JP2013142663A - 電気的分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記分析方法では、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーとを反応させ、被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、不溶化反応を実施することによって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させ、前記感知部に沈殿させた不溶性物質を電気的に分析する方法において、選択的相互作用を示す特異的パートナーが微粒子上に固相化されている。
【選択図】なし
Description
そのため、未結合の標識物の非特異的な吸着を抑制するために、本反応に使用する抗体(抗原)以外に作用極上にブロッキングのためのBSAやカゼインや高分子等の非特異抑制物質を固定化して、できるだけ簡単に抗原抗体反応由来以外の標識物が電極上に非特異的に吸着しないようにすることが試みられている。
しかしながら、このように電極上に電気化学不活性な物質を多く固定化すると、電極上での直接な電子授受は困難になるため検出信号が弱まり、測定感度が減少するという問題点もある。これは、酵素免疫センサの高感度な測定を妨げる一つの要因となっている。
本発明者らは、今まで以上の高感度な酵素免疫センサを作製するため、特許文献1に記載のような酵素標識化した免疫複合体を、銀イオンの沈着反応を改善することにより更に高感度に電気的に測定することを検討した。
従って、本発明の課題は、従来の分析方法よりも検出感度や精度の高い分析方法を提供することにある。
[1]分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーとを反応させ、被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、不溶化反応を実施することによって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させ、前記感知部に沈殿させた不溶性物質を電気的に分析する方法であって、
選択的相互作用を示す特異的パートナーが微粒子上に固相化されていることを特徴とする、分析方法、
[2]前記感知部表面が、電気信号の授受を妨げる物質で覆われていない、[1]の分析方法、
[3]不溶化反応および電気的な分析を行う際に、前記感知部表面と前記微粒子が直接接触する、[1]又は[2]の分析方法、
[4]前記微粒子が非導電性物質である、[1]〜[3]のいずれかの分析方法、
[5]前記微粒子が磁性微粒子である、[1]〜[4]のいずれかの分析方法、
[6]分析対象物質と、微粒子上に固相化された特異的パートナーとの前記反応が複合体形成部で行われ、前記不溶化反応が感知部上で行われる、[1]〜[5]のいずれかの分析方法、
[7]前記微粒子の大きさが3μm以下である、[1]〜[6]のいずれかの分析方法、
[8]前記可溶性物質が銀イオンである、[1]〜[7]のいずれかの分析方法、
[9][1]〜[8]のいずれかの分析方法に使用する装置であって、
分析対象物質と、微粒子上に固相化された特異的パートナーとを反応させる複合体形成部と、前記感知部とを有する装置、
[10]前記複合体形成部と前記感知部が別体である、[9]の装置、
[11]前記微粒子を捕捉可能な磁力体を有する、[9]又は[10]の装置
に関する。
例えば、磁性微粒子を用いた抗原抗体反応を行わせることにより、非特異的な標識物の洗浄は磁気的な相互作用によりB/F洗浄可能であり、また、微粒子を用いることで固相抗体量を増加させることができ、抗原のキャッチング能も増加させることができる。さらには、抗原抗体反応の反応部と酵素反応による生成物の検出部をわけることにより、感知部(作用極)における抗体(抗原)の固定化、非特異抑制物質の固定化を必要とせず、電極との生成物との直接的な電子授受を容易にすることで高感度での電気化学的な酵素免疫測定を可能にした。
また、粒子径のより小さい磁性微粒子を用いることで、酵素反応により生成した生成物の還元作用により生成される金属物の析出を効果的に電極上に沈着させることが可能になり、より高感度化が達成できた。
(1)選択的相互作用に関与する一方のパートナーに、直接的または間接的に標識可能な標識物質により、不溶化反応が直接的又は間接的に引き起こされる方法(以下、複合体形成型分析方法と称する)、
(2)選択的相互作用それ自体により、不溶化反応が直接的又は間接的に引き起こされる方法(以下、酵素利用型分析方法と称する)
などが含まれる。なお、前記区分は、選択的相互作用により複合体を形成するか否かに基づいて大別するものであり、例えば、標識物質として酵素を用いる方法は、複合体形成型分析方法に含まれる。
以下、本発明の複合体形成型分析方法の具体的な一態様を示す図1に示す反応模式図に基づいて、本発明の概略を説明した後、本発明について更に詳細に説明する。
また、この分析系では、標識酵素による酵素反応として、以下に示す反応式1を利用し、不溶化反応として、反応式2を利用する。なお、図1において、pAPPはp−アミノフェニルホスフェート、pAPはp−アミノフェノールを、pQIはp−キノンイミンを、それぞれ、意味し、pAPPはALPの基質である。また、反応式1における「(ALP)」は、ALPが反応式1の触媒として関与することを示す。
更に、電気的分析法として、作用極101、対極、及び参照極を備えた電極部を用いるアンペロメトリック型分析法を使用する。
p−アミノフェノール+2Ag+→p−キノンイミン+2H++2Ag↓ (反応式2)
Ag→Ag++e− (反応式3)
また、これらの酵素以外にも、各種還元剤又は酸化剤を用いることもできる。
前記ナノチューブ状構造体の好ましい態様としては、カーボンナノチューブ、ボロンナイトライドナノチューブ、チタニアナノチューブよりなる群から選ばれる構造体である。
また、感知部が導電性を有しているかぎり、感知部の構成に、上記導電性物質と共に非導電性物質を加えても良い。非導電性物質としては、ポリエステル系樹脂等の不溶性担体等が挙げられる。
ここで、感知部表面を「覆われていない」とは、その感知部の状態が、実質的な性質・状態に反映されていれば良い。
このような好適態様の具体例としては、磁性微粒子を用いて抗原抗体反応を複合体形成部で行わせ、抗原抗体反応終了後、別の流路にて検出部である電極部(感知部)に磁性微粒子を持ち出し、磁石にて磁性微粒子を感知部に集める。その後、感知部にて酵素反応を行わせ、生成物である銀を電気化学的に測定する。
本発明の電気的な分析に使用可能な溶液は、強電解質を含み且つ分析対象物以外の電流応答に寄与する物質を含まない溶液である。本発明に使用できる強電解質としては、溶媒と反応せず、感知部表面への特異吸着のないものであれば制限はなく、例えば、アルカリ金属のハロゲン化物、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩、などが挙げられる。例えば、硝酸カリウムが挙げられる。銀イオンから生じる不溶性物質の場合には、硝酸カリウムを使用することにより、電流応答に寄与する物質(例えば、硝酸銀)を単一に優先して生成することが可能となり、単一のピークとして検出できることから、感度や精度が高まるため特に好ましい。
また、分析対象物以外の電流応答に寄与する物質を含まないことによって、より安定して単一の検出ピークを得ることができるので良い。
本発明に使用可能な電解質は一種類または二種類以上組み合わせても良いが、電気的シグナルを複数検出させる要因となる物質を生成する組み合わせは望ましくない。
また、電気的測定に用いる溶液の溶媒は、電位窓が不溶性物質のレドックス電位より広く、不溶性物質が溶解しなければ制限はないが、好ましくは水である。
(1)カーボン電極の作製
電極上のブロッキング剤の影響を評価するために、カーボン電極上にウシ血清アルブミン(BSA)をコーティングしたものと、BSAをコーティングしていないものとを作製した。
図2に示すパターンからなる電極部12及びリード部13を、ステンレス鋼製マスクパターンを用いて、印刷法より作製した。まず、ポリエチレンテレフタレート(PET)からなる絶縁性基板11上に、導電性カーボンペースト(FTU−20:アサヒ化学研究所製)を電極の形状に印刷形成し、カーボン電極を作製した。作製したカーボン電極の一部に銀・塩化銀インク(BAS社製)を塗布し参照極16を作製した。次に、電極部12とリード部13間を仕切るため、絶縁膜17にてリード部の一部を覆うことにより、作用極14、対極15、参照極16を備えた電極部を作製した。作用極、対極、参照極の反対側の端部は、接続用コネクター18として機能する。この作製したカーボン電極をBSAのコーティングしていない電極として使用した。
また、比較用としての、BSAをコーティングした電極は、0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)(以下、緩衝液Aと称する)に1%BSAを添加した溶液中に、前記作製したカーボン電極を1時間浸漬させることで作製した。
公知の方法に従って、B型肝炎表面抗原(HBs抗原:組み換え品、サブタイプadw)をマウスに免疫し、抗HBs抗原マウスモノクローナル抗体(IgG)を作製した。これを粒子径が0.7μmの磁性微粒子(メルク製)に固相化することによって、抗体固定化磁性微粒子を作製した。具体的には、公知の方法に従い、磁性微粒子表面上のカルボキシル基(−COOH)を水溶性カルボジミド(WSC:同仁社製)にて活性化させた後、この作製した抗体と磁性微粒子を混合することで磁性微粒子表面上に該抗体を共有結合にて化学的に固定化した。更にBSAを物理的および化学的に固定化することにより抗HBs抗体固定化磁性微粒子を作製した。
公知の方法に従って、B型肝炎表面抗原(HBs抗原:組み換え品、サブタイプadw)をウサギに免疫し、抗HBs抗原ウサギポリクローナル抗体(IgG)を作製し、次いで、これをFab’画分に調製した。この作製した抗体とALP(ロシュ製)及び架橋試薬(Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate:PIERCE製)を用いて、「高感度酵素免疫測定法(石川栄治:学会出版センター、1993)」記載のマレイミドヒンジ法に基づき、ALP標識抗HBs抗原ウサギポリクローナル抗体(Fab’)を作製した。この酵素標識抗体を、(1)に記載の緩衝液Aに2%BSAを添加した溶液にて所定の濃度に調整した溶液を、ALP標識抗HBs抗体溶液とした。
0.01mol/Lリン酸緩衝液に0.1%Tween20(和光純薬製)を含有させたものを洗浄液Aとして調製した。更に、10mmol/L MES(同仁製)、0.9%NaCl(和光純薬製)、0.05%Tween20(和光純薬製)を混合したものを洗浄液Bとして調製した。
(2)にて調製した抗HBs抗体固定化磁性微粒子、B型肝炎表面抗原溶液(HBs抗原:組み換え品、サブタイプadw)、(3)で調製したALP標識抗HBs抗体溶液を所定濃度混合し、室温にて所定時間抗原抗体反応を実施した。HBs抗原溶液としては、HBs抗原を、1%BSAを含有した緩衝液Aにて所定濃度になるように調整した溶液を使用した。その後、磁性微粒子を磁気分離にて分離し、洗浄液Bを用いてB/F洗浄を行い、酵素免疫複合化磁性微粒子(ALP標識抗HBs抗体−HBs抗原−抗HBs抗体固定化磁性微粒子)を調製した。
(1)で作製したブロッキング無しのカーボン電極の作用極に、(2)で作製した抗HBs抗原マウスモノクローナル抗体(最終濃度1mg/mL)を含む緩衝液Aを2μL滴下し、37℃で30分間インキュベートした後、25℃、湿度40%条件下で2時間乾燥させた。その後、1%BSAを含有させた緩衝液A中に1時間浸漬させて、未反応部をブロッキングし、更に脱塩水を用いて基板を洗浄後、乾燥させ、抗体固定化電極を作製した。
(6)にて作製した抗体固定化電極の反応部用ウェルに、HBs抗原溶液および(3)で調製したALP標識抗HBs抗体溶液を所定濃度に混合した溶液を添加し、室温にて所定時間浸漬させることで抗原抗体反応を実施した。その後、洗浄液Aにて電極を洗浄し、酵素免疫複合化電極(ALP標識抗HBs抗体−HBs抗原−抗HBs抗体固定化電極)を調製した。HBs抗原としては、HBs抗原(組み換え品、サブタイプadw)を、1%BSAを含有した緩衝液Aにて所定濃度になるように調整した溶液を使用した。
2.5mmol/L AgNO3、2mmol/L MgSO4を含む水溶液(基質液A)と、40mmol/L p−アミノフェニルホスフェート(pAPP:LKT Laboratories製)を含む25mmol/L Tris水溶液(基質液B)とをそれぞれ調製し、酵素基質反応直前に基質液Aと基質液Bを10倍希釈として1対1で混合して酵素基質反応溶液とした。
(5)で調製した酵素免疫複合化磁性微粒子を1mmol/L MgSO4と12.5mmol/L Trisを含む水溶液100μLにて分散させ、図3及び図4に示すように、作用極部の下に磁石を配置した状態で、反応部用ウェルに酵素免疫複合化後の磁性微粒子分散溶液を滴下し、作用極上に酵素免疫複合化後の磁性微粒子を集めた。
その後、基質液Aを30μL、基質液Bを30μL、1mmol/L MgSO4と12.5mmol/L Trisを含む水溶液240μLを加え、所定時間放置した。
(7)にて調製した酵素免疫複合化抗体固相化電極の反応部用ウェルに、基質液Aを30μL、基質液Bを30μL、1mmol/L MgSO4と12.5mmol/L Trisを含む水溶液240μLを加え、所定時間放置した。
電気化学的測定は、作用極、参照極、対極の各接続用コネクターを電気化学アナライザー(chi1232a:ALS製)にそれぞれ接続し、微分パルスボルタンメトリー法(DPV)により測定した。
測定用の抗体が電極に固定化された従来の電極の場合と、磁性微粒子に固定化された本発明における電極の場合の測定感度を比較検討した。
本発明における酵素免疫電極としては、実施例1(5)の方法にて室温で30分間反応させ作製した酵素標識複合体化磁性微粒子(0.7μm)を、実施例1(1)で作製したBSAコーティングをしたカーボン電極の反応部用ウェルに滴下し、電極部背面から磁石で引き付け作用極上に磁性微粒子を集め、実施例1(9)の条件で30分間反応させた。
一方、従来の酵素免疫電極としては、実施例1(7)の方法にて室温で30分間反応させ作製した酵素免疫複合体化抗体固定化電極を使用し、実施例1(10)の条件で30分間反応させた。
それぞれ、その後、酵素基質反応溶液を除去し、1mol/L KNO3溶液300μLを加え、実施例1(11)の条件にてDPV測定を実施した。
本発明における酵素免疫電極は、従来の酵素免疫電極よりも約3.4倍高い酸化電流ピーク値を示し、高感度に銀の酸化電流値を検出可能であることが確認できた。これは、磁性微粒子を用いることで固相抗体量が増加したこと、そして、免疫複合化が短時間で形成されたことに由来していると考えられ、磁性微粒子を用いることで従来以上に短時間で高感度な測定が可能になることがわかった。
実施例1(1)で作製したBSAブロッキング有りあるいは無しのカーボン電極の反応部用ウェルに、それぞれ、実施例1(5)で調整した酵素免疫複合化磁性微粒子を置き、銀の酸化電流応答値を確認した。
実施例2と同様に、実施例1(5)の方法にて室温で30分間反応させ作製した酵素標識複合体化磁性微粒子(0.7μm)を使用し、実施例1(9)の条件にて銀の沈着反応を30分間行った。その後、酵素基質反応溶液を除去し、1mol/L KNO3溶液300μLを加え、実施例1(11)の条件にてDPV測定を実施した。
BSAでのブロッキング無しの電極を用いることで、BSAでブロッキングを行った電極より約4.3倍高い銀の酸化電流ピーク値を示した。このことから、検出部である電極表面をBSA等のブロッキング剤等でコートしないことでより効果的に沈着銀の酸化を行わせることが可能であることが判った。
以下の調製方法にて作製した磁性微粒子と標識抗体を用いたこと以外は、実施例1に従って検討した。
公知の方法に従い、B型インフルエンザウイルス抗原(FluB抗原:阪大微生物病研究会より入手したFlorida株のB型インフルエンザHAワクチン原液から採取)をマウスに免疫して、抗FluBマウスモノクローナル抗体(IgG)を作製した。次いで、この抗体を粒子径が、それぞれ、2.6μm、0.7μm、0.44μmの磁性微粒子(メルク製)に固相化することによって、抗体固定化磁性微粒子を作製した。具体的には、公知の方法に従い、磁性微粒子表面上のカルボキシル基(−COOH)を水溶性カルボジミド(WSC:同仁社製)にて活性化させた後、抗体と磁性微粒子を混合することで磁性微粒子表面上に該抗体を共有結合にて化学的に固定化した。更にBSAを物理的および化学的に固定化することにより抗FluB抗体固定化磁性微粒子を作製した。
公知の方法に従い、B型インフルエンザウイルス抗原(FluB抗原:阪大微生物病研究会より入手したBrisbane株のB型インフルエンザHAワクチン原液から採取)をマウスに免疫して、抗FluBマウスモノクローナル抗体(IgG)を作製した。これをFab’画分に調製し、ALP標識用の抗FluBマウスモノクローナル抗体として使用した。次いで、該抗体とALP(ロシュ製)及び架橋試薬(Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate:PIERCE製)を用いて、「高感度酵素免疫測定法(石川栄治:学会出版センター、1993)」記載のマレイミドヒンジ法に基づき、ALP標識抗FluBマウスモノクローナル抗体(Fab’)を作製した。この作製した酵素標識抗体を2%BSA含有緩衝液Aにて1mAbs濃度に調整した溶液を、ALP標識抗FluB抗体溶液とした。
(1)で調製した抗FluB抗体固定化磁性微粒子(粒子径:0.4μm、0.7μm、2.6μm)、FluB抗原溶液(FluB抗原を1%BSAを含有した緩衝液Aにて所定濃度(0%、0.001%、0.01%)になるように希釈調製した)、(2)で調製したALP標識抗FluB抗体溶液を1mAbs濃度で混合し、室温にて5分間原抗体反応を実施した。その後、磁性微粒子を磁気分離にて分離し、洗浄液Bを用いてB/F洗浄を行い、酵素免疫複合化磁性微粒子を調製した。
その結果、粒子径が小さくなるに従い、発光量が小さく反応性が低いことが確認された。つまり、粒子径が小さいほうが、酵素免疫複合化時に、より少ない量の酵素標識抗体しか複合化できなかったということを示している。
銀の酸化電流ピーク値は、粒子径が小さくなるに従い高い値を示した。これは粒子径が小さい方がより多くの銀を検出部である感知部電極(作用極)に沈着させられていることを示している。
Claims (11)
- 分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーとを反応させ、被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、不溶化反応を実施することによって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させ、前記感知部に沈殿させた不溶性物質を電気的に分析する方法であって、
選択的相互作用を示す特異的パートナーが微粒子上に固相化されていることを特徴とする、分析方法。 - 前記感知部表面が、電気信号の授受を妨げる物質で覆われていない、請求項1に記載の分析方法。
- 不溶化反応および電気的な分析を行う際に、前記感知部表面と前記微粒子が直接接触する、請求項1又は2に記載の分析方法。
- 前記微粒子が非導電性物質である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記微粒子が磁性微粒子である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分析方法。
- 分析対象物質と、微粒子上に固相化された特異的パートナーとの前記反応が複合体形成部で行われ、前記不溶化反応が感知部上で行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記微粒子の大きさが3μm以下である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記可溶性物質が銀イオンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分析方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の分析方法に使用する装置であって、
分析対象物質と、微粒子上に固相化された特異的パートナーとを反応させる複合体形成部と、前記感知部とを有する装置。 - 前記複合体形成部と前記感知部が別体である、請求項9に記載の装置。
- 前記微粒子を捕捉可能な磁力体を有する、請求項9又は10に記載の装置。
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