CN110132915A

CN110132915A - 一种聚集诱导发光探针及双重检测重金属离子污染物的方法

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Publication number: CN110132915A
Application number: CN201910390312.0A
Authority: CN
Inventors: 唐本忠; 高蒙; 黄乐滔
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110132915B

Abstract

本发明属于荧光检测的技术领域，公开了一种聚集诱导发光探针及双重检测重金属离子污染物的方法。聚集诱导发光探针的结构式为式I。所述双重检测重金属离子污染物的方法：将发光细菌在含上述聚集诱导发光探针以及重金属离子的溶液中培养，发光细菌富集溶液中重金属离子，探针荧光探测发光细菌富集的重金属离子，实现重金属离子的双重检测。本发明的探针在水溶液中几乎不发出荧光。当其与发光细菌联用时，探针选择性“点亮”检测发光细菌内富集的重金属离子，具有高信噪比的优点，且荧光强度与重金属离子浓度呈线性关系，可定量分析重金属离子浓度。

Description

一种聚集诱导发光探针及双重检测重金属离子污染物的方法

技术领域

本发明属于荧光检测的技术领域，涉及一种具有聚集诱导发光性质的荧光探针及其与发光细菌法协同，用于双重检测重金属离子污染物。

背景技术

重金属离子可以通过食物链富集，对人类的健康造成极大威胁。近年来，随着我国工农业的迅速发展，大量含汞离子的废水排入河流以及湖泊中，造成巨大的危害。现阶段的水质毒性检测技术大体上可以分为两类，即生物毒性检测法和化学分析法。发光细菌法作为一种水质毒性的生物检测技术，具有快速、灵敏性高、简洁方便、价廉等优点，已广泛应用于污水、工业废水、饮用水等方面的毒性检测。发光细菌在高浓度下具有群体感应效应，在荧光素酶催化下，可将还原态的黄素单核苷酸及八碳以上长链脂肪醛(如十二烷醛)氧化为黄素单核苷酸及长链脂肪酸，同时发出明亮的蓝绿光(450～490nm)。在一定条件下发光细菌的发光强度是恒定的，与外来受试物接触后，其发光强度将有所改变，在一定浓度范围内，有毒物浓度大小与发光细菌发光强度变化成一定比例关系，用发光检测仪测出它与待测物作用前后的光强变化，就可以推算出综合毒性的大小。但是，水环境经常是多组分的污染物质混合发生拮抗、加和或协同作用的复杂性污染。该方法虽然能够检测生物接触性的总毒性，但是选择性差，重复性差，而且相对于“点亮”检测模式，“猝灭”检测模式不利于观测和分析。

与发光细菌法相比，基于荧光探针的化学分析方法灵敏度高、选择性强，但大多数传统荧光探针仅适于稀溶液中检测，这是由于它们在生物系统中局部富集后存在聚集猝灭发光效应(ACQ)。与具有ACQ性质的探针相反，聚集诱导发光(AIE)探针在稀溶液中几乎不发光，但在聚集状态下发光。这种独特的发光行为使得AIE探针在生物传感方面具有广阔的应用前景。因此，将发光细菌法与荧光探针分析方法相结合，可以实现双重检测，具有准确度高等明显优势。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种聚集诱导发光探针。本发明的AIE探针具有稀溶液中发光弱、聚集态发光效率高、生物相容性好、斯托克位移大、易于保存和使用等优点，与发光细菌法协同，可通过分子内运动受限和离子取代协同作用，点亮检测发光细菌内富集的重金属离子(如：汞离子)，具有高信噪比等优点。

本发明的另一目的在于提供一种双重检测重金属离子污染物的方法。本发明将上述AIE探针应用于检测重金属离子污染物，通过与发光细菌法协同检测重金属离子，特别是汞离子，AIE探针可选择性“点亮”检测明亮发光杆菌内富集的重金属离子，具有高信噪比的优点，且在一定浓度范围内荧光强度与重金属离子浓度呈线性关系，可定量分析重金属离子浓度。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种聚集诱导发光探针(基于分子内运动受限和离子取代协同作用机制的荧光检测探针)，其结构式为式I：

R¹，R²，R³，R⁴独立的为氢、C_1-18烷基、卤素、C_1-18烷基氧基、C_1-18烷基硫基、芳基、杂芳基；R⁵，R⁷，R⁸，R⁹独立的为C_1-30烷基；R⁶为C_1-6亚烷基；X^–为阴离子，包括卤离子、高氯酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、六氟磷酸根离子等。

R¹，R²，R³，R⁴独立的优选为氢、C_1-6烷基、卤素、C_1-6烷基氧基、C_1-6烷基硫基，更优选为氢；R⁵，R⁷，R⁸，R⁹独立的优选为C_1-6烷基，更有选为甲基；R⁶为C_2-6亚烷基，更有选为-CH₂CH₂-；X–优选为卤素离子，更有选为碘离子。

所述聚集诱导发光探针，优选为：2-((4-氰基-1-(4-(二苯基氨基)苯基)-9-氧-9H-茚并[2,1-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)-N,N,N-碘化三甲基乙胺，其结构为式(I-1)：

所述聚集诱导发光探针的制备方法，包括以下步骤：将式II化合物与式III化合物在有机溶剂反应，后续处理，获得聚集诱导发光探针，其结构式为式I；

所述式II化合物的结构为所述式III化合物的结构为X-R⁹，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，R⁹，X^–如上述聚集诱导发光探针的式I所定义。

所述式II化合物：式III化合物的摩尔比为1：(1～2)。

所述反应温度为15～50℃，优选为室温；所述反应时间为5～20小时，优选为10小时。

所述有机溶剂为乙醇、甲醇、四氢呋喃等有机溶剂，优选为四氢呋喃。

所述后续处理是指产物进行过滤、洗涤、干燥；

所述干燥温度为20～60℃。

所述聚集诱导发光探针在检测重金属离子中的应用，实现重金属离子的双重检测。

一种双重检测重金属离子污染物的方法，包括以下步骤：

将发光细菌在含上述聚集诱导发光探针以及重金属离子的溶液中培养，发光细菌富集溶液中重金属离子，聚集诱导发光探针荧光探测发光细菌富集的重金属离子，实现重金属离子的双重检测。

溶液中重金属离子的浓度为0-100μM，聚集诱导发光探针的用量为5-100μM，发光细菌的浓度为1×10⁴-1×10⁸个/mL。

所述发光细菌为明亮发光杆菌；所述重金属离子为汞离子、银离子、铅离子、锌离子、镍离子、钴离子、镉离子、铜离子、锰离子、钙离子、铁离子、镁离子、钯离子中一种以上，优选为汞离子。

本发明中发光细菌在重金属离子溶液中培养，重金属离子在发光细菌体内进行富集，利用重金属离子对明亮发光杆菌的毒性，破坏群体感应效应，猝灭发光细菌的生物发光；由于本发明的AIE探针对重金属离子的选择性结合能力以及聚集诱导发光特性，会重新点亮检测已发生生物发光猝灭的明亮发光杆菌内富集的重金属离子。该方法可有效检测生物体内富集的重金属离子所造成的危害，比单独的生物发光猝灭的方法或荧光检测方法，具有明显优势。本发明的方法能够定量分析重金属离子浓度。

本发明的具有AIE性质的式I化合物在水溶液中，由于分子内运动和扭曲的分子内电荷转移过程，几乎不发出荧光，当其进入明亮发光杆菌内部后，通过结合重金属离子形成聚集体，抑制分子内运动和扭曲的分子内电荷转移过程，同时利用金属离子和聚集诱导发光探针中阴离子X^-(如：碘离子)形成络合物，进一步解除阴离子X^-(如：碘离子)对荧光的猝灭效应，从而“点亮”检测明亮发光杆菌内富集的重金属离子。

本发明所述的AIE探针可选择性“点亮”检测明亮发光杆菌内富集的重金属离子，具有高信噪比的优点，且在一定浓度范围内荧光强度与重金属离子浓度呈线性关系，可定量分析重金属离子浓度。

本发明的聚集诱导发光探针制备的反应方程式为：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明的AIE探针与发光细菌法协同双重检测重金属离子，具有操作简便、准确度高等优点，荧光强度与重金属离子浓度呈线性关系，可定量分析重金属离子浓度；有利于评价发光细菌体内的重金属离子造成的危害。

2)本发明的AIE探针在水溶液中几乎不发出荧光，仅在发光细菌内部结合重金属离子后才发出明亮荧光，背景干扰小，检测信噪比高。

3)本发明的AIE探针制备容易。

附图说明

图1(A)为化合物II-1在四氢呋喃中的归一化紫外-可见吸收光谱图(10μM)以及化合物II-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图；(B)为化合物II-1在四氢呋喃和水的混合溶液中，随水含量变化的最大荧光发射强度的比值变化图；(C)为化合物II-1的HOMO和LUMO分子轨道图；(D)为化合物II-1在固态和溶液态的荧光寿命曲线；

图2为化合物II-1在四氢呋喃和水的体积比为1:99的混合溶液中的粒径分布图；

图3(A)为AIE探针I-1在二甲基亚砜溶液中(10μM)的紫外-可见吸收光谱图；(B)为AIE探针I-1在二甲基亚砜和甲苯的混合溶液中(10μM)随甲苯含量变化的荧光发射光谱图；

图4(A)为AIE探针I-1在固态和溶液态(10μM)荧光发射光谱图；(B)为AIE探针I-1在固态和溶液态的荧光寿命曲线图；(C)为AIE探针I-1的HOMO和LUMO分子轨道图；

图5(A)中图A-1为化合物II-1的单晶的明场照片(上)和紫外光照射下的荧光照片(下)，图A-2为分子结构示意图，图A-3为堆积图；(B)中图B-1为荧光AIE探针I-1的单晶的明场照片(上)和紫外光照射下的荧光照片(下)，图B-2为分子结构示意图，图B-3为堆积图；

图6为化合物I-1-Hg在固态和溶液态的荧光发射光谱图；

图7中(A)为明亮发光杆菌在不同浓度的探针I-1下的生长曲线图；(B)为明亮发光杆菌在不同浓度的氯化汞存下的生长曲线图；

图8中(A)为明亮发光杆菌的生物发光光谱随不同浓度氯化汞(0-8.0μM)的变化图；(B)为明亮发光杆菌在480nm处的生物发光强度随不同浓度(0-8.0μM)氯化汞的变化图；内图为不加汞离子与加汞离子的生物发光照片；(C)为AIE探针I-1(10μM)与不同浓度(0-8.0μM)的氯化汞加入明亮发光杆菌溶液后，AIE探针I-1的荧光发射光谱图(10μM)；(D)为AIE探针I-1(10μM)与不同浓度(2.0-8.0μM)的氯化汞加入明亮发光杆菌溶液后，AIE探针I-1的最大荧光发射强度的比值变化图；λ_ex＝415nm，内部方程为线性回归方程；

图9中A，B分别为明亮发光杆菌自身的明场(A)和荧光(B)照片；C，D分别为加入氯化汞(10μM)孵育2h后，明亮发光杆菌的明场(C)和荧光照片(D)；E，F分别为加入AIE探针I-1(10μM)孵育2h后，明亮发光杆菌的明场(E)和荧光(F)照片；G，H分别为加入AIE探针I-1(10μM)和氯化汞(10μM)孵育2h后，明亮发光杆菌的明场(G)和荧光照片(H)；

图10为荧光AIE探针I-1在明亮发光杆菌中，不同金属离子存在下的荧光发射光谱图(A)以及在590nm处的荧光强度的比值变化图(B)；图中“probeonly”是指AIE探针自身。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

化合物II-1、聚集诱导发光探针I-1(AIE探针I-1)和化合物I-1-Hg的合成：

(1)3-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-1-(4-(二苯基氨基)苯基)-9-氧-9H-茚并[2,1-c]吡啶-4-腈(II-1)的合成：

将4-(二苯基氨基)苯甲醛(273mg,1.0mmol)，1,3-(二氰基亚甲基)茚-1-酮(194mg,1.0mmol)和N,N,N′-三甲基乙二胺(402μL，4.0mmol)溶于10mL乙腈中，反应在装有干燥管的冷凝管下60℃回流12h，产生了橙红色固体，停掉反应，待反应恢复至室温后，过滤，用乙腈洗涤滤渣，烘干滤渣，得到橙红色固体产物3-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-1-(4-(二苯基氨基)苯基)-9-氧-9H-茚并[2,1-c]吡啶-4-腈(即化合物II-1)(247mg，产率45％)。¹H NMR(CDCl₃,500MHz):δ8.45(d,J＝7.5Hz,1H),7.89(d,J＝9.0Hz,2H),7.71(d,J＝7.0Hz,1H),7.60(t,J＝7.5Hz,1H),7.52(t,J＝7.5Hz,1H),7.30(t,J＝8.5Hz,4H),7.20(d,J＝7.5Hz,4H),7.11-7.05(m,4H),4.00(d,J＝6.0Hz,2H),3.56(s,3H),2.71(s,2H),2.33(s,6H)；¹³C NMR(CDCl₃,125MHz):δ188.1,161.1,159.5,158.5,150.3,147.0,138.4,135.7,134.0,132.1,131.4,129.5,129.1,125.6,124.0,123.7,123.4,120.2,118.0,114.8,81.8,56.6,50.6,45.6,39.9,30.3；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd forC₃₆H₃₂N₅O,550.2607；found,550.2605。

(2)荧光探针2-((4-氰基-1-(4-(二苯基氨基)苯基)-9-氧-9H-茚并[2,1-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)-N，N，N-碘化三甲基乙胺(I-1)的合成：

将化合物II-1(275mg，0.5mmol)溶于20mL四氢呋喃中，室温条件下加入碘甲烷(62μL，1.0mmol)，反应10h，析出黄色沉淀，停掉反应，加两滴吡啶猝灭多余的碘甲烷，过滤，用四氢呋喃洗涤滤渣，烘干滤渣(40℃)，得到纯的黄色固体产物2-((4-氰基-1-(4-(二苯基氨基)苯基)-9-氧-9H-茚并[2,1-c]吡啶-3-基)(甲基)氨基)-N，N，N-碘化三甲基乙胺(即聚集诱导发光探针I-1)(304mg，产率88％)。¹H NMR(DMSO-d₆,500MHz):δ8.37(d,J＝9.0Hz,1H),7.87(d,J＝10Hz,2H),7.79(d,J＝9.0Hz,1H),7.70(s,2H),7.40(t,J₁＝18Hz,J₂＝9.0Hz,4H),7.16(t,J₁＝24Hz,J₂＝8.5Hz,6H),6.94(d,J＝10.0Hz,2H),4.25(s,2H),3.59(s,5H),3.15(s,9H)；¹³C NMR(DMSO-d₆,125MHz):δ187.0,160.0,158.8,157.6,149.7,146.3,137.6,134.9,134.6,132.8,131.6,129.8,128.4,125.4,124.4,123.7,122.8,119.1,117.3,114.5,82.4,67.0,61.0,52.7,45.8；HRMS(ESI):m/z[M–I]⁺calcd for C₃₇H₃₄N₅O,564.2758；found,564.2757。

(3)化合物I-1-Hg的合成：

将化合物I-1(10mg，0.014mmol)，氯化汞(3.9mg，0.014mmol)溶于2.8mL甲醇中，室温搅拌1小时，析出白色沉淀，离心收集沉淀即得化合物I-1-Hg。

本实施例中化合物II-1、聚集诱导发光探针I-1和化合物I-1-Hg的结构：

实施例2：化合物II-1，I-1，I-1-Hg的光物理性质表征

化合物II-1的光物理性质表征：

将四氢呋喃和水按照不同的体积比(四氢呋喃:水＝100:0，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，40:60，30:70，20:80，10:90,1:99)混合，形成含水量不同的混合液，将化合物II-1溶解到这些混合液中，使化合物的浓度为10μM。化合物II-1在四氢呋喃中的归一化紫外-可见吸收光谱图以及化合物II-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图如图1(A)所示；化合物II-1在四氢呋喃和水的混合溶液中，随水含量变化的最大荧光发射强度的比值变化图如图1(B)所示。化合物II-1的HOMO和LUMO分子轨道图如图1(C)所示。化合物II-1在固态和溶液态的荧光寿命曲线如图1(D)所示。化合物II-1在四氢呋喃和水的体积比为1:99的混合溶液中的粒径分布图如图2所示。

图1(A)为化合物II-1在四氢呋喃中的归一化紫外-可见吸收光谱图以及化合物II-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图；(B)为化合物II-1在四氢呋喃和水的混合溶液中，随水含量变化的最大荧光发射强度的比值变化图；(C)为化合物II-1的HOMO和LUMO分子轨道图；(D)为化合物II-1在固态和溶液态的荧光寿命曲线。

图2为化合物II-1在四氢呋喃和水的体积比为1:99的混合溶液中的粒径分布图。

从图1A和B可知，化合物II-1在四氢呋喃和水的混合溶液中，在f_w＝0-70％范围内，随水含量其荧光强度逐渐下降。这是由于其具有典型的电子给体-受体(D-A)结构，随溶液极性增加，基于扭曲的分子内电荷转移(TICT)效应造成荧光发射强度逐渐下降。基于密度泛函理论，通过理论计算验证了典型的D-A结构特征，结果见图1C。从图1C可知，化合物II-1的最高占据分子轨道(HOMO)位于三苯胺基单元，而最低未占据分子轨道(LUMO)位于2-氮杂芴酮单元。当水含量大于70％时，化合物II-1分子的溶解性下降，发生聚集并形成纳米粒子，其平均水合粒径为129.9nm(图2)，通过限制分子内运动，其荧光发射强度迅速增加。与溶液态相比，化合物II-1在固态下的寿命从1.04ns增加至4.12ns即增加了3.96倍(图1D)。这些实验结果表明化合物II-1具有典型的聚集诱导发光性质。

化合物I-1(AIE探针I-1)的光物理性质表征：

将二甲基亚砜和甲苯按照不同的体积比(二甲基亚砜:甲苯＝100:0，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，40:60，30:70，20:80，10:90，1:99)混合，形成含甲苯含量不同的混合液，将化合物I-1溶解到这些混合液中使化合物的浓度为10μM。图3(A)为AIE探针I-1在二甲基亚砜溶液中的紫外-可见吸收光谱图；(B)为AIE探针I-1在二甲基亚砜和甲苯的混合溶液中随甲苯含量变化的荧光发射光谱图。

从图3A和B可知，当不断增加混合溶液体系中的甲苯含量时，荧光发射强度急剧增高，这是由于溶解度降低导致聚集体生成，分子内运动受限，表现出聚集诱导发光性质。

图4(A)为AIE探针I-1在固态和溶液态(10μM)荧光发射光谱图；(B)为AIE探针I-1在固态和溶液态的荧光寿命曲线图；(C)为AIE探针I-1的HOMO和LUMO分子轨道图。

从图4A可知，荧光AIE探针I-1探针可以分散在水溶液，发出非常微弱的荧光，其在固态时荧光强度明显增强。从图4B可知，化合物I-1在薄固态，荧光寿命增加了2.61倍。从图4C可知，荧光AIE探针I-1的最高占据分子轨道(HOMO)位于三苯胺基单元，而最低未占据分子轨道(LUMO)位于2-氮杂芴酮单元。

通过测量化合物II-1,I-1和I-1-Hg在溶液中和固态(薄膜态)的量子产率和荧光寿命，测试结果见表1。表1为化合物II-1，AIE探针I-1和化合物I-1-Hg在溶液态和固态的光物理数据。

表1化合物II-1，AIE探针I-1和化合物I-1-Hg在溶液态和固态的光物理数据

从表1以及图1D和图4B发现相对于在溶液中，化合物II-1在薄膜态的量子产率增加了2.82倍，荧光寿命增加了3.96倍(图1D)；化合物I-1在薄膜态的量子产率增加了6.00倍，荧光寿命增加了2.61倍(图4B)；化合物I-1-Hg在薄膜态的量子产率增加了5.56倍，荧光寿命增加了2.79倍。

图5(A)中图A-1为化合物II-1的单晶的明场照片(上)和紫外光照射下的荧光照片(下)，图A-2为分子结构示意图，图A-3为堆积图；(B)中图B-1为荧光AIE探针I-1的单晶的明场照片(上)和紫外光照射下的荧光照片(下)，图B-2为分子结构示意图，图B-3为堆积图。从图5中可知，多种分子间相互作用力C–H···N,C–H···O,C–H···π,π-π和C–H···Cl有效限制了分子内运动，使得II-1和I-1在固态下发光明显增强，这些证实了化合物II-1，I-1和I-1-Hg的聚集诱导发光性质。而且化合物II-1,I-1和I-1-Hg在薄膜态的斯托克位移均大于160nm，远优于传统的荧光材料(斯托克位移通常小于40nm)，非常有利于其在生物成像中的应用。

实施例3：化合物I-1-Hg在溶液和固态的发射光谱检测

图6为化合物I-1-Hg在固态和溶液态的荧光发射光谱图。如图6所示，化合物I-1-Hg在水溶液和固态的荧光发射光谱检测结果显示，在水溶液中发光很弱，但在固态下发光明显增强，表明化合物I-1-Hg可以很好地分散于水溶液中，由于分子内运动和扭曲的分子内电荷转移机制，导致荧光猝灭，但在固态由于分子内运动受限、扭曲的分子内电荷转移过程受到抑制，且碘离子可以与汞离子形成碘化汞络合物，解除碘离子对荧光的猝灭效应，协同增强化合物I-1-Hg在固态的荧光。

实施例4：AIE探针I-1和氯化汞的生物毒性检测

将培养好的明亮发光杆菌用PBS洗一遍，再用3％的氯化钠稀释至4×10⁷CFUmL-¹，然后在96孔板中加入稀释好的明亮发光杆菌菌液，加入不同浓度的AIE探针I-1和氯化汞，在18℃，200rpm摇床中培养24小时，每隔2小时在酶标仪上测一次600nm处的吸收值，结果如图7。图7中(A)为明亮发光杆菌在不同浓度的探针I-1下的生长曲线图；(B)为明亮发光杆菌在不同浓度的氯化汞存下的生长曲线图。从图7可知，AIE探针I-1对于明亮发光杆菌无明显的毒副作用，而氯化汞随浓度增加，对明亮发光杆菌的生长具有明显的抑制作用。

实施例5：汞离子检测

将培养好的明亮发光杆菌用PBS洗一遍，再用3.0％的氯化钠稀释至4.0×10⁷CFUmL-¹，取990μL明亮发光杆菌菌液加入10μL不同含量(0-8.0μM)氯化汞，用移液枪吹打均匀，用BioTech多功能酶标仪测定生物发光。测试结果如图8(A)、(B)所示。

将10μL实施例1制备的荧光AIE探针I-1的DMSO(1.0mM)母液加入990μL含有不同含量(0-8.0μM)氯化汞的明亮发光杆菌菌液中，用移液枪吹打均匀，用Tecan 200酶标仪测定荧光(激发波长415nm)。测试结果如图8(C)、(D)所示。

图8中(A)为明亮发光杆菌的生物发光光谱随不同浓度氯化汞(0-8.0μM)的变化图；(B)为明亮发光杆菌在480nm处的生物发光强度随不同浓度(0-8.0μM)氯化汞的变化图；内图为不加汞离子与加汞离子的生物发光照片；(C)为AIE探针I-1(10μM)与不同浓度(0-8.0μM)的氯化汞加入明亮发光杆菌溶液后，AIE探针I-1的荧光发射光谱图；(D)为AIE探针I-1(10μM)与不同浓度(2.0-8.0μM)的氯化汞加入明亮发光杆菌溶液后，AIE探针I-1的最大荧光发射强度的比值变化图；λ_ex＝415nm，内部方程为线性回归方程。

从图8(A)和(B)可知，随汞离子浓度增加，明亮发光杆菌的生物发光强度明显降低。从图8(C)和(D)可知，荧光AIE探针I-1进入被汞离子损伤的细菌内部聚集，由于其分子内运动受到限制以及碘离子的取代实现对汞离子的点亮。

图9中A，B分别为明亮发光杆菌自身的明场(A)和荧光(B)照片；C，D分别为加入氯化汞(10μM)孵育2h后，明亮发光杆菌的明场(C)和荧光照片(D)；E，F分别为加入AIE探针I-1(10μM)孵育2h后，明亮发光杆菌的明场(E)和荧光(F)照片；G，H分别为加入AIE探针I-1(10μM)和氯化汞(10μM)孵育2h后，明亮发光杆菌的明场(G)和荧光照片(H)。

从图9可知，仅加入汞离子或AIE探针I-1时，明亮发光杆菌内都没有光致荧光信号，而且同时当入加汞离子和AIE探针I-1时，明亮发光杆菌内在405nm激光照射下发出强荧光，表明AIE探针I-1可以点亮检测明亮发光杆菌内富集的汞离子(单独加入汞离子，明亮发光杆菌的生物发光会被猝灭，只是采用发光杆菌只能以生物发光猝灭的方式检测重金属离子，难以定量分析；单独的AIE探针在水溶液中不能与汞离子有效结合，所以单独的AIE探针不能直接检测重金属离子(汞离子)的浓度，只有当AIE探针进入发光细菌内部后，在发光细菌内的受限空间内，由于受限空间造成的富集效应，才能有效与汞离子结合进而点亮AIE探针的光致荧光)。

实施例6：AIE探针I-1检测特异性

将10μL实施例1制备的AIE探针I-1的DMSO(1mM)母液加入990μL含有不同金属离子(如：Hg²⁺,Cu²⁺,Ag⁺,Pb²⁺,Pd²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Ni²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Fe³⁺,Co²⁺)的明亮发光杆菌菌液中，用移液枪吹打均匀，用Tecan 200酶标仪测定荧光(激发波长415nm)。测试结果如图10所示。图10为荧光AIE探针I-1在明亮发光杆菌中，不同金属离子存在下的荧光发射光谱图(A)以及在590nm处的荧光强度的比值变化图(B)。图中“probe only”是指AIE探针自身。荧光强度比值是指在明亮发光杆菌中，不同水溶性金属离子中荧光AIE探针I-1在590nm处的荧光强度与I-1在水中的荧光强度的比值。

从图10可知，该探针对于Hg²⁺具有很好的识别效果，对于Cu²⁺，Ag⁺，Pb²⁺，Pd²⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Fe³⁺，Co²⁺的响应则很弱，这是由于汞离子的溶度积常数(2.90×10-²⁹)远小于其他离子络合物的溶度积常数。

本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种聚集诱导发光探针，其特征在于：其结构式为式I：

R¹，R²，R³，R⁴独立的为氢、C_1-18烷基、卤素、C_1-18烷基氧基、C_1-18烷基硫基、芳基、杂芳基；R⁵，R⁷，R⁸，R⁹独立的为C_1-30烷基；R⁶为C_1-6亚烷基；X^–为阴离子，包括卤离子、高氯酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、六氟磷酸根离子。

2.根据权利要求1所述聚集诱导发光探针，其特征在于：R¹，R²，R³，R⁴独立的为氢、C_1-6烷基、卤素、C_1-6烷基氧基、C_1-6烷基硫基；R⁵，R⁷，R⁸，R⁹独立的为C_1-6烷基；R⁶为C_2-6亚烷基；X^–为卤素离子。

3.根据权利要求2所述聚集诱导发光探针，其特征在于：R¹，R²，R³，R⁴独立的为氢；X^–为碘离子。

4.根据权利要求1所述聚集诱导发光探针，其特征在于：其结构为式I-1：

5.根据权利要求1～4任一项所述聚集诱导发光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式II化合物与式III化合物在有机溶剂反应，后续处理，获得聚集诱导发光探针，其结构式为式I；

所述式II化合物的结构为所述式III化合物的结构为X-R⁹，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷，R⁸，R⁹，X^–如权利要求1所定义。

6.根据权利要求5所述聚集诱导发光探针的制备方法，其特征在于：所述式II化合物：式III化合物的摩尔比为1：(1～2)；

所述反应温度为15～50℃；所述反应时间为5～20小时；

所述有机溶剂为乙醇、甲醇、四氢呋喃中一种以上；

所述后续处理是指产物进行过滤、洗涤、干燥。

7.根据权利要求1～4任一项所述聚集诱导发光探针在检测重金属离子中的应用。

8.一种双重检测重金属离子污染物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

将发光细菌在含聚集诱导发光探针以及重金属离子的溶液中培养，发光细菌富集溶液中重金属离子，聚集诱导发光探针荧光探测发光细菌富集的重金属离子，实现重金属离子的双重检测；

所述聚集诱导发光探针如权利要求1～4任一项所定义。

9.根据权利要求8所述双重检测重金属离子污染物的方法，其特征在于：所述发光细菌为明亮发光杆菌；所述重金属离子为汞离子、银离子、铅离子、锌离子、镍离子、钴离子、镉离子、铜离子、锰离子、钙离子、铁离子、镁离子、钯离子中一种以上。

10.根据权利要求9所述双重检测重金属离子污染物的方法，其特征在于：

所述重金属离子为汞离子。