CN110117637B - 一种大蒜叶枯病抗性鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大蒜叶枯病抗性鉴定方法：采用中等抗性的品种为对照品种与待鉴定品种的鳞芽进行穿刺接种大蒜叶枯病菌孢子悬浮液，然后保湿培养。培养后采用十字交叉法测量病斑直径并按照计算发病严重度，根据发病严重度对待测品种的叶枯病抗性进行评价：抗病，严重度≤1.1；中抗，1.1＜严重度≤1.2；感病，严重度＞1.2。本发明提供的方法，鉴定结果客观，操作简便、不需要特别技术，该方法占用空间小，实验室内即能完成，并且环境条件易于控制；且鉴定结果与田间抗病性表现一致，能够准确的反应大蒜品种对叶枯病的抗性水平。

Description

一种大蒜叶枯病抗性鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种大蒜抗病原菌能力鉴定的方法，具体涉及一种大蒜叶枯病抗性鉴定的方法，属于农业植物保护技术领域。
背景技术
大蒜叶枯病(garlic tip blight)是土传真菌性病害，有性阶段病原菌为子囊菌亚门枯叶格孢腔菌Pleospora，无性阶段为半知菌亚门匐柄霉Stemphylium，并以无性阶段侵染为主。该病是大蒜生产上常见的病害之一，由于耕作制度和栽培生态环境的不断变化，常常大面积发生，造成严重的经济损失。该病主要危害大蒜的叶或花梗，叶片染病多始于叶尖或叶的其他部位，初呈花白色小圆点，扩大后成不规则形或椭圆形灰白色或灰褐色病斑，其上生出黑色霉状物（即为病菌分生孢子梗及分生孢子），严重时病叶枯死；染病花梗易自病部折断，后期病部散生许多黑色小粒点，危害严重时不能正常抽薹。大蒜生长期间降水次数多、雨量大的年份发病重。发病严重时常造成病叶枯死、植株早衰、蒜头减产、蒜苔霉烂，直接影响产量。
选用抗病品种是防治大蒜叶枯病的一项重要措施。目前，大蒜叶枯病抗性鉴定方法有田间发病调查法（包括田间自然发病和接种发病）和叶片离体接种法等。田间发病调查法可以直观的反应大蒜品种的叶枯病抗性，但是该方法环境条件可控性较差，并且耗时较长；叶片离体接种法虽然条件可控性强、耗时短，但是对鉴定人员专业性要求较高。另外，两种鉴定方法发病程度分级均以病斑面积或变色叶片面积占叶片面积的比例为依据，鉴定结果易受调查人员经验和人为主观因素影响。因此，需要建立一种操作简便、可靠性高的室内大蒜叶枯病抗性鉴定方法。
发明内容
针对目前缺乏简便快捷可靠的大蒜叶斑病抗性鉴定方法的问题，本发明提供一种大蒜叶枯病抗性鉴定方法，可室内进行，操作简便、可靠性高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种大蒜叶枯病抗性鉴定方法，包括以下步骤：
（1）培养大蒜叶枯病菌，获得病原菌孢子并制备孢子悬浮液；
（2）挑选大小一致、无伤口、无病斑的待鉴定品种与对照品种的鳞芽（蒜瓣），消毒处理后备用；
（3）病原菌接种：对待鉴定品种与对照品种的鳞芽进行穿刺接种，然后保湿培养；
（4）抗病性评价：培养结束后，将鳞芽取出，采用十字交叉法测量病斑直径并按照下式计算发病严重度：
严重度= 待测大蒜病斑直径/ 对照品种病斑直径；
根据发病严重度对待测大蒜品种的叶枯病抗性进行评价：
抗病，严重度≤1.1；
中抗，1.1＜严重度≤1.2；
感病，严重度＞1.2。
步骤（1）中，所述孢子悬浮液的浓度为0.8-1.0×106个/mL。
步骤（1）中，所述病原菌的培养基选自马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、大蒜琼脂培养基（GA）、马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA）；优选为马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA）。
所述PCA培养基的制备方法如下：取新鲜去皮马铃薯200 g、新鲜胡萝卜200 g，切成小块，加1000 mL蒸馏水，煮沸10-20 min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000 mL。加入琼脂粉8-10 g，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20min。
步骤（2）中，所述对照品种叶枯病抗性田间表现为抗病；如，徐蒜6号，在田间自然发病情况下病情指数在抗病品种属于中等。
步骤（2）中，所述消毒处理方法如下：用1%浓度的NaClO溶液浸泡2分钟后无菌水冲洗3次。
步骤（3）中，所述接种针的直径为小于1mm；可以为实心针或空心针，如普通注射器针头或者采血针。所述接种深度为3-5 mm。
步骤（3）中，所述培养条件为20℃，相对湿度90%。所述培养时间为15-30天。
作为优选，步骤（3）中，每瓣鳞芽上穿刺2-3个互不交叉的接种点。进一步的，多个接种点均位于鳞芽不同的面上。
作为优选，所述鳞芽的数量为每个品种不少于3瓣。
本发明具有以下优点：
本发明提供的方法，鉴定结果客观，发病严重度由量取的病斑直径确定，不受人为主观因素影响。同时，本方法操作简便，仅需针刺接种后人工气候箱培养30天后调查病斑直径，不需要特别技术。另外，该方法占用空间小，实验室内即能完成，并且环境条件易于控制。最后，本方法的鉴定结果准确，与田间抗病性反应一致，能够准确的反应大蒜品种对叶枯病的抗性水平。
附图说明
图1是大蒜叶枯病菌室内接种鳞芽后发病情况；
图2是12个大蒜品种抗性鉴定结果聚类分析图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
本实施例中对针刺接种鳞芽能够进行室内大蒜叶枯病菌抗性鉴定进行了可行性测定，方法如下：
（1）病原菌分离和准备：从田间采集大蒜叶枯病典型症状叶片，带回实验室后按组织分离法分离病菌，并按照柯赫氏法则回接验证；然后于室内接种前两周，在PCA平板上25℃培养叶枯病菌孢子；再将培养好的叶枯病菌平板用无菌水冲洗，获得孢子悬浮液，并将孢子悬浮液浓度稀释到1.0×106个/mL左右；
（2）待接种品种准备：将大蒜品种“徐蒜6号”分瓣，去皮。挑选大小均匀、无伤口、无病斑的鳞芽10个，用1%浓度的NaClO溶液浸泡2分钟后无菌水冲洗3次，置于灭菌培养皿晾干；
（3）病原菌接种与鳞芽处理：用；注射器针头蘸取孢子悬浮液，针刺接种大蒜鳞芽，每个鳞芽接种2孔，接种5瓣，接种深度为5mm；CK注射器针头蘸取无菌水。将接种后的大蒜鳞芽置于人工气候箱，设置培养温度20℃、湿度90%；
（4）发病情况调查：大蒜鳞芽室内针刺接种叶枯病菌结果如图1所示：叶枯病菌通过针刺接种可以侵染大蒜鳞芽，侵染造成圆形或椭圆形灰黑色病斑。
实施例2
采用实施例1的方法，接种“徐蒜6号”、“中牟大蒜”和“玉林白蒜”3个大蒜品种。每个品种接种蒜瓣15个，每个蒜瓣接种2孔，分为3个重复。培养30天后，将蒜瓣取出。采用十字交叉法测量病斑直径并以“徐蒜6号”为对照品种计算发病严重度：
严重度=待测大蒜病斑直径÷对照品种病斑直径。
表1 3品种大蒜叶枯病室内抗性鉴定结果与田间发病情况
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
大蒜品种叶枯病抗性鉴定结果如表1所示。品种“徐蒜6号”的平均病斑直径为4.28mm，严重度为1.00；“中牟大蒜”的平均病斑直径为5.54，严重度为1.29；玉林白蒜的平均病斑直径为6.28，严重度为1.47；
2018年春季大蒜叶枯病田间自然发病情况调查结果如表1所示：“徐蒜6号”、“中牟大蒜”和“玉林白蒜”的病情指数分别为55.56%、71.56%和80.89%。以上结果说明本发明的室内接种获得的病斑大小规律与其田间自然发病情况一致。
实施例3
（1）取新鲜去皮马铃薯200 g、新鲜胡萝卜200 g，切成小块，加1000 mL蒸馏水，煮沸10-20 min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000 mL。加入琼脂粉8-10 g，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20min，获得PCA培养基；
室内接种前两周，在PCA平板上25℃培养叶枯病菌孢子；再将培养好的叶枯病菌平板用无菌水冲洗，获得孢子悬浮液，并将孢子悬浮液浓度稀释到1.0×106个/mL左右；
（2）挑选大小一致、无伤口、无病斑的待鉴定的11个大蒜品种与“徐蒜6号”的鳞芽，用1%浓度的NaClO溶液浸泡2分钟后无菌水冲洗3次后备用；
（3）病原菌接种：将30G采血针沾取孢子悬浮液，对待鉴定品种与“徐蒜6号”的鳞芽进行针刺接种，每瓣鳞芽上在不同面接种一次，共2个接种点，每处理15瓣鳞芽，3重复，每接种1个品种换一个针头，接种深度为5mm，然后每个重复放入一个培养皿于20℃，相对湿度90%条件下培养30天；
（4）抗病性评价：培养结束后，将鳞芽取出，采用十字交叉法测量病斑直径并按照下式计算发病严重度：
严重度= 待测大蒜病斑直径/ 对照品种病斑直径；
根据发病严重度对待测大蒜品种的叶枯病抗性进行评价：
抗病，严重度≤1.1；
中抗，1.1＜严重度≤1.2；
感病，严重度＞1.2。
表2 12个大蒜品种的抗性分析结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
12个待测大蒜品种的叶枯病抗性分析结果如表2所示：徐蒜3号、徐蒜6号和徐州白蒜的发病严重度在0.96-1.02之间，小于1.1属于抗病；草塬大蒜和金乡红皮的发病严重度在1.10-1.15之间，属于中抗；日本久松光、徐蒜815、隆尧紫皮蒜、商南黑皮蒜、新疆天山蒜、恩施白蒜和冻冻青等7个品种的病斑发展较大、发病严重度高，在1.21-1.30之间，属于感病品种。将12个品种的发病严重度用欧氏距离法计算品种间的距离，以组间平均连接法进行聚类分析，结果如图2所示：参试的11个大蒜品种可以分为3类，其中“徐蒜3号”、“徐蒜6号”和“徐州白蒜”3个品种病斑直径最低，被划分为抗病；草塬大蒜和金乡红皮为中抗；其他7个品种为感病，其结果与室内抗性评价结果一致。

Claims (10)

1.一种大蒜叶枯病抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养大蒜叶枯病菌，获得病原菌孢子并制备孢子悬浮液；
（2）挑选大小一致、无伤口、无病斑的待鉴定品种与对照品种的鳞芽，消毒处理后备用；
（3）病原菌接种：对待鉴定品种与对照品种的鳞芽进行穿刺接种，然后保湿培养；
（4）抗病性评价：培养结束后，将鳞芽取出，采用十字交叉法测量病斑直径并按照下式计算发病严重度：
严重度=待测大蒜病斑直径/对照品种病斑直径；
根据发病严重度对待测大蒜品种的叶枯病抗性进行评价：
抗病，严重度≤1.1；
中抗，1.1＜严重度≤1.2；
感病，严重度＞1.2；
步骤（2）中，所述对照品种为叶枯病抗性田间表现为抗病的品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述孢子悬浮液的浓度为(0.8-1.0)×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述病原菌的培养基选自马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基、大蒜琼脂培养基、马铃薯胡萝卜琼脂培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述病原菌的培养基为马铃薯胡萝卜琼脂培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述对照品种为徐蒜6号。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述消毒处理方法如下：用1%浓度的NaClO溶液浸泡2分钟后无菌水冲洗3次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述接种针的直径小于1mm；所述接种深度为3-5mm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，每瓣鳞芽上穿刺2-3个互不交叉的接种点；多个接种点均位于鳞芽不同的面上。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培养条件为20℃，相对湿度90%；所述培养时间为15-30天。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鳞芽的数量为每个品种不少于3瓣。
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