CN110123833A - 一种关节镜手术用灌流液及其制备方法 - Google Patents

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龚啸元
黄杨
李剑
郭林
陈诚
王富友
陈光兴
杨柳
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Abstract

本发明涉及一种关节镜手术用灌流液及其制备方法，属于医药技术领域，该灌流液由医用氯化钙和生理盐水组成，灌流液中医用氯化钙的浓度为1.8‑6mM，该灌流液组成简单，易于制备，成本低，适于工业化生产，将该灌洗液用于关节镜手术中，能够抑制软骨细胞的凋亡，提升软骨细胞的存活率。

Description

一种关节镜手术用灌流液及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种关节镜手术用灌流液及其制备方法。
背景技术
关节镜手术，包括膝、髋、踝、肩关节镜手术，是骨科与运动医学临床常用的，以纠正关节腔内病变为目的的微创治疗手段。目前术中常规使用无菌生理盐水对手术关节腔进行灌流，用于解决关节腔中视野狭小，术中出血干扰手术视野等问题。但长时间的手术治疗，如前交叉韧带重建术等导致关节软骨细胞长期处于单纯生理盐水的非生理环境中，容易导致术中软骨细胞活性下降、凋亡等副作用，影响术后疗效。因此，急需一种能够抑制关节软骨细胞凋亡，提升软骨细胞的存活率的关节镜手术用灌流液。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种关节镜手术用灌流液；目的之二在于提供一种关节镜手术用灌流液的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种关节镜手术用灌流液，所述灌流液由医用氯化钙和生理盐水组成，所述灌流液中医用氯化钙的浓度为1.8-6mM。
优选的，所述灌流液中医用氯化钙的浓度为4mM。
优选的，所述生理盐水的浓度为0.9％。
优选的，所述灌流液的pH值为6.9-7.5。
2、所述的一种关节镜手术用灌流液的制备方法，所述方法具体为：将分析纯氯化钠加入注射用水中，配制浓度为0.9％的生理盐水，随后将医用氯化钙加入所述生理盐水中，充分搅拌溶解后经过滤、封装、灭菌，即可。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种关节镜手术用灌流液及其制备方法，该灌流液组成简单，易于制备，成本低，适于工业化生产，将该灌洗液用于关节镜手术中，能够抑制软骨细胞的凋亡，提升软骨细胞的存活率。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为胞外钙离子浓度对软骨细胞存活率影响测试结果图；(A为各组第二代软骨细胞染色图；B为各组第二代软骨细胞体外培养活细胞比例统计图)
图2为实施例1中关节镜手术用灌流液对软骨细胞活性影响测试结果图；(A为各时间点各软骨组织块中软骨细胞染色图；B均化后软骨组织中活细胞比例统计图)
图3为实施例1中关节镜手术用灌流液对软骨细胞表型相关基因表达影响测试结果图。(A为实验组和对照组中软骨标志基因acan的表达量测试结果图；B为实验组和对照组中软骨标志基因col2a1的表达量测试结果图；C为实验组和对照组中软骨标志基因sox9的表达量测试结果图)
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
一种关节镜手术用灌流液，该灌流液由医用氯化钙和生理盐水组成，灌流液中医用氯化钙的浓度为4mM，所用的生理盐水的浓度为0.9％，该灌流液的pH值为7，灌流液按如下方法制备：
在20℃下，将分析纯氯化钠加入注射用水中，配制浓度为0.9％的生理盐水，随后将医用氯化钙加入该生理盐水中至医用氯化钙的浓度为4mM，充分搅拌溶解后经过滤、封装、灭菌，即可。
实施例2
一种关节镜手术用灌流液，该灌流液由医用氯化钙和生理盐水组成，灌流液中医用氯化钙的浓度为1.8mM，所用的生理盐水的浓度为0.9％，该灌流液的pH值为6.9，灌流液按如下方法制备：
在20℃下，将分析纯氯化钠加入注射用水中，配制浓度为0.9％的生理盐水，随后将医用氯化钙加入该生理盐水中至医用氯化钙的浓度为2mM，充分搅拌溶解后经过滤、封装、灭菌，即可。
实施例3
一种关节镜手术用灌流液，该灌流液由医用氯化钙和生理盐水组成，灌流液中医用氯化钙的浓度为6mM，所用的生理盐水的浓度为0.9％，该灌流液的pH值为7.5，灌流液按如下方法制备：
在20℃下，将分析纯氯化钠加入注射用水中，配制浓度为0.9％的生理盐水，随后将医用氯化钙加入该生理盐水中至医用氯化钙的浓度为6mM，充分搅拌溶解后经过滤、封装、灭菌，即可。
(1)测试胞外钙离子浓度对软骨细胞存活率的影响
以11-13月龄健康猪膝关节软骨原代软骨细胞为样品，于无菌环境下经软骨破碎、二型胶原蛋白酶消化、离心、过滤获得，将该原代软骨细胞置于37℃，5％CO2条件下扩增培养至第二代进行实验，将第二代软骨细胞分别置于：1、DMEM培养基(含10％胎牛血清、1％双抗和1.8mM氯化钙)中(标记为实验组)；2、含有10μM钙离子螯合剂EGTA的DMEM培养基(含10％胎牛血清、1％双抗和1.8mM氯化钙)中(标记为EGTA组)；3、含有10μM T型电压门控钙离子通道拮抗剂NNC-55-0396的DMEM培养基(含10％胎牛血清、1％双抗和1.8mM氯化钙)中(标记为NNC-55-0396组)，均于37℃，5％CO2条件下培养48h，然后使用钙黄绿素-AM/PI对各组第二代软骨细胞活性进行检测与分析，结果如图1所示，图1中A为各组第二代软骨细胞染色图，图1中B为各组第二代软骨细胞体外培养活细胞比例统计图，由图1可知，当软骨细胞培养于不含钙离子的环境(EGTA组)中，细胞凋亡比例明显上升(P***<0.001)。通过使用NNC-55-0396对处于含有1.8mM钙离子环境中的软骨细胞进行处理后，发现细胞活性同样显著降低(P***<0.001)，接近于EGTA组(P>0.05)。可知，软骨细胞若处于无钙离子环境中，或T型电压门口钙离子通道出现失活，都会导致软骨细胞凋亡，而通过添加外源性钙离子，则能够有效防止长时间关节镜手术操作引发的软骨细胞凋亡。
(2)测试实施例1中关节镜手术用灌流液对软骨细胞活性的影响
以全膝关节置换术中取材的股骨髁关节软骨为样品，于无菌环境中使用取样器对未退变区域关节软骨进行直径为2mm的圆柱形软骨组织块取材。随后立即将软骨组织块分别置于实施例1中的灌流液(标记为实验组)和浓度为0.9％的生理盐水(标记为对照组)中均于37℃，5％CO2条件下培养，然后于0，1，2，3小时使用钙黄绿素-AM/PI对各软骨组织块中软骨细胞活性进行检测与分析，结果如图2所示，图2中A为各时间点各软骨组织块中软骨细胞染色图，图2中B均化后软骨组织中活细胞比例统计图，由图2可知，相较于浓度为0.9％的生理盐水，实施例1中的灌流液能够在2小时内显著抑制软骨细胞凋亡(P*<0.05，n＝6)。
(3)测试实施例1中关节镜手术用灌流液对软骨细胞表型相关基因表达的影响
以全膝关节置换术中取材的股骨髁关节软骨为样品，于无菌环境中使用取样器对未退变区域关节软骨进行直径为2mm的圆柱形软骨组织块取材。随后立即将软骨组织块分别置于实施例1中的灌流液(标记为实验组)和浓度为0.9％的生理盐水(标记为对照组)中均于37℃，5％CO2条件下培养，然后于0，1小时使用组织匀浆机对各软骨组织块进行低温破碎，并使用Mini Kit对各软骨组织块中总RNA进行提取，随后使用QuantiTectSYBR Green PCR试剂盒进行RT-qPCR检测，结果如图3所示，图3中A为实验组和对照组中软骨标志基因acan的表达量测试结果图，图3中B为实验组和对照组中软骨标志基因col2a1的表达量测试结果图，图3中C为实验组和对照组中软骨标志基因sox9的表达量测试结果图，由图3可知，相较于浓度为0.9％的生理盐水，实施例1中的灌流液能够在1小时内显著抑制软骨细胞蛋白多糖(acan)表达下降(P**<0.01，n＝6)，可以减轻透明软骨细胞向纤维软骨养细胞转变，而软骨标志基因col2a1、sox9的表达无显著差异。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种关节镜手术用灌流液，其特征在于，所述灌流液由医用氯化钙和生理盐水组成，所述灌流液中医用氯化钙的浓度为1.8-6mM。
2.如权利要求1所述的一种关节镜手术用灌流液，其特征在于，所述灌流液中医用氯化钙的浓度为4mM。
3.如权利要求1或2所述的一种关节镜手术用灌流液，其特征在于，所述生理盐水的浓度为0.9％。
4.如权利要求1或2所述的一种关节镜手术用灌流液，其特征在于，所述灌流液的pH值为6.9-7.5。
5.权利要求1-4任一项所述的一种关节镜手术用灌流液的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：将分析纯氯化钠加入注射用水中，配制浓度为0.9％的生理盐水，随后将医用氯化钙加入所述生理盐水中，充分搅拌溶解后经过滤、封装、灭菌，即可。
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