第一和第二传感表面处检测可检测响应。
在一个实施例中，所述第一分隔距离(所述传感器表面和所述结合区域之间)在大约1nm和5mm之间，所述第二分隔距离在大约1nm和5mm之间。在特定实施例中，所述分隔距离在大约30nm和1mm之间、在大约100nm和500μm之间、在大约1μm和200μm之间或者在大约20μm和100μm之间。所述分隔距离可以在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
在一个实施例中，所述第一传感表面和所述第二传感表面之间的第一传感表面间距离在大约30nm和1mm之间。相邻传感表面(分别连接到不同电极层)之间的其他传感表面间距离优选在大约30nm和1mm之间。
在特定实施例中，所述传感器包括两个或多个离散的电极层，每个电极层连接到测量电极。优选地，所述传感器包括5至8个电极层。
在一个实施例中，所述电极层用隔离材料或间隙与所述结合区域或至少一个其他电极层电隔离。
在第一方面的一个实施例中，本发明提供了一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.多个表面结构，所述表面结构与所述支撑基底成一体并从所述支撑基底的上表面突出，其中每个表面结构包括在所述表面结构的上表面上的电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
e.所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件，其在使用中附着到所述支撑基底上，其中所述磁性粒子包括附着到所述粒子的功能表面上的结合剂，并且其中所述结合剂适于接触样本并与所述样本中的目标分析物相结合。
优选地，所述结合区域由所述磁性元件建立的磁场区域限定。
优选地，所述传感表面与所述磁性粒子上的所述结合层分离。优选地，所述传感表面与所述结合层分开足够的分隔距离，以在所述目标分析物与附着到所述结合层上的结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。优选地，所述分隔距离在大约30nm和1mm之间、在大约100nm和500μm之间、在大约1μm和200μm之间或者在大约20μm和100μm之间。所述分隔距离可以在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
在另一方面，本发明提供了一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物或电活性物质的样本；
d.磁性元件定位装置，适于定位磁性元件以建立磁场，从而将一个或多个磁性粒子附着到所述支撑基底。
优选地，所述磁性定位装置是磁体。优选地，所述磁体是永磁体，例如由钕铁硼、钐钴、铝镍钴和陶瓷或铁氧体形成的永磁体。优选地，所述磁体是电磁体。
优选地，所述磁体定位装置被定位成将所述粒子捕获为所述结合区域表面上的单层膜。
关于第一方面传感器描述的特征、变化和实施例是可应用的，并且旨在结合本发明的上述方面来阅读。
在第二方面，本发明提供了一种传感器，包括：
a.支撑基底，可选地其上形成有表面结构；
b.沉积在所述支撑基底和可选的所述表面结构上的电极层；
c.第一电极层上的第一传感表面和第二电极层上的至少第二传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底和可选的所述电极层上的结合区域，其中所述结合区域与所述第一和第二传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂接触包含目标分析物的样本。
在第二方面的实施例中，所述结合区域由所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立的磁场区域限定，所述磁性元件在使用中吸引磁性粒子并将所述磁性粒子附着到所述支撑基底上，其中所述磁性粒子包括适于接触包含目标分析物的样本的结合层。
优选地，所述结合区域在所述支撑基底之上、之中或之下具有至少一个磁性元件。所述磁性元件吸引所述磁性粒子，使其附着在所述结合区域。
优选地，所述结合区域邻近第一电极层上的所述第一传感表面；以及
其中所述第一传感表面邻近所述第二电极层上的所述第二传感表面；以及
其中所述第一传感表面与所述结合区域的第一分隔距离小于所述第二传感表面与所述结合区域的第二分隔距离；以及
其中所述第一和第二电极层彼此电隔离。
关于第一方面传感器描述的特征、变化和实施例是可应用的，并且旨在结合第二方面的特征来阅读。
在第三方面，本发明提供一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于通过将磁性元件或磁性元件定位装置定位在所述支撑基底之上、之中或之下来将磁性粒子附着到所述支撑基底上，以便于建立能够吸引所述磁性粒子的磁场；
e.可选地将磁性粒子附着到所述结合区域；
f.可选地将结合剂附着到所述磁性粒子上的结合层上的功能表面上，
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
惰性层可以是光致抗蚀剂、漆层、自组装单层膜、环氧树脂。
优选地，所述生产方法还包括将磁性元件和/或磁性元件定位装置附着到所述传感器。
优选地，所述磁性定位装置是磁体。优选地，所述磁体是永磁体，例如由钕铁硼、钐钴、铝镍钴和陶瓷或铁氧体形成的永磁体。优选地，所述磁体是电磁体。
优选地，所述磁体定位装置被定位成将所述粒子捕获为所述结合区域表面上的单层膜。
优选地，所述支撑基底包括聚合物、硅或玻璃。
优选地，所述至少一个表面结构与所述支撑基底成一体。
优选地，所述电极层通过选自溅射技术(优选磁控溅射)、蒸发、涂漆、喷涂或旋涂的技术沉积在所述表面结构上。
优选地，所述电极层包括厚度基本恒定的层，所述层覆盖所述表面结构和可选的所述支撑基底。
优选地，所述电极层的厚度在大约1nm和5μm之间，更优选地在40和500nm之间或者在50和100nm之间。更优选地，约5nm至3μm、50nm至100nm厚、70nm至400nm厚、900nm至300nm厚。
优选地，保护涂层被施加到所述电极层。优选地，与所述结合层相比，所述保护涂层优先与所述电极层相结合。所述保护涂层可以是任何涂层，但是在特定实施例中，由自组装单层膜组成。在该实施例中，自组装单层膜中的巯基结合到所述表面，而不结合(或结合程度较低)到所述结合层。
优选地，所述电极层包括选自导电金属、碳、玻璃碳、碳质材料、石墨烯、碳纳米管、导电油墨、负载聚合物、导电聚合物或层状结构的导电材料。优选地，所述导电金属包括金、银、镍或铂。优选地，所述层状结构包括含金的钛、含金的铬或含导电聚合物的金。
优选地，所述传感表面通过在所述支撑基底/表面结构上沉积结合层或惰性层来形成，使得所述表面结构的上部没有结合层或惰性层。这导致所述表面结构上部的所述电极层的表面裸露，作为传感表面。
优选地，所述分隔距离在大约1nm和50mm之间。在特定实施例中，所述分隔距离在大约30nm和5mm之间、在大约100nm和5000μm之间、在大约1μm和1000μm之间或者在大约20μm和100μm之间。所述分隔距离可以在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
优选地，所述方法包括生产多个表面结构，每个表面结构具有形成在每个表面结构的所述电极层上的传感表面。
优选地，所述多个传感表面电连接以形成传感组。优选地，所述多个传感表面在所述结合层下方电连接。在一个实施例中，所述方法包括形成两个或多个传感组，其中每个传感组与其他组电隔离。
优选地，所述方法还包括在所述传感表面或所述结合层/区域中的至少一个上沉积保护涂层。优选地，所述保护涂层包括自组装单层膜、光致抗蚀剂或蛋白质(例如卵清蛋白或其他没有特定活性的封闭蛋白)。
优选地，所述保护涂层是由烷硫醇(HS(CH2)XCH3)制成并由乙醇溶液沉积的自组装单层膜，其中X＝0至16(X＝0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16)。
优选地，所述自组装单层膜包括长链分子，所述长链分子包括C6至C24的碳链，其可以是烷烃、烯烃、炔烃或芳烃。优选地，C6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或其混合物。
优选地，所述自组装单层膜包括短链分子，所述短链分子包括C10或以下的碳链。优选地，C1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或其混合物。
优选地，所述自组装单层膜是包括长链(如上C10-C24)和短链(如上C1-C10)分子的混合自组装单层膜，其可以是烷烃、烯烃、炔烃或芳烃。
优选地，所述混合自组装单层膜包括长链分子和短链分子，长链分子包括C6至C24的碳链(如上所述)，短链分子包括C10至C1的碳链(如上所述)。
优选地，所述长链自组装单层膜包括选自叠氮化物、胺、羧酸盐、醛、酮、酯或羧酸或其混合物的分子。这种分子存在于所述自组装单层膜的末端。
优选地，所述短链自组装单层膜包括选自烷烃、叠氮化物、胺、羟基、羧化物或羧酸或其混合物的分子。这种分子存在于所述自组装单层膜的末端。
在一个特定实施例中，所述自组装单层膜包括长链分子和短链分子的混合物，长链分子包括C6以上的羧酸分子，短链分子包括羟基分子。在上述实施例中，所述自组装单层膜长链分子优选选自C6至C24分子。
优选地，所述表面结构通过热压花、CFT加工、注射成型、冲压或平版印刷技术形成在所述支撑基底上。
优选地，所述表面结构形成有位于所述表面结构顶部的顶点。先前定义的所述表面结构的其他实施例也适用于第三方面。
优选地，所述结合区域邻近所述电极层形成。优选地，隔离材料沉积在所述结合层和所述电极层之间。所述隔离材料是将所述结合层与所述电极层隔离的惰性层。
优选地，所述传感表面通过沉积所述惰性层形成，所述惰性层限定了暴露于所述样本的所述传感表面。
优选地，通过旋涂的方式在所述表面结构周围沉积结合层来形成所述传感表面，使得所述表面结构的上部裸露。
优选地，所述结合剂通过静电附着或共价键合附着到所述磁性粒子的所述功能表面。优选地，所述结合剂还包括捕获剂。
优选地，封闭剂沉积在所述结合区域上。所述封闭剂用于封闭所述结合区域和所述结合层的非特异性结合。封闭剂的示例包括蛋白质(BSA、OVA)或小分子如乙醇胺。
优选地，所述磁性粒子上的所述结合层包括与结合剂相结合的材料。
优选地，所述结合层包括保护涂层。优选地，所述保护涂层包括自组装单层膜或蛋白质。
优选地，所述粒子上的所述功能表面包括与结合剂相结合的功能材料。优选地，所述功能材料具有适于结合结合剂(如抗体)的分子功能。
优选地，所述磁性粒子包括功能表面，所述功能表面包括羧酸盐、胺化的、生物素化的或蛋白质A或G涂层。
优选地，所述结合层包括保护涂层以消除非特异性结合。
优选地，所述结合层的一部分被封闭剂封闭。优选地，所述封闭剂是乙醇胺或表面活性剂(例如吐温)。
优选地，所述结合剂包括对特定目标分析物特异的抗原或抗体。优选地，所述结合剂选自抗原、抗体、抗体片段、单链可变片段、生物素化蛋白质、肽、核酸、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、含有多组氨酸或谷胱甘肽硫转移酶的重组表达蛋白质、大或小含胺分子、含巯基分子或表达谷胱甘肽硫转移酶的蛋白质、或金属和金属盐。
优选地，所述自组装单层膜结合层包括长链分子，所述长链分子包括C6或以上的碳链。优选地，所述自组装单层膜结合层包括短链分子，所述短链分子包括C5或以下的碳链。优选地，所述自组装单层膜结合层是包括长链和短链分子的混合自组装单层膜。优选地，所述混合自组装单层膜包括长链分子和短链分子，长链分子包括C6或以上的碳链，短链分子包括C5或以下的碳链。优选地，所述长链自组装单层膜包括选自叠氮化物、胺、羧酸盐或羧酸的末端官能团。优选地，所述短链自组装单层膜包括选自烷烃、叠氮化物、胺、羟基、羧化物或羧酸的分子。
优选地，所述自组装单层膜包括长链分子，所述长链分子包括C6至C24的碳链，其可以是烷烃、烯烃、炔烃或芳烃。优选地，C6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或其混合物。
优选地，所述自组装单层膜包括短链分子，所述短链分子包括C10或以下的碳链。优选地，C1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或其混合物。
优选地，所述自组装单层膜是包括长链(如上C6-C24)和短链(如上C1-C6)分子的混合自组装单层膜，其可以是烷烃、烯烃、炔烃或芳烃。
优选地，所述混合自组装单层膜包括长链分子和短链分子，长链分子包括C6至C24的碳链(如上所述)，短链分子包括C6至C1的碳链(如上所述)。
优选地，所述长链自组装单层膜包括选自叠氮化物、胺、羧酸盐、醛、酮、酯或羧酸或其混合物的分子。这种分子存在于所述自组装单层膜的末端。
优选地，所述短链自组装单层膜包括选自烷烃、叠氮化物、胺、羟基、羧化物或羧酸或其混合物的分子。这种分子存在于所述自组装单层膜的末端。
在一个特定实施例中，所述自组装单层膜包括长链分子和短链分子的混合物，长链分子包括C6以上的羧酸分子，短链分子包括羟基分子。在上述实施例中，所述自组装单层膜长链分子优选选自C6至C24分子。优选地，所述结合层包括自组装单层膜，并且不存在于如上定义的所述表面结构的上部。
优选地，沉积结合层的步骤包括如前一段所述施加自组装单层膜结合层。优选地，沉积包括：
a.将长链自组装单层膜或混合自组装单层膜(例如上述那些)施加到所述电极层；
b.向所述电极层施加电荷，以选择性地从所述表面结构的上部移除所述自组装单层膜；
c.将短链自组装单层膜(如上所述的)施加到所述电极层，使得所述短链自组装单层膜主要从b附着到所述表面结构的上部；
d.可选地，向所述结合层施加结合剂，其中所述结合剂优先结合所述长链自组装单层膜；以及
e.可选地，向所述电极层施加另一电荷，以选择性地从所述表面结构的上部去除所述短链自组装单层膜，并产生基本上不含自组装单层膜分子的传感表面。
优选地，所述传感表面由所述支撑基底和表面结构上惰性层的沉积程度限定，使得传感表面形成在所述表面结构上的所述电极层上。在一个实施例中，所述惰性层包括其上沉积有封闭剂或保护涂层的结合层。
优选地，所述惰性层对要施加到所述传感器上的样本的任何组分基本上不反应，并且抵抗其非特异性结合。
在一个实施例中，所述方法包括沉积两个或多个离散的电极层以形成两个或多个传感组。
在一个实施例中，所述电极层用隔离材料或间隙与所述结合区域或至少一个其他电极层电隔离。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
在第四方面，本发明提供了一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离并包括磁场；
b.将磁性粒子附着到所述结合区域，其中所述磁性粒子包括附着到所述磁性粒子上的结合层的至少一种结合剂；
c.将所述结合剂与含有目标分析物的样本接触；
d.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
e.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导所述可检测响应。
优选地，所述传感表面和结合区域容纳在微流体系统中。
优选地，所述传感表面和所述结合区域位于所述传感器或微流体系统的不同隔室中。
优选地，所述磁性粒子通过在所述结合区域激活磁场而附着到所述结合区域。优选地，所述磁场的激活包括将磁性元件定位在所述支撑基底之上、之中或之下。优选地，所述磁场的激活包括所述支撑基底之上、之中或之下的电磁体的激活。
优选地，所述磁体定位装置是永磁体，例如由钕铁硼、钐钴、铝镍钴和陶瓷或铁氧体形成的永磁体。
优选地，所述电活性物质处于氧化还原状态，其在保持在还原或氧化电位的所述传感表面引发可检测响应。
优选地，所述还原电位在约0mV和-1000mV之间。在一个实施例中，所述还原电位在大约-350mV和-450mV之间或大约-200mV、-300mV或-400mV之间，或0和大约-1mV之间。
优选地，所述氧化电位在大约0mV和1500mV之间。在一个实施例中，所述氧化电位在约150mV至600mV或约200mV、300mV或400mV之间。
在一个实施例中，所述电活性基底(可选地包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺)接触配体标记目标分析物(可选地包括辣根过氧化物酶)，从而导致所述电活性基底氧化以产生电活性物质(可选地包括氧化的3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，其通过与保持在还原电位的所述传感表面接触而在所述传感表面引发可检测响应(可选地，其中所述可检测响应包括氧化的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的还原)。
优选地，所述目标分析物与配体共轭。
优选地，所述电活性物质在所述结合的目标分析物暴露于电活性基底后产生。
优选地，通过使所述样本流过所述传感器的表面来施加所述样本。优选地，所述样本在密封装置中流动。优选地，所述密封装置包括微流体通道或在线传感器。
优选地，所述样本通过自动或手动方式施加。优选地，通过用所述样本浸没或清洗所述传感器来施加所述样本。优选地，所述传感器被保持在密封装置中，所述样本被施加到所述密封装置。优选地，所述密封装置包括微流体通道。
优选地，在测量变化的步骤之前，去除所述传感表面和所述结合区域中至少一个上的保护涂层。
优选地，在所述测量电极处测量的变化选自电流、阻抗、电压、电容、电阻、电导、磁通量或电场的变化。
在第四方面的一个实施例中，本发明提供了一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供如第一、第二或第四方面所定义的传感器；
b.用配体标记所述目标分析物；
c.将所述传感器和所述结合剂与含有预定量的所述标记目标分析物和未标记目标分析物的样本接触；
d.将电活性基底施加到所述传感器上，使得所述电活性基底的一部分被所述结合的标记目标分析物氧化或还原；
e.测量电连接到至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中所述标记或未标记目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面的可检测响应。
优选地，前面一段中的实施例包括直接或间接的竞争性夹心或置换试验。
在第四方面的另一实施例中，所述方法还包括通过在所述传感表面施加还原电位来再生配体催化剂。
在第四方面的一个实施例中，所述结合层和结合剂在磁性粒子上，所述磁性粒子通过磁场附着到所述传感器表面。
在另一实施例中，所述方法包括通过去激活所述磁场来分离所述磁性粒子。
所述磁场由磁性元件建立，所述磁性元件通过本领域技术人员已知的方法激活或去激活。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
在一个特定实施例中，所述方法包括：
a.用第一结合剂附着第一组磁性粒子；
b.执行检测样本中目标分析物与所述第一结合剂结合的方法；
c.去激活所述磁场以去除所述第一组磁性粒子；
d.用第二结合剂附着第二组磁性粒子；以及
e.执行检测样本中目标分析物与所述第二结合剂结合的方法。
优选地，用第三组或另一组磁性粒子重复所述方法。
优选地，所述传感表面和磁性粒子容纳在微流体系统中或微流体系统的一部分中。
优选地，所述传感表面和所述结合区域位于所述微流体系统的不同隔室中。优选地，所述传感表面和所述结合区域分开在第一方面中定义的分隔距离。
在第四方面的另一实施例中，所述方法包括使用传感器，所述传感器在两个或更多电极层上具有两个或更多传感表面，其与所述结合区域上的结合位点的距离增加；以及
其中测量变化的步骤包括在两个或多个测量电极处测量变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；其中所述方法还包括：
a.测量作为与所述结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化；
b.可选地，将所述可检测响应的变化与对照样本中已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
c.可选地，确定所述样本中所述目标分析物的浓度。
关于本发明的先前方面或实施例的传感器描述的特征、变化和实施例适用于这些特征，并旨在结合这些特征来阅读。
在第五方面，本发明提供了一种确定样本中目标分析物浓度的方法，所述方法包括：
a.提供如第二方面所定义的传感器；
b.将至少一种结合剂附着在所述结合区域处的结合层上；
c.将包括所述结合剂和至少一个传感表面的所述传感器与包含所述目标分析物的样本接触；
d.测量两个或多个测量电极处的变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；
e.测量作为与结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化，在所述结合位点发生所述结合试剂与所述目标分析物的结合；
f.将响应的变化与对照样本中的已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
g.确定所述样本中所述目标分析物的浓度；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导可检测响应。
优选地，所述传感器设置在流动环境中。优选地，所述传感器容纳在微流体系统中或微流体系统的一部分中。
优选地，所述传感表面和所述结合区域位于所述微流体系统的不同隔室中。优选地，所述传感表面和所述结合区域分开在第一方面中定义的分隔距离。
在第五方面的一个实施例中，所述结合层在附着到所述支撑基底上的结合区域的磁性粒子上，其中所述结合区域由所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立的磁场区域限定，所述磁性元件在使用中吸引磁性粒子并将磁性粒子附着到所述支撑基底上。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
结合本发明的先前方面和实施例描述的特征、变化和实施例是可应用的，并且旨在结合该方面的特征来阅读。
本领域技术人员将理解，本说明书中描述的本发明的方面、实施例和特征可以单独地或共同地结合在所述方面、实施例或特征中的两个或多个的任意或所有组合中。
在阅读了提供本发明的实际应用的至少一个示例的以下描述后，本发明的其它方面将对本领域技术人员变得显而易见，这些方面在其所有新颖方面都应该被考虑。
附图说明
现在将参照附图仅以示例的方式描述本发明的实施例，其中：
图1示出了具有自组装单层膜的电极的现有技术中的示例，其中传感表面与结合区域相同。
图2示出了本发明的四种可能的结构。图2A示出了作为电极层的裸露区域的传感表面，图2B示出了具有凸形横截面的表面结构。图2C示出了具有三角形横截面的传感表面。
图2D示出了具有三角形横截面的传感器的横截面示意图。三维表示时，该实施例的表面结构可以是锥形或脊形。
图3示出了图2所示每种结构的平面图，并将电极显示为4x4阵列。
图4示出了基于3,3',5,5'-四甲基联苯胺还原/氧化的传感器的传感机制，该传感器将结合剂与传感表面分离。
图5示出了本发明的一个实施例，其中结合区域和传感表面被隔离，但在线性(A)和圆形(B)结构中是相邻的。结构B分别以(i)侧视图和(ii)平面视图示出，箭头表示可能的流动方向。
图6示出了与传感表面隔离的结合区域，其中A示出了多个平坦的传感表面，B示出了孔底部的多个传感表面，C示出了支撑基底/电极层上具有三角形横截面的多个表面结构，D示出了支撑基底/电极层上具有三角形横截面的多个表面结构，其中仅传感表面暴露于惰性层或结合层上方。
图7示出了样本(7.1)中的目标分析物与传感器结合区域上的结合剂的结合，以及其后配体标记目标分析物(TA-HRP)(7.2)与传感器结合区域上的结合剂的结合。
图8示出了结合的目标分析物或结合的配体标记目标分析物(TA-HRP)在A.低TA负载和B.高TA负载下暴露于相同浓度的电活性基底(TMBred)，以及在每种情况下连续电极表面上的电活性基底TMBox的减少。
图9示出了低(样本浓度A(Sample Conc.A))和高(样本浓度B(Sample Conc.B))TA浓度的响应曲线。
图10A示出了尖端电极阵列集成到分解的传感器中。
图10B示出了使用微电极阵列作为结合区域，并将尖端电极阵列集成到分解的传感器中。
图11示出了对平面传感表面与尖端上传感表面阵列观察到的电流密度范围之间的比较。
图12A示出了具有五个电极层和限定传感器区域的通道的多分析物传感器。图12B示出了位于在A中突出显示的区域的均匀排列的传感组(阵列)。图12C示出了具有突出穿过结合层的金电极尖端的单个传感表面。
图13示出了在反应离子蚀刻后，分别在没有封闭剂(左栏，无阴影)和有封闭剂(右栏，有黑色阴影)的情况下，用乙醇胺封闭对(A)金、(B)SU8、(C)SU8上辣根过氧化物酶吸收的影响。
图14示出了在2个浓度下，即A-30mol(m2s)和B-5mol(m2s)，预期电活性物质生成和输出电流(图14C)的模型数据的一个示例。图14C还指示传感器阈值，并表明所有5个电极将显示对较高浓度的响应，而只有前2个电极将对较低浓度做出响应。
图15示出了蛋白质在金、SU8和漆表面结合的分光光度试验。
图16示出了SU8分光光度测定的P4标准曲线。
图17示出了通过电化学测定获得的P4标准曲线，其中传感器表面在结合区域(SU8)内。
图18示出了未涂覆金电极(a，黑线)、自组装单层膜涂覆金电极(b，短线虚线)和清洁金电极(c，点虚线)的循环伏安扫描。
图19示出了在还原的3,3',5,5'-四甲基联苯胺存在的情况下，保持在-200或-400mV的WA和WB的电化学响应。
图20示出了在-400mV下，不添加额外的H2O2，由于与已知P4浓度的表面固定抗体结合的辣根过氧化物酶-P4的交换而产生的3,3',5,5'-四甲基联苯胺还原反应。
图21示出了60秒测量后的电流响应。
图22示出了使用自组装单层膜作为结合层制备的传感器，以及与结合层相比具有不同功能化表面结构传感表面的阵列的功能化/去功能化。
图23示出了本发明的一个实施例，其中磁性粒子附着到由支撑基底下的磁体建立的结合区域。
图24示出了本发明的一个实施例，其中磁性粒子附着到由支撑基底下的磁体建立的结合区域，并且其中传感表面与结合区域分开一段距离。
图25示出了本发明方法在ELISA(光学)和电化学检测中用于检测氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺时的准确性和灵敏度。
图26示出了具有三角形横截面的表面结构的导电表面上的电流密度的计算机模型。该结构顶点处较暗的颜色表明电流密度更加集中。同样的数字用彩色(A)和黑白(B)表示。
图27示出了具有半圆形横截面的表面结构的导电表面上的电流密度的计算机模型。该结构顶点处较暗的颜色表明电流密度更加集中。同样的数字用彩色(A)和黑白(B)表示。
图28A示出了竞争性试验的基于流体的分析—示例7。
图28B示出了磁珠在置换试验中的使用—示例8。
图29示出了传感器对被结合和释放的磁珠的电流响应—示例9。
图30示出了不同3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度下的光学响应和电化学响应之间的相关性，所述响应由电化学传感器下的初始捕获和清洗，及其随后的释放和再捕获产生—示例10。
具体实施方式
定义
“结合剂”是指传感器的一个组分，其附着在结合层上，并直接或间接地与目标分析物相结合，以产生电活性物质。
“附着”或“结合”是指共价键合、静电结合、磁吸引或某种其他结合方式，其中所述物质以某种方式结合或吸引到载体上。
“粒子”是指能够在其功能表面上保留结合剂或捕获剂，并具有足够的可移动性以附着到传感器表面或从传感器表面分离的任何可分离元件。在特定实施例中，粒子是磁性粒子，并且可以通过在传感器上、传感器内或传感器下建立磁场实现附着或分离。
“微流体通道”是指其小尺寸可以使流体路径内产生层流的通道。
“逐渐变细”是指从较宽的表面结构到较窄的表面结构。
“平滑”是指表面角度变化率基本不变。
“配体”是指附着于目标分析物并直接或间接导致施加于样本的电活性基底活化(即氧化或还原)的组分。配体通常是酶，可以选自例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和过氧化氢酶。
“电化学钝化”是指通过抑制表面与电活性物质的电化学相互作用的物质部分或完全掩蔽或阻挡传感表面。
“电活性基底”指氧化还原活性化合物，例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(简称“TMB”)，或醌。在一些实施例中，电活性基底包括额外的活化物质，例如过氧化氢(H2O2)，用于辣根过氧化物酶配体的再生。在这些情况下，术语电活性基底旨在包括所述活化物质。本领域技术人员将会理解，为了产生电活性物质和再生催化剂(例如辣根过氧化物酶配体)，电活性基底必须包括活化物质。
“电活性物质”是指作为目标分析物与结合剂结合的结果而产生的供电子物质或电子接收物质，并且当与传感表面接触时引发可检测响应。电活性物质通过从结合位点(即结合实际发生的位置)移动(通过扩散或流动)到产生可检测响应或变化的传感表面来介导响应。
“转换”是指通过结合剂或捕获剂测量目标分析物结合事件的机制。结合事件产生电化学响应(通过基底与配体的结合产生)，该电化学响应在传感表面作为可检测响应被测量。可检测响应可以是当基底被氧化或还原时在传感表面的电子损失或增益。
“无流动环境”是指样本在传感器上表面基本上没有横向移动。
“流动环境”是指样本在传感器上表面有可检测的、受控的或不受控制的基本横向移动。流动方向通常是从结合剂到传感表面的方向。然而，该流动可以仅仅是搅动或摇动，以帮助电活性物质从结合部位快速扩散到传感表面。
“沉积”是指在表面上形成，可以指任何形式的形成、分层或产生。在一个实施例中，沉积通过溅射实现。优选地，沉积层一定程度上粘附于其沉积于上面的层。这种粘附可以是共价的、静电的或者包括范德华力。
电极层的“基本恒定的厚度”是指电极层覆盖支撑基底或结合层的范围没有显著变化。术语“基本恒定的厚度”旨在包括基本上对传感器功能没有影响的层厚度的无意变化。
结合层或结合剂的效果的“减弱”是指在传感表面检测到的响应被结合层的存在或结合剂的存在或结合作用阻碍或电阻断。
本文所指的“表面结构”是指单个表面结构或多个表面结构。
除非上下文明确要求，否则“包括”等应理解为包含性的，而不是排他性或穷尽性的，也就是说，理解为“包括但不限于”。
“惰性”是指对阵列组分和通常应用于其的溶液/样本不起化学反应的材料。由于“惰性”表面缺乏反应性，确保了组分与表面的化学、物理或静电结合最小。对于杂化的组分(如核酸)，惰性表面使非特异性杂化和结合最小化。惰性层与结合层形成对比，结合层具有特别有助于溶液中特定组分结合或使该层结合到另一表面的特征或特性。
说明
发明人开发一种传感器，其中目标分析物与结合层上的结合剂的结合在传感器上的传感表面处引发可检测响应，但是传感表面与同一传感器上的结合层分离。发明人发现，将结合层和结合区域与传感器上的传感表面分离有助于实现稳定的结合层，同时也限制了对传感表面处的传感的干扰。这样，传感表面基本上不受结合剂的电阻碍，因此可检测响应不会减弱。因此，本发明希望能够在传感表面以及随后在测量电极处增加响应检测，同时还能够减少或完全避免由结合区域、结合剂、捕获剂、目标分析物、基质中的一种或多种或其相互作用引起的干扰。因此，本发明旨在提供一种检测低水平目标分析物以及传感器内和传感器之间的可再现响应的准确度更高的传感器。
本发明还涉及一种提高检测样本中目标分析物的准确度的方法(例如参见图25)，该方法包括提供传感器的步骤，该传感器包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
e.将所述结合剂与含有目标分析物的样本接触；
f.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
g.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中目标分析物与结合剂的结合产生电活性物质，该电活性物质介导传感表面处的可检测响应，并提高检测样本中目标分析物的准确性(例如与电化学检测相比)。
优选地，所述结合层和结合剂在磁性粒子上，所述磁性粒子通过磁场附着到所述传感器表面。
该方法还具有通过磁场的去激活和再激活来分离和替换磁性粒子的能力。
磁场优选由直接或间接连接到传感器的磁性元件(作为永磁体或电磁体)建立。
优选地，所述磁性元件是永磁体，例如由钕铁硼、钐钴、铝镍钴和陶瓷或铁氧体形成的永磁体。
优选地，磁性元件被定位(因此可以被称为“磁性定位元件”，尽管参考文献可以被同义读取)，以将磁性粒子捕获为结合区域表面上的单层膜。
该方法还可以包括：
a.用第一结合剂附着第一组磁性粒子；
b.执行检测样本中目标分析物与所述第一结合剂结合的方法；
c.去激活所述磁场以去除所述第一组磁性粒子；
d.用第二结合剂附着第二组磁性粒子；以及
e.执行检测样本中目标分析物与所述第二结合剂结合的方法。
该方法也可以用第三组或另一组磁性粒子重复，用于检测相同或不同的目标分析物。
表面结构优选为锥体、金字塔或脊形或其组合。
传感器表面和结合层/区域之间的分隔距离优选为在大约30nm和5mm之间、在大约100nm和5000μm之间、在大约1μm和1000μm之间或者在大约20μm和100μm之间。所述分隔距离也可以在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
图1示出了现有技术的设计，并描述了利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺电化学测量的生物传感器的典型设计。电极表面用自组装单层膜层进行功能化(图1A)，自组装单层膜层包含捕获剂(X)可以附着的官能团(图1B)。目标物质和标记目标竞争以与捕获剂结合(图1C)，之后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺并电化学测定TMBox(图1D)。这种方法的问题涉及电极表面必须同时结合捕获剂和进行测量的矛盾。本发明通过将结合与测量分开解决了这一问题。
图2描述了本发明的四个可能的实施例，每个实施例包括支撑基底电极层和结合剂(X)可以附着到其上的结合层。这些实施例包括：
A-其包括通过在电极表面上沉积结合层形成的隔离传感表面，并形成孔以暴露电极层1的传感表面2。在该实施例中，每个传感表面由裸露的电极层的表面积限定。
B和C-在这些实施例中，结合层用高点或顶点6界定存在于表面结构4上的传感表面。在这些特定实施例中，表面结构具有凸形或三角形横截面。在三维实施例中，表面结构可以作为半球(B)或锥体(C)存在，或者可以是具有半圆形或三角形横截面的脊形。图2D具有与图2C相似的表面拓扑结构，但是电极层1沉积在支撑基底8上，以产生薄得多的电极层。薄电极层具有包括电极材料较少的优点，电极材料可能很昂贵(例如金或铂)。
图3示出了图2所示每种结构的平面图，并将电极显示为4x4阵列。可选实施例(图3中未示出)包括使用具有如图2A、图B或图C所示横截面轮廓的脊或通道。
本发明提供一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离。
在另一方面，本发明提供了一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂接触包含所述目标分析物的所述样本；并且其中所述传感器适于在所述目标分析物与附着于所述结合层的结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
本发明还优选提供一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于静电、共价或磁性地附着至少一种结合剂；
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
优选地，结合区域包括吸引和附着磁性粒子的磁场，该磁性粒子包括附着有结合剂的结合层。
在使用中，上述传感器的支撑基底具有通过磁场附着到其上的磁性粒子。磁场将传感器的一个区域定义为结合区域。结合区域是溶液中的目标分析物和附着在磁性粒子上结合层上的功能表面上的结合剂之间发生结合的地方。
尽管不是必须的，但是本发明的传感器可以容纳在微流体环境中。在这种环境下，样本溶液可以以可重复和均匀的方式通过结合区域和传感表面。优选具有层流特征。
本发明提供了一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供包括支撑基底的传感器；从支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中该表面结构包括电极层；电极层上的传感表面，其中传感表面适于接触样本；支撑基底上的结合区域，其中结合区域与传感表面分离；
b.将磁性粒子附着到所述结合区域，其中所述磁性粒子包括附着到所述磁性粒子上的结合层的至少一种结合剂；
c.将所述结合剂与含有目标分析物的样本接触；
d.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
e.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导所述可检测响应。
在一个实施例中，目标分析物与配体结合，该配体在暴露于电活性基底后产生电活性物质。这样，在配体共轭结合的目标分析物暴露于电活性基底之后，产生电活性物质。
在竞争性试验环境中，目标分析物和配体标记的目标分析物(例如，辣根过氧化物酶标记的)竞争以与结合剂相结合。当配体标记的目标分析物(例如辣根过氧化物酶)结合时，电活性物质(例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺)被配体(例如辣根过氧化物酶)氧化。传感表面上的可检测响应是由传感表面上电活性物质(例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺)的减少引起的。
图4示出了本发明的一个实施例，其中传感表面4紧邻结合区域/层2。
图5示出了本发明的一个实施例，其中结合区域/层2和传感表面4被间隙5隔离，并且以线性(图5A)或圆形(图5B)布置彼此相邻。
图6示出了用于检测对目标分析物与结合剂X的结合产生的响应的多个传感组(将在下面更深入地讨论)。
图7示出了本发明的一个特定实施例(将在下面更深入地描述)。在该实施例中，该方法包括：
a.将结合剂X(例如抗体或抗原)附着到传感器的结合层；
b.用配体(例如辣根过氧化物酶)标记目标分析物(TA)；
c.向包含未标记目标分析物的样本中加入固定量的标记目标分析物；
d.将样本施加到传感器上，从而在标记目标分析物和未标记目标分析物之间进行竞争性试验；
e.将电活性基底施加到所述传感器上，例如H2O2存在下的3,3',5,5'-四甲基联苯胺，使得所述电活性基底的一部分被所述结合的标记目标分析物氧化或还原；
f.测量对应于传感表面处电活性基底的氧化或还原的响应信号。
图8示出了在激活物质存在下将电活性基底(在该实施例中为3,3',5,5'-四甲基联苯胺加H2O2)引入传感器，该电活性基底穿过结合层，然后穿过传感表面。这将在下面再次详细讨论。
图9示出了预期从低TA浓度(Sample Conc.A)和高TA浓度(Sample Conc.B)下的多电极响应中获得的数据类型。其分别在对应于溶液中标记的目标分析物与结合剂结合后产生的电活性物质(这种情况下是TMBox)的量的点衰减。这将在下面再次详细讨论。
图10A和图10B示出了与图8相似的布置，尽管在这些实施例中，尖端阵列(传感表面突出于结合/惰性层之上的表面结构)用于实现多电极层传感器的更高灵敏度。这将在下面再次详细讨论。
在一个实施例中，要求结合层在磁性粒子上，该磁性粒子通过磁场附着到支撑基底(传感器表面)上的结合区域。在竞争性试验的任一实施例中，样本在结合区域与结合剂接触，标记目标分析物与未标记目标分析物为结合剂竞争。根据质量作用定律，结合的标记目标分析物的量是标记和未标记目标分析物总浓度的函数。随着未标记目标分析物浓度的增加，标记较少的目标分析物与结合剂结合，响应信号降低。施加电活性基底并测量响应。在与结合区域分离的传感表面处测量响应。因此，响应信号越低，样本中未标记的目标分析物就越多。这样，可以基于已知的标记目标分析物浓度和测量的响应信号来计算未标记目标分析物的浓度。
为了检测电活性物质，在测量电极和反电极之间施加电位。该电位可以是还原电位或氧化电位。在一个实施例中，电位在-100mV和-300mV之间。在一个实施例中，其中3,3',5,5'-四甲基联苯胺是电活性物质，电位在-100mV和-300mV之间。在一个实施例中，所述电位在-150mV与-1000mV之间、或-180mV与-450mV之间。在一个实施例中，所述电位在-350mV至-450mV或约-200mV、-300mV或-400mV。
在一个实施例中，在测量电极/电极层和反电极之间施加-400mV的电流。在该实施例中，当使用辣根过氧化物酶作为配体时，电流足以在样本(来自H2O)中产生过氧化物，该过氧化物促进电活性基底与配体标记的目标分析物的反应。使系统在一段时间内达到平衡，然后测量可检测响应。
辣根过氧化物酶(HRP)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为电活性基底的反应机理如下所示：
HRP
(1)TMB(red)+H202→TMB(ox)+2H20
TMB(ox)+2H++2e-→TMB(red)
因此，在辣根过氧化物酶和过氧化氢的存在下，发生了上述催化作用。该方程表明，该反应是产生电活性物质的电活性过程，允许在电极层的传感表面检测电化学信号，其中电子在测量电极处被转移和测量。
在上述涉及电化学响应测量的实施例中，该系统不限于通过辣根过氧化物酶还原和氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺，而是也适用于依赖氧化还原过程的任何电活性物质。
配体-基底对的其他示例包括例如HRP/醌、HRP/DAB、HRP/aec、HRP ABTS、HRP/高香草酸、HRP/OPD、HRP/AmplexRed或用于糖尿病监测的葡萄糖的葡萄糖氧化酶还原。
优选地，可检测响应包括电化学可检测响应，其包括电流、阻抗、电压、电容、阻抗、电阻或电导的变化。使用电极测量这种响应对于本领域技术人员来说是已知的。优选地，目标分析物与结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导所述可检测响应。这意味着电活性物质从结合位点(即结合剂接触目标分析物的位置)移动并接触传感表面，从而提供或接收电子以产生可检测响应。
支撑基底形成传感器的基部并支撑表面结构。优选地，所述支撑基底包括聚合物、硅或玻璃。当使用聚合物时，聚合物通常是非晶形的，但是可以是半结晶聚合物。优选使用可挤出的聚合物。合适形式的聚合物对本领域技术人员来说是已知的，包括例如聚碳酸酯和PMMA。其可以是柔性的或刚性的，优选是平面的。如本领域技术人员所知，支撑基底的厚度主要由确保适当操作所需的厚度决定。因此，优选地，支撑基底的厚度在约50μm至约5mm之间，或者在约500μm至约2mm之间，或者在约50μm至约100μm之间。
在一个实施例中，支撑基底是导电材料。在另一实施例中，支撑基底是非导电材料。当支撑基底层是非导电材料时，其也可以充当绝缘材料。用于本发明的合适的柔性材料的示例包括热塑性聚氨酯、橡胶、硅橡胶和柔性环氧树脂。用于本发明的合适的刚性基底材料的示例包括玻璃、PMMA、PC、PS、陶瓷、树脂、复合材料、负载聚合物和刚性环氧树脂。基底材料也可以由金属形成，例如金、银、镍等，将在下面更详细讨论。
表面结构可以在与支撑基底相接的地方彼此接合，或者可以彼此分开设置，使得支撑基底的基本平坦的上表面存在于每个表面结构的基部之间。
在一个实施例中，所述表面结构与支撑基底成一体。这意味着表面结构由与支撑基底相同的材料形成并从支撑基底突出。在该实施例中，支撑基底的上表面可以包括以有序或随机结构排列的表面结构阵列。在该实施例中，电极层可以形成在表面结构的上表面上(以及其暴露在上面的支撑基底)。具有集成表面结构的支撑基底可以通过已知方法形成，例如热压花、CFT处理、注射成型、冲压或光刻技术。
在替代实施例中，表面结构由不同于支撑基底的材料形成，并且沉积在支撑基底上或附着到支撑基底上。在该实施例中，表面结构可以集成到电极层。这意味着表面结构是电极层的一部分，并且由与电极层相同的材料形成。
或者，电极层可以沉积或以其他方式形成在表面结构上，并且所述表面结构沉积在支撑基底上、与支撑基底成一体或以其他方式形成在支撑基底上。具有由不同材料形成的表面结构的支撑基底可以通过已知方法形成，例如热压花、CFT处理、光致抗蚀剂激光处理、冲压或光刻技术。
电极层包括任何合适的导电材料。优选地，电极层包括选自导电金属、碳、玻璃碳、碳质材料、石墨烯、碳纳米管、导电油墨、负载聚合物、导电聚合物、金、银、镍、铂、氟掺杂氧化锡、氧化铟、掺杂硅、二氧化钛或层状结构的导电材料。优选地，所述导电金属包括金、银、镍或铂。优选地，所述层状结构包括含金的钛、含金的铬或含导电聚合物的金。
在一个实施例中，惰性层或结合层沉积在电极层上。
在一个实施例中，电极层沉积在表面结构上。在该实施例中，裸露的任何平坦支撑基底表面也将被电极层覆盖，受电极层边界的限制。优选地，所述电极层包括厚度基本恒定的层。当电极层沉积在表面结构的上表面上时，电极层的上表面拓扑结构将优选对应于下面的表面结构以及可选的支撑基底的拓扑结构。在图2D中可以看到表面拓扑结构的这种对应，其中电极层1沉积在支撑基底8上。
尽管电极层的厚度可以是任何合适的厚度，但是优选为约1nm至5μm厚，更优选为40至500nm或50至100nm厚。更优选地，约5nm至3nm、50nm至100nm厚、70nm至400nm厚、900nm至300nm厚。发明人发现，由于电荷导电性的问题，使用小于约15nm的层不太理想。此外，由于制作电极层的材料(通常为金)成本，厚度大于500nm的层具有经济劣势。
优选地，电极层包括一个或多个适于将电极层电连接到测量电极的端子连接装置。优选地，端子连接装置适于接合连接器，例如槽连接器。优选地，端子连接装置包括支撑基底的区域，该区域具有突出于支撑基底表面、结合层或惰性层之上的表面结构。
在一个实施例中，例如图12所示的传感器，电极层延伸到端子连接装置上。发明人发现，用于将传感器阵列连接到外部电路的便利机制包括：提供传感器的第一区域，其具有结合区域和具有相应表面结构的电极(如本文所述)；传感器的第二区域，其没有表面结构并且电极完全被惰性层例如SU8覆盖；以及第三区域，其具有表面结构，并且其中电极对应于连接器上的电极，并且允许进行电连接。优选地，第二区域包括仅暴露结合层或惰性层，电极层在结合层或惰性层下方通过。当传感器用于微流体环境中时，第二区域适于用连接密封件密封。优选地，第三区域包括结合层或惰性层的暴露，其中包括电极层的表面结构也暴露出来，有助于与外部电路的连接。发明人发现，传感器表面上区域的这种布置能够在微流体环境中实现非常好的密封，同时仍然能够有效地连接到传感器阵列。
本发明的传感器包括至少一个与结合区域或结合层分离的传感表面。优选地，所述结合区域与所述传感表面分开一个分隔距离，其中所述分隔距离足以允许在所述传感表面处检测所述可检测响应。
优选地，所述分隔距离在大约1nm和50mm之间。在特定实施例中，所述分隔距离在大约30nm和5mm之间、在大约100nm和5000μm之间、在大约1μm和1000μm之间或者在大约20μm和100μm之间。所述分隔距离可以在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
适用于传感器的分隔距离在某种程度上取决于电活性物质到达传感表面所需的时间。这一时间受到许多因素的影响，包括样本的粘度、样本在传感器上的流速或搅拌速率。
在一个实施例中，所述传感器适于在无流动环境中使用。在该实施例中，传感表面检测响应的能力取决于样本中电活性物质的扩散特性。这又取决于样本的性质(考虑基质效应)、电活性物质的浓度以及目标分析物的浓度和结合剂的密度。优选地，传感表面紧邻结合区域，如图4所示。优选地，无流动环境中的分隔距离在大约30nm和500μm之间，在大约1μm和200μm之间，或者在大约20μm和100μm之间。
在另一实施例中，传感器适用于流动环境。在该实施例中，样本流过传感器的上表面，使得电活性物质从结合位点到传感表面的速度加快。或者，流动环境可以包括搅动的样本，这有助于快速扩散到传感表面。优选地，传感表面紧邻结合区域，如图4所示。优选地，流动环境中的所述分隔距离在大约30nm和50cm之间。在特定实施例中，所述分隔距离在大约30nm和50mm之间、在大约100nm和5000μm之间、在大约1μm和2000μm之间或者在大约20μm和100μm之间。
在一个实施例中，传感表面包括电极层的裸露表面，其中传感表面的面积由惰性层或结合层的范围限定。例如，图2A示出了作为电极层1的裸露区域的传感表面。优选地，所述惰性层存在于所述表面结构之间。当惰性层存在于表面结构之间时，这意味着惰性层可以部分覆盖表面结构，使得电极层的一部分裸露为传感表面。
参考图2A、图2B、图2C，如本文进一步描述的，层2以惰性层开始，但是当被捕获剂官能化时，变成结合层，其全部范围是结合区域。
在替代实施例中，传感表面位于从支撑基底突出的表面结构的上表面上。例如，图2B示出了具有凸形横截面的表面结构4上的具有顶点6的传感表面(定义为表面结构的裸露的上部)，图2C示出了具有三角形横截面的表面结构4上的传感表面，该三角形横截面具有顶点6。
优选地，表面结构包括由结合层或惰性层限定的传感表面。优选地，每个表面结构包括单个传感表面。优选地，传感表面通过结合层或惰性层与其他传感表面分开。优选地，表面结构突出穿过结合层或惰性层。发明人发现，本发明包括在结合层或惰性层上方延伸的表面结构的一个优点是，与同结合层或惰性层的上表面齐平或低于结合层或惰性层的上表面的传感表面相比，传感表面处的电活性物质的检测得到增强。这种增强是本发明优选方面的有益特征。
图11示出了相对于Ag/AgCl参比电极，亚铁氰化物(0.1mol)在磷酸盐缓冲液中时，平面电极(A)和尖端电极(B)的独立(A和B)和重叠(C)循环伏安图。所示的循环伏安曲线考虑了电极的相对面积，并显示了信号的急剧增加，以及7μm尖端阵列相对于平面电极的信噪比。尖端是金字塔形，基部为7μm x 7μm，高度约为5μm。插图A显示的响应范围约为2μAcm-2。相比之下，插图B显示，相同表面积的响应范围大了近8000倍，为-16000μAcm-2。这种效应发生在微电极中，因为球形扩散朝向尖端，而不是平面电极所采取的平面扩散(同时参考图26和27)。
优选地，表面结构彼此间隔开约50nm至约2000μm；约50nm至约1000μm；约100nm至约1000μm；约250nm至约1000μm；约5nm至约750μm；约5nm至约500μm；约5nm到约100μm，此为顶点到顶点的距离。优选地，分隔距离是均匀的。
优选地，本发明的任何实施例的表面结构在与支撑基底连接的部位的宽度在大约20nm到大约5000μm之间。更优选地，约40nm至约4000μm；约55nm至约3000μm；约75nm至约2500μm；约100nm到约4000μm；约250nm至约3500μm；约20nm至约3500μm；约2nm至约4000μm；约20nm至约2500μm；约20nm到约4000μm；约20nm到约3000μm；约20到约2000μm。
优选地，每个表面结构的顶点宽度优选在约1nm至约5000μm之间，更优选在约10nm至约10μm之间，或约20nm至约2μm，或约30nm至约1μm之间。每个表面结构顶点的宽度小于其连接支撑基底的部位的宽度，例如对于宽度约为1nm的顶点，其连接支撑基底的部位的宽度可以大于约20nm。
传感表面适于接触样本。这意味着当使用传感器时，传感表面不受阻碍(其限制可检测响应的检测)地暴露于样本。优选地，所述传感表面在所述电极层的上表面上。传感表面是接收电子或向电活性物质提供电子从而产生可检测响应的表面。优选地，所述传感器包括多个表面结构，每个表面结构具有传感表面。多个传感表面相互连接并连接到测量电极，以测量由目标分析物与结合剂的结合引起的可检测响应。在一些实施例中，连接的传感表面将形成传感组，并且可以有一个、两个或多个传感组。每个传感组的传感表面可以聚集在传感器的特定区域中，或者可以与来自其他传感组的其他传感表面散布在一起。传感组彼此电隔离，并且可以独立于其他传感组来测量每个传感组处的可检测响应。传感组的这种布置使得传感器能够提供检测不同目标分析物或连接到不同结合剂的控制组、内部复制和传感组。可以通过分解电极层来形成多个电极层或传感组。这可以根据本领域技术人员已知的任何方法来实现，可以包括光刻蚀刻、激光或阴影掩膜。
图12A示出了适于检测彼此电隔离的三个电极层123上的三种不同目标分析物的传感器。通道124被限定为允许样本在图12B和12C所示的传感表面上从入口121流到出口122。图12B和12C分别是单个阵列(传感组)和单个传感表面的扫描电子显微镜图像。
在一个实施例中，结合区域在与传感表面不同的平面上。在该实施例中，支撑基底将具有平面结构，例如通道，传感表面在通道的一侧，结合区域在通道的底部。这种结构旨在落入本发明的范围内，并且本文描述的其他实施例可以适于实现传感器的任何形式的平面结构。
在另一实施例中，结合区域位于传感器的单独隔室中，或者位于与传感表面不同的位置、方向或水平，使得两者相隔如本文所述的分隔距离。优选地，结合区域和传感表面在微流体或流体通道内，并且适于通过微流体或流体通道连接。这些部件的连接使得结合后产生的电活性物质扩散或以其他方式传输(例如通过泵送)到传感表面，以产生可检测响应。
在一个实施例中，所述方法包括沉积两个或多个离散的电极层以形成两个或多个传感组。在传感器的生产过程中，电极层通过使用掩模工艺分离，例如在电极层溅射到支撑基底/表面结构上的过程中使用荫罩。荫罩防止导电电极层沉积在限定的区域中，从而确保电极层彼此电隔离。这在图12A的示例中示出。
在一个实施例中，所述电极层用隔离材料或间隙与所述结合区域或至少一个其他电极层电隔离。
间隙的宽度范围可以从相邻(纳米距离)到大约50cm，并且可以通过管道连接。
在一种结构中，溶液从磁珠捕获器到电磁阀，然后到达测量电极。因此，磁珠收集器和电磁阀之间有管道，其返回到传感器，该管道可以是大约20-50cm。在另一结构中，磁珠捕获器通过更短(约2-5cm)的微流体通道连接到测量电极。
隔离材料可以是惰性材料，但是也可以由位于电极层和结合层之间的管道形成。
优选地，所述表面结构包括位于所述表面结构顶部的顶点。顶点可以位于任何形式的具有高点的表面结构上。顶点允许电活性物质快速扩散到表面结构上的传感表面。
在一些实施例中，所述顶点位于表面结构上，该表面结构具有带波形表面的上部和带不同波形表面的至少一个下部。上部是指表面结构延伸到结合层或惰性层上表面上方的部分。在一些实施例中，表面结构或其上部是圆顶形、锥形、金字塔形、乳头状、脊形、多面体形或扁平的。
优选地，所述表面结构沿着垂直于所述支撑基底顶面的平面的横截面是三角形、凸半圆形或乳头状。
优选地，所述表面结构沿着平行于所述支撑基底顶面的平面的横截面基本上呈三角形、基本上呈圆形或基本上呈正方形。
优选地，所述表面结构的横截面积沿着垂直于所述支撑基底顶面的轴线减小。
最优选地，表面结构是锥形、金字塔形或脊形或其组合。
优选地，表面结构包括具有凸起表面的上部。优选地，所述上部的表面逐渐变细至顶点(例如像铅笔)或变圆至顶点(例如圆顶)。优选地，上部的横截面是三角形、正方形、凸半圆形、乳头状或扁平的。
在一个实施例中，所述表面结构均匀布置在所述支撑基底上。在另一实施例中，表面结构随机布置在支撑基底上。
在另一实施例中，表面结构包括光滑表面。使用光滑表面结构意味着传感表面遵循表面结构的轮廓，从而能够从传感表面进行可再现的测量。此外，当结合层、自组装单层膜、惰性层或保护涂层附着到传感表面时，所述层、自组装单层膜或涂层的厚度将基本恒定。此外，表面结构优选为规则形状。优选地，多个表面结构在形状和表面积上基本相同。由于具有重复形状和表面积的规则表面结构，能够在同一阵列上的传感表面以及阵列之间进行重复测量。
组成传感器的表面结构(以及传感表面)的数量将取决于应用。在一个实施例中，传感器包括至少一个表面结构。在一些实施例中，采用多个表面结构，每个表面结构具有传感表面以形成传感器阵列。所述阵列的范围可以从2x2阵列到数十亿x数十亿的阵列，到1x数十亿的阵列或任何其他表面结构排列。优选地，传感器包括具有大于100、大于10000或大于1000000个表面结构的阵列。
每个传感表面的大小可以通过其表面积来测量。优选地，该面积在1nm2和10mm2之间。在一个实施例中，每个传感表面的面积在大约30nm2和50μm2之间或者在大约50nm2和10μm2之间。当表面结构包括脊时，脊的长度优选地在大约100nm和1cm之间。单个尖端的优选面积在大约1μm到大约20μm之间，因为已经发现这个范围很容易实现。优选尖端总面积为1mm-3mm，因为从实际角度来看，这在nA范围内相对容易测量。
优选地，所述表面结构通过热压花、CFT加工、注射成型、激光诱导交联、滚压成型、冲压或平版印刷技术形成在所述支撑基底上。
优选地，所述表面结构形成有位于所述表面结构顶部的顶点。表面结构的其他实施例在第一方面中定义，并且与第二方面相关。
优选地，所述传感表面包括保护涂层。在替代实施例中，结合层或惰性层是保护涂层。保护涂层的作用是最大限度地减少或防止结合剂和样本组分与其保护的表面的非特异性结合。优选地，保护涂层包括自组装单层膜、乙醇胺或蛋白质层，例如BSA或OVA。保护涂层优选在结合剂施加到传感器之前施加到传感器上。然后优选在检测电活性基底之前去除保护涂层。这确保了保护涂层对传感表面响应检测的任何干扰最小化。保护涂层还将样本(如血液、牛奶等)施加到传感表面时产生的蛋白质结合和基质效应降至最低。
自组装单层膜的应用方法对本领域技术人员来说是已知的在一个实施例中，通过将自组装单层膜溶解在乙醇中，然后将自组装单层膜/乙醇混合物施加到传感器表面一段时间，例如10分钟至1小时，来施加自组装单层膜。然后多余的被洗掉。然后，通过施加相对于Ag/AgCl为-400mV的还原电位，可以将自组装单层膜从传感表面移除。如果保护涂层是蛋白质，如抗生物素蛋白或BSA甚或是抗体捕获剂，在测量前可能不会被去除，但不会妨碍电测量。
在一个实施例中，在施加结合剂之前，将保护涂层施加到传感表面。优选地，所述保护涂层是由烷硫醇(HS(CH2)XCH3)制成并由乙醇溶液沉积的自组装单层膜，其中X＝0至16(X＝0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16，以烷烃、烯烃、炔烃、芳烃形式及其组合)。优选地，保护涂层的去除在电活性物质(例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺)的最终测量之前进行。
在另一实施例中，保护涂层被用作结合层，以最小化或防止结合剂和样本组分与电极层的非特异性结合。在该实施例中，尖端集中电荷密度(电流或电压)的功能被用来在进行传感分析之前使传感表面去保护。
优选地，通过相对于银/氯化银参比电极施加-200mV至-1V，优选-400mV的还原电位来去除保护涂层。施加-400mV还产生H2O2，其优选再生配体催化剂(例如辣根过氧化物酶)。
在本发明的一个实施例中，发明人发现通过将结合剂(包括捕获剂)附着到磁性粒子上，结合剂可以有效地附着到结合区域上。磁性粒子通过磁场被吸引到结合区域的表面，并且当磁场活跃时，粒子被“附着”到结合区域。一旦磁场被去除或失活，粒子就从结合区域表面“分离”，并在清洗液中被去除。在该实施例中，结合剂基本上包括两种或多种试剂，第一部分与结合层相互作用以附着到结合层，第二部分或另一部分(捕获剂)在附着到结合剂的第一部分时与样本中的目标分析物相互作用。
在本发明的这个实施例中，结合层附着在磁性粒子的表面上，而不是结合区域本身的表面上。结合层的特征以及可能附着于其上的结合剂和捕获剂在其他方面与本文所述的相同。发明人已经证明传感表面和表面结构在检测目标分析物与结合/捕获剂结合后的可检测响应方面是有效的。
由于结合区域适应磁性粒子，消除了在传感器生产期间将结合/捕获剂附着到结合层/区域的需要。这具有显著的优点，例如降低了材料成本。通过快速将不同的结合/捕获剂附着到传感器上以及从传感器分离的能力，在同一传感器上和同一传感器系统或微流体设备内可以很容易地测试多个目标分析物。
在一个实施例中，本发明提供了一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.用第一结合剂将第一组磁性粒子附着到结合区域；
b.执行检测样本中目标分析物与所述第一结合剂结合的方法，包括激活第一磁场；
c.去激活第一磁场以去除所述第一组磁性粒子；
d.通过激活第二磁场，用第二结合剂将第二组磁性粒子附着到结合区域；以及
e.执行检测样本中目标分析物与所述第二结合剂结合的方法。
检测目标分析物结合的方法如前所述，但优选包括：提供包括支撑基底的传感器；从支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中该表面结构包括电极层；电极层上的传感表面，其中传感表面适于接触样本；支撑基底上的结合区域，其中结合区域与传感表面分离并且包括磁场；将一个或多个磁性粒子附着到结合区域，其中所述一个或多个磁性粒子包括至少一种附着到所述一个或多个磁性粒子上的结合层的结合剂；
将结合剂与含有目标分析物的样本接触；允许目标分析物与结合剂结合，以在传感表面产生可检测响应；测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；其中目标分析物与结合剂的结合产生电活性物质，该物质介导传感表面处的可检测响应。
第一组磁性粒子上可以具有适于检测样本中特定目标分析物的结合剂/捕获剂。第二组可以在其上具有适于检测样本中相同或另一目标分析物的结合剂/捕获剂。还设想了连接和分离的其他设置和步骤。通过激活/去激活磁场来连接和分离的方便方法使得相同的通用传感器能够用于多种检测分析。
图23和24示出了磁性粒子附着的示例。图23中磁性元件直接位于传感器表面下方。在这种结构中，预计磁性粒子将驻留在相邻的表面结构之间。粒子的深度将取决于表面结构和粒子的相对尺寸。
从图23中可以看出，使用磁场将粒子附着到传感器的表面上，使得在传感器表面上形成一个基本恒定深度的层，阵列的表面结构突出到该层中。在一些实施例中，表面结构突出于粒子层之上。在其他实施例中，表面结构突出到粒子层中。在这两个实施例中，表面结构在检测样本中的目标分析物与附着于磁性粒子的结合剂结合后引发的可检测响应方面是有效的。
图24中磁性元件与传感表面分离。优选地，图24中描绘的结构在微流体环境中，并且传感表面在与磁性元件的结合的区域的下游。
在替代实施例中，表面结构及其各自的传感表面远离目标分析物与结合剂结合的结合区域。优选地，传感表面与结合区域分开一段分隔距离，如本文所述。在一个实施例中，传感表面在隔室的一个表面上，结合区域在同一隔室的相对或相邻表面上。这些表面可以在相同的平面或不同的平面上，或者处于不同的方向。
如实施例10和图30中所讨论的，另一个实施例是在如图24所示的第一捕获位点捕获磁珠，并清洗磁珠。然后释放磁珠，并在传感器下方的第二个磁性区域将其捕获，如图23所示，在该区域进行传感。
磁场由传感器支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立。对于本发明的该实施例，结合区域被定义为磁性粒子被吸引并“附着”到传感器表面的区域。
磁性元件可以是产生磁场并吸引磁性粒子的任何合适的元件。例如，磁性元件可以是亚铁磁体或电磁体。
适用于本发明的磁性粒子对本领域技术人员来说是已知的，包括Dynabeads磁珠(英杰公司/赛默飞世尔科技公司)、色球、Bioclone磁珠和相关文献。这种粒子可以是顺磁性的或铁磁的，并且在其表面上具有结合层。该结合层在本文中也被称为功能表面。如下所述，结合层适于结合一种或多种结合剂。
为了建立磁场，磁性元件靠近基底的表面定位，优选在微流体环境中，磁性元件足够靠近通道，以使流动路径内的任何磁性粒子附着到结合区域的上表面。在一些实施例中，磁性元件定位装置保持在传感器的下表面，以实现磁性元件和合成场的精确定位(如图23所示)。因此，在一些实施例中，本发明的传感器包括磁性元件定位装置。优选地，所述磁性定位装置是磁体。优选地，所述磁体是永磁体，例如由钕铁硼、钐钴、铝镍钴和陶瓷或铁氧体形成的永磁体。优选地，所述磁体是电磁体。优选地，磁性定位装置以这样的方式定位，使得磁场的影响最大化，从而将粒子捕获为结合区域表面上的单层膜。
如本文所述，结合层是磁性粒子上的层。本领域技术人员将理解，术语“在支撑基底上方或上部”并不意味着磁性粒子直接附着在支撑基底上。层、磁性粒子或传感表面可以间接位于具有一个或多个中间层(例如电极层)的支撑基底上。也可以在微流体设备的封装层上。在使用中，结合剂与特定的目标分析物结合以产生可检测响应。
在本发明的其他实施例中(如图2A至2C所示)，结合层2沉积在电极层的上表面上。在图2D所示的另一实施例中，表面结构4的上部裸露以形成传感表面4a。结合层2沉积在支撑基底8上的电极层1上。在图5A和5B所示的替代实施例中，结合层沉积在支撑基底(未示出)的上表面上。在这些实施例中，结合层不与电极层3接触。相反，它与电极层3相邻，可选地在它们之间具有隔离材料或间隙5。在类似发明的这些实施例中，结合层具有与磁性粒子上的结合层相似的目的，如图23和24所示的实施例所示。
在一个实施例中，结合层或惰性层沉积在表面结构周围，使得表面结构表面的上部裸露为传感表面(在表面结构的顶点周围)。在一个实施例中，结合层或惰性层的范围限定了孔，传感表面通过该孔暴露于样本。在使用具有大致锥形结构的表面结构的情况下，结合层的厚度和锥形的角度决定了传感表面暴露于样本的面积。例如，图2B、2C、2D、4和6D示出了结合层或惰性层2覆盖从支撑基底或电极层1突出的表面结构4的一部分。本发明的这一特征使得非常小的传感表面能够被限定为仅表面结构的上部裸露为传感表面。表面结构4优选具有顶点6。发明人发现，使用非常小的传感表面增加了传感器对在传感表面处检测到的响应变化的灵敏度，如图11所示，并且如前面关于该图所述。已经发现，电极的小尺寸(小于约30μm；优选5μm至30μm、10μm至30μm、15μm至25μm、5μm至25μm)导致微电极行为，随着尺寸的减小，微电极行为提供越来越快的扩散速度和更大的信噪比。
优选地，所述结合层包括与结合剂相结合的材料。优选地，结合层包括交联聚合物、光致抗蚀剂或自组装单层膜。优选地，交联聚合物是环氧基负性光致抗蚀剂，例如SU-8。其他合适的结合层材料对于本领域技术人员来说是已知的，例如可选的正性和负性光致抗蚀剂和包括选自叠氮化物、胺、羧酸盐、醛、酮、酯或羧酸或其混合物的末端分子的自组装单层膜。这种分子存在于所述自组装单层膜的末端。结合层可以是多层，但是优选地，结合层包括前述材料的单层。同样重要的是，结合剂与结合层的附着要牢固，并且不能通过洗涤或暴露于样本而被去除。优选地，附着是共价的，但也可以是静电的。
结合层可以沉积有用于有效结合特定结合剂的预涂层。例如，预涂层可以包括蛋白A、G或A/G、蛋白L、二级抗体、中性抗生物素蛋白或链霉亲和素、生物素、生物素结合蛋白Ni2+或谷胱甘肽、马来酸酐、马来酰亚胺或抗谷胱甘肽转移酶。不受现有知识或理论束缚的前提下，预涂层可以包括蛋白A、G或A/G，用于通过抗体的Fc区结合抗体。蛋白L通过k轻链结合Fab抗体片段和单链可变片段。用于结合抗体的二级抗体，作为结合生物素化蛋白、肽或核酸的蛋白A、G或L中性抗生物素蛋白或链霉亲和素的替代物。生物素用于结合抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。生物素结合蛋白Ni2+或谷胱甘肽，用于结合重组表达的含有多组氨酸或谷胱甘肽硫转移酶的蛋白质。马来酸酐用于结合大的或小的含胺分子。马来酰亚胺用于结合含巯基的分子或抗谷胱甘肽转移酶，以捕获表达谷胱甘肽硫转移酶的蛋白质。
优选地，结合层厚度为约0.1μm至约1μm，更优选地为0.2至0.4μm。该厚度也可以在约0.2μm至约0.8μm、约0.4μm至约0.7μm、约0.3μm至约0.9μm、约0.1μm至约0.6μm之间。
结合区域是支撑基底上目标分析物与结合剂结合的区域。在一些实施例中，结合区域的范围由用于将磁性粒子吸引和附着到支撑基底的磁场的范围来限定。在需要附着磁性粒子的实施例中，所述结合区域包括所述支撑基底的适于附着一个或多个磁性粒子的区域。优选地，结合区域由支撑基底之上、之下或之内的磁性元件建立的磁场区域限定。或者，磁性粒子可以附着到支撑基底上的惰性层。惰性层优选是光致抗蚀剂或自组装单层膜。结合区域也可以由磁性元件定位装置限定，该磁性元件定位装置旨在接收磁性元件，或者保持用于将磁场引导或聚焦到特定区域(即结合区域)的部件。优选地，所述磁性定位装置是磁体。优选地，所述磁体是永磁体，例如由钕铁硼、钐钴、铝镍钴和陶瓷或铁氧体形成的永磁体。优选地，所述磁体是电磁体。优选地，所述磁体放置成使得磁场的影响最大化，以确保将所有磁珠捕获为表面上的单层。
在本发明中，结合区域与传感表面分开一段分隔距离。分隔距离被限制在一定的距离，该距离仍然能够使传感表面感测在目标分析物与结合剂结合之后产生的电活性物质(例如3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。本发明的这一方面是提供一种传感器的关键，该传感器减少了由结合剂结合到结合区域或目标分析物结合到结合剂引起的检测干扰。
优选地，所述分隔距离使得可以在所述传感表面处检测所述可检测响应，而不会被所述结合层或结合剂削弱。
优选地，所述分隔距离在大约1nm和50mm之间。在特定实施例中，所述分隔距离在大约30nm和5mm之间、在大约100nm和5000μm之间、在大约1μm和1000μm之间或者在大约20μm和100μm之间。所述分隔距离可以在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
优选地，所述结合区域对施加到所述传感器上的所述样本的成分是惰性的。
合适的结合剂通常包括对特定抗体(目标分析物)特异的抗原。然而，本领域技术人员已知存在替代的结合剂，例如抗体、适体或反义、抗体片段、单链可变片段、生物素化蛋白质、肽、核酸(ssDNA、RNA、mRNA、miRNA)、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、含有多组氨酸或谷胱甘肽硫转移酶的重组表达蛋白质、含胺大分子或小分子、含巯基分子或表达谷胱甘肽硫转移酶的蛋白质。
优选地，在结合剂沉积之后，将封闭剂施加到传感器上。封闭剂的作用是最小化或防止样本组分在结合层的其它部分，或结合区域或结合层或电极层的任何未反应区域上的非特异性结合。优选地，封闭剂是乙醇胺或蛋白质，如BSA或OVA。
优选地，保护涂层被施加到传感器。优选地，由于电位被施加到结合层或电极层，保护涂层优先结合到电极层或结合层。所述保护涂层可以是任何涂层，但是在特定实施例中，由自组装单层膜组成。在该实施例中，自组装单层膜中的硫醇基团结合到表面上，而不结合(或结合程度较低)到不希望的区域，例如那些没有施加电位的区域。
图13显示了封闭剂(乙醇胺)对不同结合层上配体吸收的影响。在该实施例中，在反应离子蚀刻之后，结合层是A-金、B-SU8和C-SU8。显然，封闭剂在减少配体被各种表面吸收这一方面具有显著的效果。
结合剂在结合层(例如磁性粒子上的功能表面)上的应用，以及应用的位置是根据已知的工艺来控制的。例如，应用可以由自动控制系统控制或微流体定义。在另一实施例中，可以通过用结合剂洗涤/浸没粒子来制备粒子。在一些实施例中，传感器可以与其他传感器一起定位在支撑基底上，以产生微电极阵列。
结合剂根据已知的方案(例如，Blagoi等人2008年概述的内容，读者可以参考和支持)与结合层上的功能表面结合。优选地，结合剂通过静电连接或共价键合连接到结合层上。在一个实施例中，结合层包括SU8，SU8具有与蛋白质捕获剂上的胺结合的侧环氧基。
优选地，所述结合剂还包括捕获剂。在该实施例中，结合剂基本上包括两种或多种试剂，第一部分与结合层相互作用以附着到结合层，第二部分或另一部分(捕获剂)在附着到结合剂的第一部分时与样本中的目标分析物相互作用。当本文提到结合剂时，本领域技术人员将理解，这种结合剂可以由多个部分组成，术语“结合剂”旨在包括这些多个部分或额外的捕获剂，其可以在不同的步骤中应用以组成结合剂。
在一个实施例中，结合剂包括生物素结合蛋白，例如抗生物素蛋白。在该实施例中，捕获剂包括适体。在另一实施例中，结合剂包括适于结合样本中存在的抗原以产生电活性物质的抗体。
在一个实施例中，传感器的结合区域与电极上的传感表面隔离。图5示出了本发明的一个实施例，其中结合层2和传感表面被隔离(在5处)，并且以线性(图5A)或圆形(图5B)布置彼此相邻。
本发明的传感器可以设置在无流动环境中，例如在开放容器中。由于传感表面接近结合区域，确保了结合产生的足够的电活性物质引发可检测响应。
然而，在一些实施例中，优选在流动环境中使用传感器。
例如，如果传感器用于流体/微流体环境，其中通道引导样本的流动。在流动环境中，电活性基底快速到达传感表面，以确保检测到最大的可检测响应。图5示出了在箭头指示流动方向的流动环境中的本发明的实施例。在该实施例中，电极上的传感表面通过间隙5或诸如光致抗蚀剂或自组装单层膜层的隔离材料与结合区域隔离，优选具有增加在传感表面检测到的电活性物质的数量的流动。
本发明的传感器将优选设置在电解质溶液中。优选地，本发明任何实施例的溶液包括电解质。优选地，溶液是水，但是也可以是有机溶剂，例如醇、醚、丙酮和DMSO。优选地，电解质包括通常在生物学中使用的缓冲液，包括非缓冲盐溶液，例如NaCl，或者酸和碱溶液H2SO4、HNO3、NaOH。优选地，本发明任何实施例的溶液选自淡水、海水、血液、尿液、牛奶或唾液。在一个实施例中，本发明任何实施例的解决方案还包括参比电极。
在一个实施例中，溶液还包括参比电极。参比电极有助于在电流流动时测量和控制电压，例如在传感过程中。参比电极的性质和位置对于本领域技术人员来说是已知的。
优选地，电极阵列及其使用方法还包括与溶液接触的参比电极。优选地，参比电极包括由Ag/AgCl、SHE、NHE、RHE、SCE形成的电极。
将传感表面与结合区域隔离的概念的延伸如图6所示。在这些实施例中，使用多个传感组(例如电极1、2、3)来检测来自结合层2上的目标分析物与结合剂X的结合的响应。
结合层2可以通过本领域技术人员已知的方法生产，并在上面进行了更详细的描述。虽然表面结构(图6C和6D)显示为具有三角形横截面，但是应当理解，其他形状和形式(如上所述)也是有效的。
图6D示出了表面结构的传感表面4之间的结合层7，其将传感表面彼此隔离并限定传感表面。在施加结合剂的过程中，该层被封闭剂如乙醇胺遮蔽或封闭，使其不会成为结合区域。实际上，结合层的这一部分可以被认为是惰性层，以防止目标分析物或其他样本组分的非特异性结合。图6D所示的惰性层与图2C所示的结合层的不同之处在于尖端之间的惰性材料没有被结合剂官能化。
优选地，惰性层由与结合层相同的材料制成。然而，在另一实施例中，惰性层由不同于结合层的材料制成。
当磁性粒子附着在传感器表面时，该表面对于包括待检测分析物的样本流体成分理想地是惰性的。这意味着它对样本流体的典型成分基本无反应。
如果电响应惰性层或保护涂层也被施加到表面结构上的传感表面，则可以施加电位以在感测之前选择性地对传感表面去保护。
发明人发现，具有多个全部电连接以形成微电极阵列的传感表面能够检测到更大的信号响应。此外，发明人发现最小化传感表面的表面积增加了每个传感表面的灵敏度。这意味着传感表面的信噪比随着传感表面面积的减小而增大(例如，参见图11)。电噪声存在于任何电路中，并且在非常小的电流下变得更加明显。因此，最小化噪声和最大化信噪比非常重要。
因此，发明人发现，比起具有相同标称总面积，但通过添加结合层将表面结构的上部限定为传感表面(如图11所示)而减小为大约7μm(平面图直径)传感表面尖端阵列的传感表面，平坦电极的灵敏度只有其大约1/8000。当电极变得小于约30μm(如前所述)时，微电极行为开始在电极中发生，并且尖端在小于10μm(1μm至10μm；1μm至8μm；3μm至7μm；或1 2 3 45 6 7 8 9 10μm)的顶点变得尖锐。
在使用中，传感器包括电连接到一个或多个传感表面或传感组的测量电极。优选地，所述测量电极连接到测量装置，所述测量装置测量电流、阻抗、电压、电容、电阻、电导、磁通量或电场中的一个或多个的变化。合适的测量装置对于本领域的技术人员来说是已知的，作为示例，测量电极包括Ivium Compactstat或Palmsens MultiEmStat。在一些实施例中，测量电极用于用保护涂层或惰性层保护或去保护传感表面。该实施例用于最小化反应组分与传感表面的非特异性结合，并提供传感表面的特异性保护或去保护。
在一个实施例中，电极电连接到磁性元件。该电极将具有与测量电极相同的功能，并且可以用于将磁性粒子附着到结合区域或从结合区域分离磁性粒子。
测量电极通常被配置成也向电极层施加正或负电位。这可以促进电活性物质的保护、去保护或与电活性物质间的电荷转移。
优选地，传感器包括传感器系统的一部分。传感器系统包含合适的布线、电极和溶液，以使样本能够接触传感表面并检测可检测响应。传感器系统优选包括容器，以将样本保持在传感器表面上。传感器系统还优选地进一步包括参比电极和反电极，其被配置为在检测可检测响应期间接触样本。优选地，参比电极和/或反电极是固定的，并且离传感表面有固定的距离。合适的系统和配置对于本领域技术人员来说是已知的。
优选地，本发明任何实施例的反电极包括基本惰性的导电材料。在这种情况下，术语惰性是指在电流建立并由传感器传递到反电极之后，反电极的质量和状态基本不变。因此，“惰性”反电极相对于溶液的组分基本上是无反应的。优选地，反电极由选自金属、铂、金、碳、石墨、石墨烯、碳纤维、碳纳米管、巴基球、导电聚合物PPy、PA、聚乙炔的材料形成。反电极可以由固体层或沉积在合适的载体(例如聚合物玻璃、金属)上的导电层制成。优选地，第一方面的任何实施例的反电极相对于表面结构处于固定方位。
优选地，第一方面的任何实施例的反电极附接到传感器。
优选地，反电极保持在一个方向上，以最小化阵列的每个表面结构之间的距离差异。优选地，反电极位于阵列的上表面之上。在这些实施例中，从反电极到每个表面结构顶点的距离基本相等。这使得由反电极的放置引起的检测噪声最小化。
优选地，本发明任何实施例的反电极包括基本惰性的导电材料。在这种情况下，术语惰性是指在电流建立并由电极层传递到反电极之后，反电极的质量和状态基本不变。因此，“惰性”反电极相对于溶液的组分基本上是无反应的。优选地，反电极由选自金属、铂、金、镍、铜、铁、碳、石墨、石墨烯、碳纤维、碳纳米管、巴基球、导电聚合物PPy、PA、聚乙炔、不锈钢的材料形成。反电极可以由固体层或沉积在合适的载体(例如聚合物玻璃、金属)上的导电层制成。反电极可以由固体层或沉积在合适的载体(例如聚合物玻璃、金属)上的导电层制成。优选地，反电极是裸金属(例如金、铂、不锈钢和/或铜)，或者镀金或镀铂的基底(例如金属、聚合物和/或玻璃)。优选地，本发明任何实施例的反电极相对于表面结构处于固定方位。
优选地，本发明任何实施例的反电极附接到电极阵列。
优选地，反电极保持在一个方向上，以最小化阵列的每个表面结构之间的距离差异。优选地，反电极位于阵列的上表面之上。在这些实施例中，从反电极到每个表面结构顶点的距离基本相等。这使得由反电极的放置引起的检测噪声最小化。
图12A示出了一个实施例，其中参比电极显示在左侧，三个电极层(适于连接到测量电极)显示在中间，反电极显示在右侧。参考图12A：有5个金电极。外部2更宽，是反电极。内部3是测量电极，进行传感。每个测量电极在进行实际测量的通道内具有尖端阵列，然后在环氧树脂层下继续作为平面金，然后向上形成连接器的尖端。不同电极的间距与现成插头连接器内的电极一致。
在一些实施例中，传感器系统还包括如本文所述的磁性元件定位装置。
样本本身可以根据已知方法制备。尽管通常不需要对样本进行预处理，但是由于某些蛋白质或其他成分的存在，可能需要进行一定程度的预处理，以降低粘度或限制反应或对传感器表面的粘附。
通常向样本中加入缓冲液以确保得到恒定的酸碱度和导电溶液。
在另一方面，本发明提供一种如本文所述的生产传感器的方法。在一个实施例中，该方法包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于通过将磁性元件定位在所述支撑基底之上、之中或之下来将磁性粒子附着到所述支撑基底上，以便于建立能够吸引所述磁性粒子的磁场；
e.可选地将磁性粒子附着到所述结合区域；
f.可选地将结合剂附着到所述磁性粒子上的结合层上的功能表面上，
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
优选地，所述生产方法还包括将磁性元件和/或磁性元件定位装置附着到所述传感器。
使用传感器和生产传感器的方法中的另一步骤包括如上所述将磁性粒子暴露于结合剂。在一个实施例中，结合剂包括生物素结合蛋白，例如抗生物素蛋白。可选地，捕获剂被用作结合剂的一部分，其增强结合剂与目标分析物的结合。在一个实施例中，捕获剂包含适体或抗体。
一旦传感器暴露于样本，并且目标分析物已经结合到结合剂，将还原电位施加到传感器系统中的一个或多个电极。在特定实施例中，施加的还原电位在约-350mV至-450mV或约-200mV、-300mV或-400mV之间。这具有去除传感表面上的保护涂层和任选的结合区域的效果，从而使其失去保护，以提高对添加电活性基底后产生的电活性物质的灵敏度。因此，传感器在结合层上，而不是在传感表面上具有保护层。
优选地，自组装单层膜层沉积在传感器表面上。在一个实施例中，所述自组装单层膜结合层包括长链分子，所述长链分子包括C6或以上的碳链。优选地，所述自组装单层膜包括长链分子，所述长链分子包括C6至C24的碳链，其可以是烷烃、烯烃、炔烃或芳烃。优选地，C6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24或其混合物。
优选地，所述自组装单层膜包括短链分子，所述短链分子包括C5或以下的碳链。优选地，C1、2、3、4、5或其混合物。
优选地，所述自组装单层膜是包括长链(如上C6-C24)和短链(如上C1-C5)分子的混合自组装单层膜，其可以是烷烃、烯烃、炔烃或芳烃。
优选地，所述混合自组装单层膜包括长链分子和短链分子，长链分子包括C6至C24的碳链(如上所述)，短链分子包括C5至C1的碳链(如上所述)。
优选地，所述长链自组装单层膜包括选自叠氮化物、胺、羧酸盐、醛、酮、酯或羧酸或其混合物的分子。这种分子存在于所述自组装单层膜的末端。
优选地，所述短链自组装单层膜包括选自烷烃、叠氮化物、胺、羟基、羧化物或羧酸或其混合物的分子。这种分子存在于所述自组装单层膜的末端内。
在一个特定实施例中，所述自组装单层膜包括长链分子和短链分子的混合物，长链分子包括C6以上的羧酸分子，短链分子包括羟基分子。在上述实施例中，所述自组装单层膜长链分子优选选自C6至C24分子(如前所述)。在特定实施例中，自组装单层膜长链分子优选选自C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18或C20分子。长链自组装单层膜分子优选用于永久附着的自组装单层膜(即那些不会通过施加电荷去除的自组装单层膜)，因为当制备成单层时它们更稳定。
在另一实施例中，所述自组装单层膜层包括短链分子，所述短链分子包括C5或以下的碳链。优选地，所述短链自组装单层膜包括选自烷烃、叠氮化物、胺、羟基、羧化物或羧酸的分子或其组合。在短链自组装单层膜层会被去除的情况下，优选短链自组装单层膜，因为它们不太稳定。
在一个实施例中，自组装单层膜层包括长链和短链分子的混合物。优选地，所述混合自组装单层膜包括长链分子和短链分子，长链分子包括C6或以上的碳链，短链分子包括C5或以下的碳链。长链和短链自组装单层膜可以包括上述分子。在一个特定实施例中，所述自组装单层膜包括长链分子和短链分子的混合物，长链分子包括C6以上的羧酸分子，短链分子包括羟基分子。其他合适的自组装单层膜分子对本领域技术人员是已知的。发明人发现，在自组装单层膜中使用长链和短链分子的混合物在减少结合层上的非特异性结合方面提供了以前未认识到的益处。不受理论束缚的前提下，认为长链分子在表面上占更大的面积，因此应用短链分子允许长链分子之间的间隙被填充，从而保护表面。短链与长链分子的比例优选在2∶1至20∶1之间，更优选约为10∶1。或4:1至16:1、7:1至14:1、9:1至11:1。
优选地，自组装单层膜沉积为单层。
优选地，生成阵列的方法包括在电极层或支撑基底上沉积一层，例如前段所述的一层。优选地，沉积包括：
a.将长链自组装单层膜或混合自组装单层膜(如上所述的长链和短链)施加到所述电极层；
b.向所述电极层施加电荷，以选择性地从所述表面结构的上部移除所述自组装单层膜(长链或长链和短链混合物)；
c.将短链自组装单层膜(如上所述的)施加到所述电极层，使得所述短链自组装单层膜主要从b附着到所述表面结构的上部；
d.可选地，向所述结合层施加结合剂，其中所述结合剂优先结合所述长链自组装单层膜或或长链和短链混合自组装单层膜；以及
可选地，向所述电极层施加另一电荷，以选择性地从所述表面结构的上部去除所述短链自组装单层膜，并产生基本上不含自组装单层膜分子的传感表面。
优选地，所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
如本文所述，向电极层施加电荷将导致电荷密度集中在表面结构的尖端(或上部)(见图11)。从而选择性地从表面结构的上部移除自组装单层膜。施加附着到表面结构的裸露上部的短链自组装单层膜允许施加结合剂，同时最小化结合剂在表面结构顶端/上部与短链自组装单层膜的结合。将电荷施加到电极层的最后一步是从上部去保护或去除短链自组装单层膜，从而留下基本上不含自组装单层膜或结合剂的电极层表面(传感表面)。发明人发现，该过程提供了干净的传感表面，并且最大化了对结合在传感表面的结合表面上的电活性物质的检测。
在图22A所示的类似发明的一个实施例中，使用自组装单层膜作为支撑基底8上的电极层1上的结合层2来制备传感器。电极层表面(优选金)涂覆有混合的自组装单层膜结合层2，例如包括自组装单层膜-OH和自组装单层膜-COOH的结合层2(显示为s-OH；s-COOH)，其覆盖电极层的整个裸露表面。施加电流(如示例4所示)，以从表面结构4A的上部移除(图中未示出)混合的自组装单层膜，然后在图22B中，表面结构的裸露上部用短链自组装单层膜(s-OH)回填，例如烷烃自组装单层膜和结合剂(Y)。结合剂优先附着在表面结构基部周围结合层上混合自组装单层膜中的长链自组装单层膜分子上。在图22C中，短链(例如烷烃)自组装单层膜自传感表面(即表面结构的上部)移除。传感器生产后，可用于本文所述的试验。
传感器的校准通常通过将目标分析物传感器响应与一系列目标分析物标准进行比较来实现。该过程包括配制已知浓度的目标分析物储备溶液，并进行系列稀释，以给出一系列标准，这些标准涵盖样本中目标分析物的预期浓度。将样本目标分析物响应与标准进行比较，可以估算出样本中目标分析物的浓度。然而，这可能因多种因素而变得复杂，包括样本处理、稀释误差和/或样本基质(如牛奶、血液、海水)的干扰。在每次分析中，熟练的技术人员尽量将这些因素的影响降至最低，以确保观察到的响应是准确的，并且与标准的比较是浓度的真实反映。
发明人发现，可以通过使用两个或多个传感表面的配置来生产自校准传感器，所述传感表面逐渐远离目标分析物的结合位点。这种自校准使用了上述与测量目标分析物与结合剂结合所产生的响应相关的概念。
因此，在另一方面，本发明提供了一种传感器，包括：
a.支撑基底，可选地其上形成有表面结构；
b.沉积在所述支撑基底和可选的所述表面结构上的电极层；
c.第一电极层上的第一传感表面和第二电极层上的至少第二传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底和可选的所述电极层上的结合区域，其中所述结合区域与所述第一和第二传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂接触包含目标分析物的样本。
在第二方面的实施例中，所述结合区域由所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立的磁场区域限定，所述磁性元件在使用中吸引磁性粒子并将所述磁性粒子附着到所述支撑基底上，其中所述磁性粒子包括适于接触包含目标分析物的样本的结合层。
优选地，所述结合区域在所述支撑基底之上、之中或之下具有至少一个磁性元件。所述磁性元件吸引所述磁性粒子，使其附着在所述结合区域。
在其他实施例中，传感器还包括分别位于第三、第四、第五或其他电极层上的第三、第四、第五或其他传感表面，其中所述电极层彼此电隔离；其中结合区域和相应传感表面之间的分隔距离随着电极层数量的增加而逐渐增加。后面的电极层和相关联的传感表面逐渐远离结合区域。当设置在流动环境中时，电极沿着基本上由样本流动方向限定的轴定位在传感器上。在本发明的这一方面及其所有相关实施例中，具体设想了使用包括结合剂的磁性粒子，所述结合剂在结合区域与目标分析物结合。
可以有任意数量的传感表面连接到离散的电极层。传感器适于至少在第一和第二传感表面，优选在所有传感表面检测可检测响应，以便在目标分析物与结合剂结合后检测可比的响应测量值。由于附着到离散电极层的每个传感表面或传感组的距离增加，能够比较响应并确定校准曲线(假设样本中目标分析物的原始浓度已知)。
应当理解，传感表面通常是电连接到单个离散电极层的传感组的一部分，可以独立于其他电极层从该电极层测量响应测量值。
通过在电隔离电极层上提供两个或多个传感表面，可以在同一样本上同时进行多个可检测响应的测量。这不仅提供了一种执行实验复制的方法，还能够实现传感器响应的自校准。图7和8示出了示例性多电极检测。图7.1示出了一个样本，该样本包含通过附着有结合剂的结合层的目标分析物(开环)。目标分析物(TA)选择性地在结合位点与结合剂结合。图7.2示出了通过传感器的标准溶液，其中含有已知浓度的配体标记的目标分析物——TA-HRP(闭环)。标记的目标分析物结合到可用的结合剂上。
图8示出了在激活物质存在下将电活性基底(在该实施例中为3,3',5,5'-四甲基联苯胺加H2O2)引入传感器，该电活性基底穿过结合层，然后穿过传感表面。电活性基底在低目标分析物负载(图8A)和高目标分析物负载(图8B)下被配体氧化，然后在连续电极的表面上还原。电极表面的还原是通过施加还原电位(如上所述)来实现的。电活性物质在接触(即被氧化或还原)传感表面时的可检测响应的大小由显示3,3',5,5'-四甲基联苯胺还原的箭头的大小指示。图10A和图10B示出了相似的布置，尽管在这些实施例中，尖端阵列(传感表面突出于结合/惰性层之上的表面结构)用于实现多电极层传感器的更高灵敏度。类似地，图10B示出了使用微电极阵列作为产生电活性物质的结合层/结合区域。这与图8中描述的相似，除了图10B中所示的传感器阵列消除了添加再生物质(例如H2O2)以再生配体催化剂(辣根过氧化物酶)的要求，因为这可以通过将电极阵列保持在合适的还原电位(例如小于约-300mV或约-400mV)来产生。因此，在另一实施例中，本发明提供了一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，如本文所述，并通过在传感表面施加还原电位来再生配体催化剂，使得对再生物质的需求最小化或完全避免。
图9示出了预期从低TA浓度(Sample Conc.A)和高TA浓度(Sample Conc.B)下的多电极响应中获得的数据类型。其分别在对应于溶液中标记的目标分析物与结合剂结合后产生的电活性物质(这种情况下是TMBox)的量的点衰减。这相当于结合配体标记的目标分析物(在这种情况下是辣根过氧化物酶)的浓度，并且与样本中未标记的目标分析物的量成反比。通过这种方式，无需生成标准曲线就可以确定目标分析物的浓度。
发明人建立了一个计算机模型来预测电活性物质产生后传感表面的信号衰减。该模型考虑了各种变量，包括结合区域和传感表面之间的距离、流量、浓度和温度。
图14示出了在高浓度(14A)和低浓度(14B)下，电活性物质3,3',5,5'-四甲基联苯胺的生成的模型数据，所述电活性物质在“发生器”(结合区域)被氧化，在“收集器”(电极层上的传感表面)被还原。图14C示出了如何在浓度1和浓度2下观察输出电流。
在一个实施例中，所述第一分隔距离在大约1nm和5mm之间，所述第二分隔距离在大约1nm和5mm之间。在特定实施例中，所述第一和/或第二分隔距离(或传感表面间距离)在大约30nm和1mm之间、在大约100nm和500μm之间、在大约1μm和200μm之间或者在大约20μm和100μm之间。所述分隔距离可以在大约30nm和大约5mm之间、大约100nm和大约5000μm之间、大约1μm和大约1000μm之间或者大约20μm和大约100μm之间、大约30nm和大约5000μm之间、大约100nm和大约5mm之间、大约1μm和大约100μm之间、大约20μm和大约1000μm之间、大约20μm和大约5000μm之间；1μm和大约5mm。
在一个实施例中，所述第一传感表面和所述第二传感表面之间的第一传感表面间距离在大约30nm和1mm之间。相邻传感表面(分别连接到不同电极层)之间的其他传感表面间距离优选在大约30nm和1mm之间。
传感器可以包括任意数量的电极表面。在特定实施例中，所述传感器包括两个或多个离散的电极层，优选地在2和10之间(例如2 3 4 5 6 7 8 9 10)，每个电极层连接到测量电极。优选地，所述传感器包括5至8个电极层。优选地，在3和8之间、4和9之间、5和7之间、2和8之间。
在一个实施例中，任何一个电极层用隔离材料或间隙与所述结合区域或其他电极层电隔离。隔离材料例如自组装单层膜或光刻胶。
本文描述的与非自校准传感器相关的特征、变化和实施例都是可应用的，并且旨在结合自校准传感器的特征来阅读。
因此，在另一方面，本发明提供了一种确定样本中目标分析物浓度的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
支撑基底，可选地其上形成有表面结构；
沉积在所述支撑基底和可选的所述表面结构上的电极层；
第一电极层上的第一传感表面和第二电极层上的至少第二传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
所述支撑基底和可选的所述电极层上的结合区域，其中所述结合区域与所述第一和第二传感表面分离，至少一种结合剂附着到磁性粒子上的结合层；
b.将结合区域处的所述结合剂与含有目标分析物的样本接触；
c.测量两个或多个测量电极处的变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；
d.测量作为与所述结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化；
e.可选地，将响应的变化与对照样本中的已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
f.确定所述样本中所述目标分析物的浓度；
其中所述目标分析物与结合区域处的所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导可检测响应。
由于能够通过调整几个因素来定制系统，本发明的该自校准方面具有相当大的通用性，所述因素包括：
1.在结合位点产生的电活性物质如TMBox的量，其由以下因素决定：
结合区域的表面积；以及
结合区域中结合剂的数量和可用性；
2.微流体通道内的流速。在本发明的特定实施例中，流动是无流动，或者是恒定流动。在一个实施例中，流动是脉冲的或倾斜的。
3.通过微流体样本处理实现的样本处理方法，例如流体动力学和离心聚焦；
4.驱动氧化还原过程的电压控制；
5.结合区域和传感表面之间的距离。
该方法的主要优点之一是对实际样本进行校准，从而消除了与样本处理和矩阵效应相关的误差。
在另一实施例中，保护涂层被施加到下游传感表面，并且在检测电活性物质之前才被去除。
图7所示的示例是基于TA和TA-HRP的竞争性试验，其有效地竞争获取捕获剂。然而，该系统不限于竞争性试验，还适用于但不限于其他类型的ELISA检测，例如：
夹心试验，其中结合剂结合到结合区域，目标分析物结合到结合剂，并且具有配体(例如辣根过氧化物酶)的第二结合剂结合到目标分析物。以这种方式，目标分析物被“夹在”两种结合剂之间；或者
置换试验，其中结合剂结合到结合区域，而目标分析物-配体结合到结合剂上。暴露于含有目标分析物的样本会导致目标分析物取代TA-HRP。
唯一的要求是由传感表面检测的电活性物质的浓度直接或相反地对应于目标分析物的浓度。
图25示出了本发明方法在ELISA和电化学检测中用于检测氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺时的准确性和灵敏度。可以看出，结果非常接近，从而验证了本发明的测定。然而，本发明的电化学检测技术的灵敏度至少高两个数量级，因为电流可以测量到皮安，而不是典型光学检测技术的光学检测极限。
影响响应曲线的其他因素还可以包括用于引发传感器响应的方法。这将取决于所使用的传感器的类型，以及响应是否直接通过传感器和目标分析物之间的相互作用获得，或通过二次过程获得，例如在之后的电极上的二次/三次反应。
自校准传感器的特征如上关于本发明的其他传感器的描述。例如，图10示出了具有三角形横截面和顶点的表面结构，尽管这些结构可以如上面关于其他方面所述。
本发明还可以被视为包括一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.支撑基底上的结合区域，其中结合区域还适于接触样本，与传感表面分离，并且包括磁场；
b.将磁性粒子附着到所述结合区域，其中所述磁性粒子包括附着到所述磁性粒子上的结合层的至少一种结合剂；
c.将所述结合剂和传感表面与含有目标分析物的样本接触；
d.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
e.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中目标分析物与结合剂的结合产生电活性物质，该电活性物质介导传感表面处的可检测响应，并在电连接到至少一个传感表面的测量电极处测量可检测响应的变化；
并且其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm(顶点到顶点的距离)，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
本发明还可以被视为包括一种确定样本中目标分析物浓度的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.包括结合区域的支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.磁性元件；
v.支撑基底上的结合区域，其中结合区域包括结合层，还适于接触样本，与传感表面分离，并且包括由磁性元件产生的磁场；
b.将至少一种结合剂附着在所述结合区域处的结合层上；
c.将包括所述结合剂和至少一个传感表面的所述传感器与包含所述目标分析物的样本接触；
d.测量两个或多个测量电极处的变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；
e.测量作为与结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化，在所述结合位点发生所述结合试剂与所述目标分析物的结合；
f.将响应的变化与对照样本中的已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
g.确定所述样本中所述目标分析物的浓度；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导可检测响应，
并且其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm(顶点到顶点的距离)，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
本发明还可以被视为包括一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于静电、共价或磁性地附着至少一种结合剂；
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
优选地，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
优选地，所述至少一个表面结构与所述支撑基底成一体。
优选地，保护涂层被施加到所述电极层。
优选地，通过在支撑基底或表面结构上沉积结合层或惰性层来形成传感表面，使得表面结构的上部没有结合层或惰性层，从而导致表面结构的上部上的电极层的表面裸露作为传感表面。
优选地，结合层或惰性层邻近电极层沉积。
优选地，惰性层是导电的，并且连接到至少一个能够向惰性层施加电位的电极。
优选地，在电极层或支撑基底上沉积结合层的步骤包括施加自组装单层膜结合层。
以上和以下引用的所有申请、专利和出版物(如果有的话)的全部公开内容通过引用并入本文。
在本说明书中对任何现有技术的引用不是并且不应被视为是承认或以任何形式暗示所述现有技术形成世界上任何国家的努力领域的公知常识的一部分。
鉴于在前面的描述中阐述了本发明中特定的整体或组分的己知等价物，应当认为己经述及的已知等价物在此以单独列出的方式被提及了。
应当注意，对本文描述的当前优选实施例的各种改变和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围并且不减少其伴随的优点的情况下，可以进行这样的改变和修改。因此，这种改变和修改旨在包括在本发明的范围内。
示例：
用于所有示例的材料
PBS托盘、K3FeCN6、K4FeCN6、NHS、EDC、TMB和硫醇，购自西格玛奥德里奇(SigmaAldrich)，并直接使用。辣根过氧化物酶-P4(HRP-P4)是用Monerris等人于2012年发表的方法合成的。P4抗体购自BioRad(小鼠抗孕酮7720-1430)。
示例1-SU8对孕酮抗体的吸收
目标
用辣根过氧化物酶-P4和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的光学分析格式展示结合剂孕酮抗体与结合层SU8的结合。
方法
将结合层SU8旋涂(4000rpm)到基底材料(载玻片)上，得到大约0.2-0.4μm厚的层。表面用乙醇洗涤并用氮气干燥。测试区域使用6mm直径的PMMA孔进行定义。将P4抗体(75μl,20μg/ml，在PBS中)加入孔中，并在25℃下培养1小时。通过用洗涤缓冲液(吐温PBS)冲洗表面来除去多余的抗体(3×5分钟)。表面用乙醇胺溶液作为封闭剂(100μl，取自Tris缓冲液中的1M的溶液，pH 8.5)培育1小时，以阻止非特异性结合。使用75μl辣根过氧化物酶-P4(200ng/ml)进行测定，培育1小时。用洗涤缓冲液(6×2ml)洗涤5分钟后，表面用100μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(0.1mg/ml,0.006％H2O2)培育20分钟。将3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液转移到96孔板中，加入20μl的H2SO4(2M)。吸收率测量在450nm处进行。
结果
结果如图15所示，表明抗体在金和SU8表面上都能结合，然而SU8显示出更高的结合亲和力。为了检查非特异性结合，表面直接暴露于辣根过氧化物酶或乙醇胺和辣根过氧化物酶。虽然辣根过氧化物酶-P4紧密结合到表面，但结合被乙醇胺有效阻断。
在下面的示例中，氧化还原过程通常使用恒定的电压来驱动反应。然而，如本领域技术人员所知，也可以使用循环伏安法或恒流来驱动。
如本领域技术人员所知，下面的示例通常发生在阴极，但也适用于阳极的反应。
结论
SU8涂层显示具有抗体直接结合所需的性质，而不需要表面修饰。
示例2-孕酮的光学检测
目标
展示使用SU8涂层表面通过Elisa格式检测P4。
方法
使用示例1中定义的方案，用P4抗体涂覆SU8涂覆的载玻片表面，并用乙醇胺回填。在P4标准溶液(0、5、10、15、20、25、50和100ng/ml)存在下培育辣根过氧化物酶-P4，持续1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤表面6次，每次5分钟。然后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺和H2SO4，并如示例1中那样进行分光光度测量。
结果
结果如图16所示。
结论
结果表明，可以使用与SU8非共价结合的P4抗体进行P4测定。
示例3-用电化学平台检测孕酮，其中传感器表面是从结合区域突出的一系列尖端。
目标
基于示例1和2中的优化条件，使用电化学测量进行P4测定，其中传感表面(金)在SU8结合层上的结合区域内。
方法
示例1中使用的方法应用于从SU8结合层突出的20μm尖端阵列(如图12所示)。抗体以3μl液滴的形式仅施加在测量电极上，以产生附着有结合剂的结合区域。在进行电化学测量之前，用清洗缓冲液清洗整个传感器表面6次，持续5分钟。在-200mV(相对于Ag/AgCl)下在3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(0.1mg/ml,0.006％H2O2)中进行3分钟电流测量。
结果
图17示出了通过电化学测定获得的P4标准曲线，其中传感表面在结合区域(SU8)内。
结论
结果表明，在传感表面位于结合区域内的情况下，可以进行电化学P4测定。
示例4-自组装单层膜保护涂层的去除
目标
目的是利用自组装单层膜在金上的可逆吸附，使其作为传感表面的保护涂层，在电化学测量之前，该保护涂层可以被电化学去除以提供干净的表面。
方法
通过O2等离子体的反应离子蚀刻清洁金电极(2分钟)，并将其立即浸入硫醇溶液(0.1M乙醇溶液)中，持续60分钟。先后用乙醇和去离子水冲洗表面。通过在20mVs-1下从0.1V循环到-1.1V(相对于Ag/AgCl)，或者通过将电压保持在-1V(相对于Ag/AgCl)至少20分钟，自组装单层膜在PBS中被阴极解吸。
通过在铁/铁氰化物(0.5M)溶液中以20mV/s的速度从0.6V到-0.2V(相对于Ag/AgCl)进行扫描，在PBS中循环测定金上自组装单层膜的形成及其电化学解吸。
结果
图18示出了未涂覆金电极(a，黑线)、自组装单层膜涂覆金电极(b，短线虚线)和清洁金电极(c，点虚线)的循环伏安扫描。
结论
结果表明，20分钟后，自组装单层膜从平面电极上被有效地去除。扫描(c)与原始扫描(a)不同的原因被认为是由于表面上残留了痕量的自组装单层膜。
然而，清洁度水平足以进行测量并通过O2还原产生H2O2。
示例5-在与结合区域分离的平面电极上电化学检测P4
目标
为了说明使用电化学检测孕酮的用途，使用了传感表面与结合区域分离的形式，并显示了原位H2O2形成的效果。
方法
通过O2等离子体(3x)的反应离子蚀刻清洁间隔10μm的相邻金电极(WA和WB)，并将其浸入硫醇溶液(0.1M乙醇溶液)中60分钟。先后用乙醇和去离子水冲洗电极。如示例4中所述，选择性地从PBS中的一个电极(WA)上除去自组装单层膜。如示例1所述，将P4抗体(结合剂)固定在清洁的电极(WA)(结合层)上，然后暴露于辣根过氧化物酶-P4(配体标记的目标分析物)。
然后，如示例4中所述，从第二电极(WB)(传感表面)移除自组装单层膜。
第一部分：原位H2O2生成的影响。
在没有H2O2的情况下，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(还原的)加入到传感器中，并且通过将每个电极保持在-200mV然后-400mV(相对于Ag/AgCl)来测量氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺的氧化还原反应。
第二部分：P4测定。
将第一部分中制备的电极用P4(5ng/mL)培育30分钟，以实现与结合到抗体上的辣根过氧化物酶-P4的交换。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(还原的)，并在-400mV(相对于Ag/AgCl)下测量氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺的电化学响应。用30和100ng/mL的P4溶液依次重复该过程。
结果
第一部分
图19示出了在还原的3,3',5,5'-四甲基联苯胺存在的情况下，保持在-200或-400mV的WA和WB的电化学响应。在-200mV时，两个工作电极(WA，点虚线和WB，短线和点虚线)都没有显示出电流响应，这是由于3,3',5,5'-四甲基联苯胺还原时，没有添加H2O2来再生辣根过氧化物酶-P4。在-400mV WA(短线虚线)处，由于表面被抗体阻挡，显示出对3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化的低电流响应，其与当前电化学传感器中的配置相关，即捕获剂直接放置在电极顶部。在-400mV WB(实线)下，由于H2O2的产生(以重新激活辣根过氧化物酶-P4)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的氧化还原循环，显示出显著的电流响应，这导致伪稳态条件和电流增强。
第二部分
图20示出了在-400mV下，不添加额外的H2O2，由于与已知P4浓度的表面固定抗体结合的辣根过氧化物酶-P4的交换而产生的3,3',5,5'-四甲基联苯胺还原反应。图21示出了60秒测量后的电流响应。
结论
结果表明，结合区域与传感表面的分离导致显著的电流增强，同时提高了灵敏度和信噪比。结果还示出了使用传感器检测样本中的P4。
示例6-磁性粒子在竞争性试验格式中的使用
目标为了展示磁珠在微流体中的竞争性试验格式中的使用
将含有结合P4一级抗体的磁珠、P4标记的辣根过氧化物酶和未知P4浓度的牛奶样本的200μl混合物在ELISA孔中混合。溶液通过注射泵以0.5μl/min的速度通过传感器阵列抽取，其中磁性元件位于传感表面正下方，如图23所示。用缓冲溶液洗涤结合的磁珠，然后暴露于3,3',5,5'-四甲基联苯胺/H2O2溶液中。测量的电流与结合的辣根过氧化物酶的量成正比，因此间接与样本中未知的P4浓度成正比。
示例7-磁珠在竞争性试验流体格式中的使用
目标为了展示磁珠在微流体中的竞争性试验格式中的使用
基于流体的竞争性试验分析如图28A所示。使用注射泵，在微流体混合区域，将在磷酸盐缓冲液中含有100μl与P4一级抗体结合的磁珠和P4标记的辣根过氧化物酶(100μl)的溶液，与缓冲液中不同P4浓度的样本混合(速度为0.5μl/min)。然后将混合溶液穿过磁捕获区域，将磁珠靠着射流壁捕获。然后用缓冲溶液洗涤捕获的磁珠。将3,3',5,5'-四甲基联苯胺/H2O2溶液通过磁珠，然后通过更换在线电磁阀将磁珠引导至传感器区域。电化学测量为-200mV下的使用不锈钢电极进行的双端测量。
如在示例6中一样，除了由于溶液从磁捕获区域流到传感器而引起响应延迟这一特殊情况，测量的电流与结合的辣根过氧化物酶的量成比例。
示例8-磁性粒子在置换试验格式中的使用
目标为了展示磁珠在微流体中的置换试验格式中的使用
该过程如图28B所示。使用注射泵，在微流体混合区域，将在磷酸盐缓冲液中含有100μl与P4一级抗体结合的磁珠和P4标记的辣根过氧化物酶(磁珠辣根过氧化物酶标记的目标)的溶液，与缓冲液中不同P4浓度的样本混合(速度为0.5μl/min)。然后将混合溶液穿过磁捕获区域，将磁珠靠着射流壁捕获。然后用缓冲溶液洗涤捕获的磁珠。将3,3',5,5'-四甲基联苯胺/H2O2溶液通过磁珠，然后通过更换在线电磁阀将磁珠引导至传感器区域。电化学测量为-200mV下的使用不锈钢电极进行的双端测量。同样，除了由于溶液从磁捕获区域流到传感器而引起响应延迟这一特殊情况，测量的电流与结合的辣根过氧化物酶的量成比例。
示例9-磁珠的逐步“附着”、移除和更换
目标
为了展示用于孕酮检测的磁珠的逐步附着、移除和更换
方法
磁珠包括蛋白质G:P4抗体:P4-辣根过氧化物酶复合体通过图28所示的系统混合，并结合到磁捕获区域。然后用缓冲溶液洗涤磁珠，并将其暴露于3,3',5,5'-四甲基联苯胺/H2O2溶液中，该溶液被引导至传感器，并在-200mV下使用不锈钢进行双端测量。然后取出磁体释放，用缓冲溶液将磁珠清洗，作废。用一套新磁珠重复该过程。
结果
图29示出了传感器对连续磁珠组(1和2)在系统中被结合然后释放的双端安培响应。结果显示蠕动泵的脉动。区域A对应于3,3',5,5'-四甲基联苯胺在辣根过氧化物酶结合磁珠上的1分钟培育时间，区域B显示传感器对培育后3,3',5,5'-四甲基联苯胺的响应。最佳响应通过整合区域B下的峰来确定，并且示出再现性大于97％。
结论
结果示出了磁珠的成功结合、释放和再结合，并且磁珠的连续等分显示出了非常相似的反应。
示例10-感测前的磁清洗
目标
为了展示该方法的可重新配置性质
方法
该方法的过程如下：
1.如图24所示，在第一磁体上捕获磁珠，
2.用缓冲液清洗磁珠，
3.释放磁珠，
4.如图23所示，在传感器正下方的第二磁体上捕捉磁珠。
磁珠包括蛋白质G:P4抗体:P4-辣根过氧化物酶复合体通过图28所示的系统混合，并结合到磁捕获区域。磁珠用缓冲溶液洗涤，作废，然后释放，从而在传感器下方的第二磁体上捕获。3,3',5,5'-四甲基联苯胺/H2O2被引导至传感器，并在-200mV下使用不锈钢进行双端响应测量。移除第二磁体，并用缓冲溶液将磁珠清洗，作废。
结果
这些响应与之前记录的相似，并显示出与光学响应的良好相关性，如图30所示。
结论
结果示出了3,3',5,5'-四甲基联苯胺响应的成功结合、洗涤、释放、再捕获和测量。
参考文献
Blagoi,Keller,Johansson,Boisen,Dufva(2008).《用IgG蛋白官能化SU-8光致抗蚀剂表面》，Applied Surface Science 255(2008)2896–2902.
Grieshaber等(2008).《电化学生物传感器-传感器原理和结构》，Sensors(Basel).8(3),1400–1458.
Monerris等(2012).《电化学免疫传感器结合金纳米粒子测定孕酮》，Sensors andActuators B:Chemical 166–167:586-592.
本发明可以被视为包括并且还可以要求保护:
1.一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂接触包含目标分析物的样本。
2.根据权利要求1所述的传感器，其中所述结合区域处的所述结合层是磁性粒子上的功能表面，其中所述磁性粒子通过磁场附着到所述支撑基底。
3.一种传感器，包括：
a.支撑基底，可选地其上形成有表面结构；
b.沉积在所述支撑基底和可选的所述表面结构上的电极层；
c.第一电极层上的第一传感表面和第二电极层上的至少第二传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底和可选的所述电极层上的结合区域，其中所述结合区域与所述第一和第二传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂接触包含目标分析物的样本。
4.根据权利要求3所述的传感器，其中所述结合层包括与所述传感表面分离并且与第一电极层上的所述第一传感表面相邻的结合区域；以及
其中所述第一传感表面邻近所述第二电极层上的所述第二传感表面；以及
其中所述第一传感表面与所述结合区域的第一分隔距离小于所述第二传感表面与所述结合区域的第二分隔距离；以及
其中所述第一和第二电极层彼此电隔离。
5.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述电极层沉积在所述表面结构的上表面上。
6.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中结合区域包括所述支撑基底的适于附着一个或多个磁性粒子的区域。
7.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述传感表面在从所述支撑基底突出的表面结构上的电极层的上表面上。
8.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述表面结构包括位于所述表面结构顶部的顶点。
9.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合层包括附着到所述支撑基底的一个或多个磁性粒子上的功能表面。.
10.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合区域包括所述支撑基底之上、之中或之下的至少一个磁性元件。
11.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合区域包括适于吸引磁性粒子并将磁性粒子附着到所述支撑基底的磁场。
12.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述传感器包括通过所述电极层电连接到一个或多个传感表面或传感组的测量电极。
13.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合层包括磁性粒子上的功能表面，其中所述结合层适于附着粘合剂。
14.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述传感表面和所述结合区域容纳在微流体系统中。
15.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述传感表面和结合区域位于微流体系统的不同隔室中。
16.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合层或所述结合区域邻近第一电极层上的第一传感表面；以及
其中所述第一传感表面邻近第二电极层上的第二传感表面；以及
其中所述第一传感表面与所述结合层或所述结合区域的第一分隔距离小于所述第二传感表面与所述结合层或所述结合区域的第二分隔距离；以及
其中所述第一和第二电极层彼此电隔离。
17.一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于通过将磁性元件或磁性元件定位装置定位在所述支撑基底之上、之中或之下来将磁性粒子附着到所述支撑基底上，以便于建立能够吸引所述磁性粒子的磁场；
e.可选地将磁性粒子附着到所述结合区域；
f.可选地将结合剂附着到所述磁性粒子上的结合层上的功能表面上，
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
18.根据权利要求0所述的方法，其中所述至少一个表面结构与所述支撑基底成一体。
19.根据权利要求0或0所述的方法，其中所述生产方法还包括将磁性元件和/或磁性元件定位装置附着到所述传感器。
20.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中保护涂层被施加到所述电极层。
21.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中通过在所述支撑基底或表面结构上沉积结合层或惰性层来形成所述传感表面，使得所述表面结构的上部没有结合层或惰性层，从而导致所述表面结构的所述上部上的所述电极层的表面裸露作为所述传感表面。
22.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述表面结构形成有位于所述表面结构顶部的顶点。
23.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述结合层或惰性层邻近所述电极层沉积。
24.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述惰性层是导电的，并且连接到至少一个能够向所述惰性层施加电位的电极。
25.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述传感表面由所述支撑基底和表面结构上惰性层的沉积形成，使得传感表面形成在所述表面结构上的所述电极层上。
26.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中在所述电极层或所述支撑基底上沉积结合层的步骤包括施加自组装单层膜结合层。
27.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述传感表面和所述结合区域形成在微流体系统中。
28.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述传感表面和所述结合区域形成在微流体系统的不同隔室中。
29.一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供根据权利要求1至0中任一项所定义的传感器，或者包括:
i.支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离并包括磁场；
b.将磁性粒子附着到所述结合区域，其中所述磁性粒子包括附着到所述磁性粒子上的结合层的至少一种结合剂；
c.将所述结合剂与含有目标分析物的样本接触；
d.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
e.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导所述可检测响应。
30.一种确定样本中目标分析物浓度的方法，所述方法包括：
a.提供根据权利要求1至0中任一项所定义的传感器，或者包括:
i.包括结合区域的支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离并包括磁场；
b.将至少一种结合剂附着在所述结合区域处的结合层上；
c.将包括所述结合剂和至少一个传感表面的所述传感器与包含所述目标分析物的样本接触；
d.测量两个或多个测量电极处的变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；
e.测量作为与结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化，在所述结合位点发生所述结合试剂与所述目标分析物的结合；
f.将响应的变化与对照样本中的已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
g.确定所述样本中所述目标分析物的浓度；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导可检测响应。
31.根据权利要求0或0所述的方法，其中所述电活性基底接触配体标记的目标分析物，从而导致所述电活性基底氧化以产生电活性物质，所述电活性物质通过与保持在还原电位的所述传感表面接触而在所述传感表面引发可检测响应。
32.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述结合层在附着到所述支撑基底上的结合区域的磁性粒子上，其中所述结合区域由所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立的磁场区域限定，所述磁性元件在使用中吸引磁性粒子并将磁性粒子附着到所述支撑基底上。
33.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中通过使所述样本流过所述传感器表面来施加所述样本。
34.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a.提供根据权利要求1至0中任一项所定义的传感器，或者包括:
i.包括结合区域的支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离并包括磁场；
b.将至少一种结合剂附着在结合层上；
c.用配体标记所述目标分析物；
d.将所述传感器、结合剂和至少一个传感表面与含有预定量的所述标记目标分析物和未标记目标分析物的样本接触，从而进行竞争性试验；
e.将电活性基底施加到所述传感器上，使得所述电活性基底的一部分被所述结合的标记目标分析物氧化或还原；
f.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中所述标记或未标记目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面的可检测响应。
35.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过在所述传感表面施加还原电位来再生配体催化剂。
36.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用传感器，所述传感器在两个或更多电极层上具有两个或更多传感表面，其与所述结合区域的距离增加；以及
其中测量变化的步骤包括在两个或多个测量电极处测量变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；其中所述方法还包括：
测量作为与所述结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化；
将所述可检测响应的变化与对照样本中已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
确定所述样本中所述目标分析物的浓度。
37.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述传感表面和所述结合区域容纳在微流体系统中。
38.根据权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述传感表面和所述结合区域容纳在微流体系统的不同隔室中。
39.一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于静电、共价或磁性地附着至少一种结合剂；
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述至少一个表面结构与所述支撑基底成一体。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中保护涂层被施加到所述电极层。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，其中通过在所述支撑基底或表面结构上沉积结合层或惰性层来形成所述传感表面，使得所述表面结构的上部没有结合层或惰性层，从而导致所述表面结构的所述上部上的所述电极层的表面裸露作为所述传感表面。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述结合层或惰性层邻近所述电极层沉积。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述惰性层是导电的，并且连接到至少一个能够向所述惰性层施加电位的电极。
46.根据权利要求39至45中任一项所述的方法，其中在所述电极层或所述支撑基底上沉积结合层的步骤包括施加自组装单层膜结合层。
47.一种提高检测样本中目标分析物的准确度的方法，所述方法包括提供传感器的步骤，所述传感器包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
e.将所述结合剂与含有目标分析物的样本接触；
f.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
g.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面处的所述可检测响应，并提高检测所述样本中所述目标分析物的准确性。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述结合区域和所述传感表面之间的所述分隔距离在大约1nm和大约50mm之间。
49.一种确定样本中目标分析物浓度的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.包括结合区域的支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.磁性元件；
v.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域包括结合层，适于接触所述样本，与所述传感表面分离，并且包括由所述磁性元件产生的磁场；
b.将至少一种结合剂附着在所述结合区域处的所述结合层上；
c.将包括所述结合剂和至少一个传感表面的所述传感器与包含所述目标分析物的样本接触；
d.测量两个或多个测量电极处的变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；
e.测量作为与结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化，在所述结合位点发生所述结合试剂与所述目标分析物的结合；
f.将响应的变化与对照样本中的已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
g.确定所述样本中所述目标分析物的浓度；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导可检测响应，
并且其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm(顶点到顶点的距离)，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
50.一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域还适于接触所述样本，与所述传感表面分离，并且包括磁场；
f.将磁性粒子附着到所述结合区域，其中所述磁性粒子包括附着到所述磁性粒子上的结合层的至少一种结合剂；
g.将所述结合剂和所述传感表面与含有目标分析物的样本接触；
h.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面处的所述可检测响应，并在电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处测量变化；
并且其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm(顶点到顶点的距离)，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
51.一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂也适于接触包含所述目标分析物的所述样本。
52.一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂也适于接触包含所述目标分析物的所述样本；并且其中所述传感器适于在所述目标分析物与附着于所述结合层的结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
53.一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于通过将磁性元件或磁性元件定位装置定位在所述支撑基底之上、之中或之下来将至少一个磁性粒子附着到所述支撑基底上，以便于建立能够吸引所述磁性粒子的磁场；
e.可选地将磁性粒子附着到所述结合区域；
f.可选地将结合剂附着到所述磁性粒子上的结合层上的功能表面上；
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
54.根据权利要求51或52所述的传感器，其中所述结合剂以静电的、共价的方式或通过所述结合剂已经附着于其上的磁珠附着到所述结合区域。

Claims (40)

1.一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂也适于接触包含所述目标分析物的所述样本。
2.一种传感器，包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触包含目标分析物的样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
其中，在使用中，附着到所述结合区域处的结合层的结合剂也适于接触包含所述目标分析物的所述样本；并且其中所述传感器适于在所述目标分析物与附着于所述结合层的结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其中所述结合剂以静电的、共价的方式或通过所述结合剂已经附着于其上的磁珠附着到所述结合区域。
4.根据权利要求1或2所述的传感器，其中所述传感器包括磁性元件，所述结合区域处的所述结合层是磁性粒子上的功能表面，其中所述磁性粒子通过由所述磁性元件产生的磁场附着到所述支撑基底。
5.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，和/或所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
6.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述电极层沉积在所述表面结构的上表面上。
7.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合层包括附着到所述支撑基底的一个或多个磁性粒子上的功能表面。
8.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述传感器包括通过所述电极层电连接到一个或多个传感表面或传感组的测量电极。
9.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述结合层或所述结合区域邻近第一电极层上的第一传感表面；以及
其中所述第一传感表面邻近第二电极层上的第二传感表面；以及
其中所述第一传感表面与所述结合层或所述结合区域的第一分隔距离小于所述第二传感表面与所述结合层或所述结合区域的第二分隔距离；以及其中所述第一和第二电极层彼此电隔离。
10.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述支撑基底与所述表面结构成一体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的传感器，其中所述传感表面和所述结合层被惰性材料或间隙隔开。
12.一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于通过将磁性元件或磁性元件定位装置定位在所述支撑基底之上、之中或之下来将至少一个磁性粒子附着到所述支撑基底上，以便于建立能够吸引所述磁性粒子的磁场；
e.可选地将磁性粒子附着到所述结合区域；
f.可选地将结合剂附着到所述磁性粒子上的结合层上的功能表面上；
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm(顶点到顶点的距离)，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述至少一个表面结构与所述支撑基底成一体。
15.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述生产方法还包括将磁性元件和/或磁性元件定位装置附着到所述传感器。
16.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中保护涂层被施加到所述电极层。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中通过在所述支撑基底或表面结构上沉积结合层或惰性层来形成所述传感表面，使得所述表面结构的上部没有结合层或惰性层，从而导致所述表面结构的所述上部上的所述电极层的表面裸露作为所述传感表面。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述结合层或惰性层邻近所述电极层沉积。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述惰性层是导电的，并且连接到至少一个能够向所述惰性层施加电位的电极。
20.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中在所述电极层或所述支撑基底上沉积结合层的步骤包括施加自组装单层膜结合层。
21.一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触所述样本；
iv.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域还适于接触所述样本，与所述传感表面分离，并且包括磁场；
b.将磁性粒子附着到所述结合区域，其中所述磁性粒子包括附着到所述磁性粒子上的结合层的至少一种结合剂；
c.将所述结合剂和所述传感表面与含有目标分析物的样本接触；
d.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面处的所述可检测响应，并在电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处测量变化；
并且其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm(顶点到顶点的距离)，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
22.一种确定样本中目标分析物浓度的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.包括结合区域的支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触所述样本；
iv.磁性元件；
v.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域包括结合层，适于接触所述样本，与所述传感表面分离，并且包括由所述磁性元件产生的磁场；
b.将至少一种结合剂附着在所述结合区域处的所述结合层上；
c.将包括所述结合剂和至少一个传感表面的所述传感器与包含所述目标分析物的样本接触；
d.测量两个或多个测量电极处的变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；
e.测量作为与结合位点的分隔距离的函数的可检测响应的变化，在所述结合位点发生所述结合试剂与所述目标分析物的结合；
f.将响应的变化与对照样本中的已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
g.确定所述样本中所述目标分析物的浓度；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质在所述传感表面处介导可检测响应，
并且其中所述结合区域和所述传感表面之间的分隔距离在大约1nm和50mm之间，所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm(顶点到顶点的距离)，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000μm之间。
23.一种检测样本中目标分析物与结合剂结合的方法，所述方法包括：
a.提供根据权利要求1至11中任一项所定义的传感器；
b.用配体标记所述样本中的所述目标分析物；
c.将所述传感器与含有预定量的所述标记目标分析物和未标记目标分析物的所述样本接触；
d.将电活性基底施加到所述传感器上，使得所述电活性基底的一部分被所述结合的标记目标分析物氧化或还原；
其中所述标记和未标记目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面处的可检测响应，并在电连接到至少一个传感表面的测量电极处测量变化。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述电活性基底是3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述电活性基底接触配体标记的目标分析物，从而导致所述电活性基底氧化以产生电活性物质，所述电活性物质通过与保持在还原电位的所述传感表面接触而在所述传感表面引发可检测响应。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述结合层在附着到所述支撑基底上的结合区域的磁性粒子上，其中所述结合区域由所述支撑基底之上、之中或之下的磁性元件建立的磁场区域限定，所述磁性元件在使用中吸引磁性粒子并将磁性粒子附着到所述支撑基底上。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中通过在微流体环境中使所述样本流过所述传感器的表面来施加所述样本。
28.一种检测样本中目标分析物的方法，所述方法包括：
a.提供传感器，其包括：
i.包括结合区域的支撑基底；
ii.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
iii.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触样本；
iv.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离并包括磁场；
b.将至少一种结合剂附着在结合层上；
c.用配体标记所述目标分析物；
d.将所述传感器、结合剂和至少一个传感表面与含有预定量的所述标记目标分析物和未标记目标分析物的样本接触，从而进行竞争性试验；
e.将电活性基底，例如H2O2存在下的3,3',5,5'-四甲基联苯胺，施加到所述传感器上，使得所述电活性基底的一部分被所述结合的标记目标分析物氧化或还原；
其中所述标记和未标记目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面处的可检测响应，并在电连接到至少一个传感表面的测量电极处测量变化。
29.根据权利要求20至28中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用传感器，所述传感器在两个或更多电极层上具有两个或更多传感表面，其与所述结合区域的距离增加。
30.根据权利要求29所述的方法，其中测量变化的步骤包括在两个或多个测量电极处测量变化，每个测量电极电连接到电极层和至少一个传感表面，所述测量电极彼此电隔离；其中所述方法还包括：
测量作为与所述结合位点的分隔距离的函数的所述可检测响应的变化；
将所述可检测响应的变化与对照样本中已知浓度的目标分析物的响应变化进行比较；以及
确定所述样本中所述目标分析物的浓度。
31.一种生产传感器的方法，包括：
a.提供支撑基底，其中从所述支撑基底的上表面突出至少一个表面结构；
b.在所述至少一个表面结构的上表面上沉积电极层；
c.在所述电极层上沉积惰性层，使得所述电极层的一个或多个部分保持裸露，以在所述电极层上形成至少一个传感表面，其中所述惰性层包括对待分析样本的组分基本惰性的材料；
d.在所述支撑基底上形成结合区域，其中所述结合区域适于静电、共价或磁性地附着至少一种结合剂；
其中，所述传感表面与所述结合区域分开足够的分隔距离，以在使用中用于在目标分析物与所述结合剂结合后在所述传感表面处检测可检测响应。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述表面结构彼此分离大约50nm到大约2000μm，和/或所述表面结构连接所述支撑基底处的宽度在大约20nm到大约5000μm之间，和/或每个所述表面结构的顶点的宽度优选地在大约1nm到大约5000微米之间。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述至少一个表面结构与所述支撑基底成一体。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中保护涂层被施加到所述电极层。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中通过在所述支撑基底或表面结构上沉积结合层或惰性层来形成所述传感表面，使得所述表面结构的上部没有结合层或惰性层，从而导致所述表面结构的所述上部上的所述电极层的表面裸露作为所述传感表面。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述结合层或惰性层邻近所述电极层沉积。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述惰性层是导电的，并且连接到至少一个能够向所述惰性层施加电位的电极。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中在所述电极层或所述支撑基底上沉积结合层的步骤包括施加自组装单层膜结合层。
39.一种提高检测样本中目标分析物的准确度的方法，所述方法包括提供传感器的步骤，所述传感器包括：
a.支撑基底；
b.从所述支撑基底的上表面突出的至少一个表面结构，其中所述表面结构包括电极层；
c.所述电极层上的传感表面，其中所述传感表面适于接触所述样本；
d.所述支撑基底上的结合区域，其中所述结合区域与所述传感表面分离；
e.将所述结合剂与含有所述目标分析物的所述样本接触；
f.允许所述目标分析物与所述结合剂结合，以在所述传感表面产生可检测响应；
g.测量电连接到所述至少一个传感表面的测量电极处的变化；
其中所述目标分析物与所述结合剂的结合产生电活性物质，所述电活性物质介导所述传感表面处的所述可检测响应，并提高检测所述样本中所述目标分析物的准确性。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述结合区域和所述传感表面之间的所述分隔距离在大约1nm和大约50mm之间。
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