CN110106106A - 复合微生物菌剂及其在草莓种植中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种复合微生物菌剂，其包括地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌、奥尔森氏菌、红蝽菌和解淀粉芽孢杆菌。还提供了用于制备该复合微生物菌剂的方法以及该复合微生物菌剂在草莓种植中的应用。本发明的复合微生物菌剂可以实现对草莓根部病原菌明显抑制和降解的作用，同时对草莓的生长和物质代谢也具有明显的正向影响及促进作用，可以大大促进草莓果实品质的提高。

Description

复合微生物菌剂及其在草莓种植中的应用

技术领域

本发明属于微生物及农业技术领域，涉及复合微生物菌剂制备与应用，具体涉及用于解决草莓栽培管理中的多种问题的复合微生物菌剂及其制备和应用方法。

背景技术

草莓，蔷薇科草莓属的一种多年生草本果树，色泽艳丽，香气浓郁，营养价值高，被誉为“水果皇后”，是最受消费者喜爱的一类低糖、低热量浆果。近年来，我国草莓产业发展迅速，据统计，2017年我国草莓种植面积230万亩，总产量460万吨，总产值600亿元，小草莓已然形成了大产业。但由于草莓栽培管理过程中为了片面追求高产而过量施用化学肥料和化学农药，导致我国草莓种植区域连作障碍日趋明显，连作障碍的直接后果是死苗率达到50％以上，产量和品质急剧下降，有些地区几乎绝收，造成严重的经济损失。目前，生产上最常用的是化学药剂消毒的方法来防治草莓连作障碍，虽然化学药剂消毒能杀死连作土中的有害微生物，但同时也杀死了土壤中有益微生物，从而破坏作物根际微生物种群的动态平衡，造成土壤结构遭到破坏且对环境产生二次污染的不良影响，同时还会导致草莓植株生长不良或出现弱株，效果并不理想。

现已公开了的一些以微生物发酵液为主要成分的农用复合微生物菌剂产品，例如：CN 102424635 B和CN 108504598 A等。这些发明为在草莓种植管理中解决由于重茬种植所引起的草莓根部土传性病害，改善草莓生长的土壤环境，提高草莓种植中的栽种成活率，以及提高草莓果实品质等方面都带来了明显的效果。但是现有的技术方案，如上所列举的两种，均存在以下技术缺陷。首先产品发酵过程较长，一般需要5～10天的生产周期。在使用中多用于农作物栽种前的土壤准备期。而在类似草莓等植物的生长管理期中较难应用，进而对草莓生长的过程的改善，对草莓产量和果实品质的影响微弱。因此亟需新型技术能克服上述缺陷。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，发明人经过不断的改进和反复试验，发明人终于发现，含有如下菌种：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、奥尔森氏菌(Olsenella)、红蝽菌(Coriobacterium)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等菌种的复合菌液对草莓根部病原菌有明显抑制和降解作用，同时对草莓的生长和物质代谢有明显的正向影响及促进作用，可以大大促进草莓果实品质的提高。

因此，在本发明的第一方面，提供了复合微生物菌剂，其包括地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌、奥尔森氏菌、红蝽菌和解淀粉芽孢杆菌。

在一些优选实施方案中，本发明的复合微生物菌剂包括地衣芽孢杆菌≥0.4×10⁶CFU/ml，丁酸梭菌≥0.4×10⁸CFU/ml，乳酸杆菌≥0.4×10⁸CFU/ml，奥尔森氏菌≥0.4×10⁶CFU/ml，红蝽菌≥0.4×10⁶CFU/ml，和解淀粉芽孢杆菌≥0.4×10⁶CFU/ml。

在一些实施方案中，本发明的复合微生物菌剂还包括有机酸。优选为，所述有机酸包括选自由甲酸、乙酸和/或乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。

在一些实施方案中，在本发明的复合微生物菌剂中存在时，甲酸含量为1.0～6.0mmol/L，乙酸含量为1.0～6.0mmol/L，以及乳酸含量为2.0～6.0mmol/L。

在本发明的第二方面，提供了本发明的复合微生物菌剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备复合菌种A：将地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌、奥尔森氏菌、红蝽菌菌种在厌氧发酵营养液中搅拌均匀，发酵得到复合菌种A；

(2)制备复合菌液B：将步骤(1)中制备得到的复合菌种A在厌氧发酵营养液中搅拌均匀，发酵得到复合菌液B；

(3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液：将解淀粉芽孢杆菌菌种接种于培养基中，培养得到解淀粉芽孢杆菌菌液；

(4)将步骤(2)中制备的复合菌液B与步骤(3)中制备的解淀粉芽孢杆菌菌液相混合得到所述复合微生物菌剂。

在一些实施方案中，培养解淀粉芽孢杆菌菌液包括：①将解淀粉芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于NA固体培养基上，恒温培养后待用；②将上述经固体培养的解淀粉芽孢杆菌菌种接种于NB液体培养基中，振荡培养得到解淀粉芽孢杆菌菌液。

在本发明的第三方面，提供了本发明的复合微生物菌剂在草莓种植中的应用。

在一些实施方案中，在土壤准备阶段应用本发明的复合微生物菌剂，包括：在土壤中施放了一定量的有机底肥并翻耕后，将复合微生物菌剂稀释后得到的复合微生物菌剂稀释液浇灌于土壤中。

在一些实施方案中，在生长阶段应用本发明的复合微生物菌剂，包括：每间隔1～3周，将复合微生物菌剂稀释后得到的复合微生物菌剂稀释液对草莓实施根部滴灌。

本发明提供了一种着重解决草莓种植过程中的根部病害，和提高草莓果实品质的复合微生物菌剂及其制备和应用方法。在多种菌株混合后，通过严格控温、控氧、基质调控以及对发酵液酸碱度控制等手段，筛选富集健康土壤新陈代谢和植物生长代谢所需的好氧-兼气-厌氧生态菌群和次生代谢产物。发酵所得到的复合微生物菌剂发酵液中除富含多种土壤益生菌外，还含多种有益酶、菌体蛋白、氨基酸、有机酸以及其它复合微生物共代谢产物。本发明的复合微生物菌剂通过大量有活性的、协同作用能力强的好氧、厌氧及兼性厌氧复合微生物菌群的作用，可以高效地重构原始土壤所具有的好氧-兼性厌氧-厌氧生态微循环，快速激活土壤微生物区系，恢复土壤健康环境，降解重茬残根和毒素，促进分解与合成作物生长所需的养分，以达到抑制草莓等植物所感染的土传病虫害等目的。

除了抵御草莓生长中的根部病害外，本发明的复合微生物菌剂还可以方便地应用于草莓生长管理的其它阶段，从而有效地解决长期防治根系病害，促进根系和植株健康生长，明显提高草莓果实品质等效果。

具体实施方式

应理解，本文公开的方法的不同应用可以根据本领域的具体需求而改变。还应理解，本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案，而不是意图进行限制。

本发明提供了复合微生物菌剂，其包括地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、奥尔森氏菌(Olsenella)、红蝽菌(Coriobacterium)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。可以用于本发明的微生物菌的来源没有特别限制，例如可以商购从市场上获得。

当在本发明中使用时，术语“地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)”是指一种革兰氏阳性的嗜热细菌，在土壤中常见。地衣芽孢杆菌无毒，能分泌出活性强的蛋白质分解酵素，用以快速地分解水中的有机氮化物，亦能分解其它有机物，在水质净化上能担任重要的分解角色。

当在本发明中使用时，术语“丁酸梭菌(Clostridium butyricum)”是指是一种梭状芽孢杆菌，也称为丁酸菌、酪酸梭菌、酪酸菌、宫入菌，分类归属于梭菌属，为革兰氏阳性厌氧杆菌。

当在本发明中使用时，术语“乳酸杆菌(Lactobacillus)”是指是一类杆状或球状的革兰氏阳性菌，可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)并产生大量乳酸，在自然界分布广泛，是动物和人肠道等处重要的生理性菌群之一。该类群细菌绝大多数对动物和人无毒、无害，负担着动物体内重要的生理功能。在乳酸菌中，乳酸杆菌是最大的一个属。在本发明的复合微生菌剂中可以包含任一种、两种或更多种乳酸杆菌。在本文中述及乳酸杆菌含量时指一种、两种或更多种乳酸杆菌的总含量。

当在本发明中使用时，术语“奥尔森氏菌(Olsenella)”是指一类厌氧革兰氏阳性菌，也称为欧陆森氏菌。在本发明的复合微生菌剂中可以包含任一种、两种或更多种奥尔森氏菌。在本文中述及奥尔森氏菌含量时指一种、两种或更多种奥尔森氏菌的总含量。

当在本发明中使用时，术语“红蝽菌(Coriobacterium)”是指一类放线菌，为非运动性的革兰氏阳性菌，通常栖息在萤火虫(Pyrrhocoris apterus)的胃肠道中。在本发明的复合微生菌剂中可以包含任一种、两种或更多种红蝽菌。在本文中述及红蝽菌含量时指一种、两种或更多种红蝽菌的总含量。

当在本发明中使用时，术语“解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)”是指芽孢杆菌属中的一种细菌，是BamH1限制酶的来源。解淀粉芽孢杆菌用于农业、水产养殖和水培，以对抗根病原体以及提高对盐胁迫的根耐受性，此外，还被认为是促进生长的根际细菌，具有快速定殖根的能力。

当在本发明中使用时，在复合微生物菌剂中，地衣芽孢杆菌的含量为≥0.4×10⁶CFU/ml，优选为≥0.6×10⁶CFU/ml，更优选为≥0.8×10⁶CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁶CFU/ml。丁酸梭菌的含量为≥0.4×10⁸CFU/ml，优选为≥0.6×10⁸CFU/ml，更优选为≥0.8×10⁸CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁸CFU/ml。乳酸杆菌的含量为≥0.4×10⁸CFU/ml，优选为≥0.6×10⁸CFU/ml，更优选为≥0.8×10⁸CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁸CFU/ml。奥尔森氏菌的含量为≥0.4×10⁶CFU/ml，优选为≥0.6×10⁶CFU/ml，更优选为≥0.8×10⁶CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁶CFU/ml。红蝽菌的含量为≥0.4×10⁶CFU/ml，优选为≥0.6×10⁶CFU/ml，更优选为≥0.8×10⁶CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁶CFU/ml。解淀粉芽孢杆菌的含量为≥0.4×10⁶CFU/ml，优选为≥0.6×10⁶CFU/ml，更优选为≥0.8×10⁶CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁶CFU/ml。

在本发明的复合微生物菌剂中还可以包括有机酸成分。可以用在本发明的复合微生物菌剂中的有机酸一般为C1-C8的一元、二元或更多元的有机酸，其上可任选地具有一个、两个或更多个取代基，例如羟基、氨基、卤素等。在优选的实施方案中，所述有机酸是任选地具有一个、两个或更多个取代基的C1-C4的一元、二元或更多元的有机酸，例如但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、乳酸等。在优选的实施方案中，所述有机酸包括选自由甲酸、乙酸和/或乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。

当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，每一种有机酸的含量为1.0～12.0mmol/L，优选为1.0～10.0mmol/L，更优选为1.0～8.0mmol/L，最优选为1.0～6.0mmol/L。在具体的实施方案中，当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，甲酸的含量为1.0～10.0mmol/L，优选为1.0～8.0mmol/L，更优选为1.0～6.0mmol/L，再更优选为1.0～4.0mmol/L，例如1.0～3.2mmol/L。当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，乙酸的含量为1.0～10.0mmol/L，优选为1.0～8.0mmol/L，更优选为1.0～6.0mmol/L，再更优选为1.0～4.0mmol/L，例如1.6～3.5mmol/L。当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，乳酸的含量为1.0～10.0mmol/L，优选为1.0～8.0mmol/L，更优选为2.0～6.0mmol/L，再更优选为3.0～6.0mmol/L，例如3.0～5.5mmol/L。当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，有机酸的总含量为1.0～20.0mmol/L，优选为1.0～18.0mmol/L，更优选为1.0～16.0mmol/L，最优选为1.0～14.0mmol/L。

本发明提供了复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)制备复合菌种A；(2)制备复合菌液B；(3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液；(4)将步骤(2)中制备的复合菌液B与步骤(3)中制备的解淀粉芽孢杆菌菌液相混合得到本发明的复合微生物菌剂。

在步骤(1)中，将商购获得的地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌、奥尔森氏菌、红蝽菌菌种接入厌氧发酵营养液中搅拌均匀。在本文中，菌种的加入量以每100L发酵营养液中加入的菌种重量(g)计算，例如5％表示每100L发酵营养液中接入5g菌种。地衣芽孢杆菌以4～6％的量接入，优选为4.2～5.8％，更优选为4.4～5.6％，再更优选为4.6～5.4％，最优选为4.8～5.2％，例如4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％，或上述范围内的任意数值。丁酸梭菌以6.5～8.5％的量接入，优选为6.7～8.3％，更优选为6.9～8.1％，再更优选为7.1～7.9％，最优选为7.3～7.7％，例如7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％，或上述范围内的任意数值。乳酸杆菌以14.5～16.5％的量接入，优选为14.7～16.3％，更优选为14.9～16.1％，再更优选为15.1～15.9％，最优选为15.3～15.7％，例如15.3％、15.4％、15.5％、15.6％、15.7％，或上述范围内的任意数值。奥尔森氏菌以14.0～16.0％的量接入，优选为14.2～15.8％，更优选为14.4～15.6％，再更优选为14.4～15.6％，再更优选为14.6～15.4％，最优选为14.8～15.2％，例如14.8％、14.9％、15.0％、15.1％、15.2％，或上述范围内的任意数值。红蝽菌以3.0～5.0％的量接入，优选为3.2～4.8％，更优选为3.4～4.6％，再更优选为3.4～4.6％，再更优选为3.6～4.4％，最优选为3.8～4.2％，例如3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％，或上述范围内的任意数值。

在发酵容器内，温度通常保持在30～40℃，优选为32～38℃，更优选为34～36℃，例如为34℃、35℃或36℃，或上述范围内的任意数值。发酵时间通常为60～84小时，优选为64～80小时，更优选为68～76小时，最优选为70～74小时，例如70、71、72、73和74小时，或上述范围内的任意数值。此外，还可以通过发酵容器内的pH值和氧化还原电位值来判断发酵是否完成。例如当发酵容器内pH＝4.5～5.0，且氧化还原电位值(ORP)达到-100～-200mV，即可认为发酵已完成。

在步骤(1)中使用的用于制备复合菌种A的厌氧发酵营养液可以是本领域中常用的厌氧发酵营养液，其中通常包括但不限于选自以下组的组分：糖蜜、氢氧化钠、碳酸氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙、碳酸钙，以及纯净水。

当在本发明的用于制备复合菌种A的厌氧发酵营养液中使用时，上述组分的含量可以相互独立地如下所示，其中组分含量以重量份计：纯净水15000～20000重量份，糖蜜3000～5000重量份，氢氧化钠180.0～220.0重量份，碳酸氢铵50.0～70.0重量份，磷酸二氢钾0.6～1.0重量份，磷酸氢二钾0.6～1.0重量份，硫酸镁1.0～1.5重量份，硫酸亚铁0.4～0.6重量份，硫酸锰0.20～0.30重量份，氯化钙0.15～0.20重量份，碳酸钙80～120重量份。在一些具体实施方案中，上述组分的具体含量可以相互独立地如下所示：纯净水16000重量份，例如16L；糖蜜4000重量份，例如4kg；氢氧化钠200重量份，例如200g；碳酸氢铵64重量份，例如64g；磷酸二氢钾0.8重量份，例如0.8g；磷酸氢二钾0.8重量份，例如0.8g；硫酸镁1.3重量份，例如1.3g；硫酸亚铁0.5重量份，例如0.5g；硫酸锰0.25重量份，例如0.25g；氯化钙0.16重量份，例如0.16g；以及碳酸钙100重量份，例如100g。

所述用于制备复合菌种A的厌氧发酵营养液按以下制备：将组成成分混合搅拌均匀，加热至100℃并持续煮沸4～6分钟，例如5分钟后注入厌氧发酵容器内，冷却至30～40℃，优选为32～38℃，更优选为34～36℃，例如34℃、35℃或36℃，或上述范围内的任意数值。

在发酵完成以后，在所制得的复合菌种A中活菌菌群总数≥10.0×10⁸CFU/ml，其中作为优势菌种的菌群数量各自独立地为：地衣芽孢杆菌≥1.0×10⁸CFU/ml，优选为≥1.2×10⁸CFU/ml，更优选为≥1.4×10⁸CFU/ml，最优选为≥1.6×10⁸CFU/ml；丁酸梭菌≥2.5×10⁸CFU/ml，优选为≥2.7×10⁸CFU/ml，更优选为≥2.9×10⁸CFU/ml，最优选为≥3.1×10⁸CFU/ml；乳酸杆菌≥2.5×10⁸CFU/ml，优选为≥2.7×10⁸CFU/ml，更优选为≥2.9×10⁸CFU/ml，最优选为≥3.2×10⁸CFU/ml；奥尔森氏菌≥0.5×10⁸CFU/ml，优选为≥0.7×10⁸CFU/ml，更优选为≥0.9×10⁸CFU/ml，最优选为≥1.1×10⁸CFU/ml；红蝽菌≥0.4×10⁸CFU/ml，优选为≥0.6×10⁸CFU/ml，更优选为≥0.6×10⁸CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁸CFU/ml。在所制得的复合菌种A中还可以包含其他非优势菌种，其中优势菌种所占菌群总数的比例≥60％。

在步骤(2)中，将步骤(1)中制备的复合菌种A接入厌氧发酵营养液中搅拌均匀，其中将pH调节至6.5～8.0，优选为7.0～7.5，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，或上述范围内的任意数值。

在发酵容器内，温度通常保持在34～42℃，优选为36～40℃，更优选为38℃。发酵时间通常为8～12小时，优选为9～11小时，更优选为10小时。此外，还可以通过发酵容器内的pH值和氧化还原电位值来判断发酵是否完成。例如当发酵容器内pH＝5.0～5.5，且氧化还原电位值(ORP)达到-100～-200mV，即可认为发酵已完成。

在步骤(2)中使用的厌氧发酵营养液可以是本领域中常用的厌氧发酵营养液，其中通常包括但不限于选自以下组的组分：糖蜜(优选为糖蜜的含糖量≥45％)、氢氧化钠、碳酸氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙，以及纯净水。

当在本发明的用于制备复合菌液B的厌氧发酵营养液中使用时，上述组分的含量可以相互独立地如下所示：纯净水900～1100重量份，糖蜜100～140重量份，氢氧化钠0.9～1.1重量份，碳酸氢铵3.0～3.8重量份，磷酸二氢钾0.2～0.6重量份，磷酸氢二钾0.2～0.6重量份，硫酸镁0.085～0.095重量份，硫酸亚铁0.24～0.25重量份，硫酸锰0.01～0.015重量份，氯化钙0.004～0.008重量份。在一些具体实施方案中，上述组分的具体含量可以相互独立地如下所示：纯净水1000重量份，例如1000L；糖蜜120重量份，例如120kg；氢氧化钠1重量份，例如1kg；碳酸氢铵3.4重量份，例如3.4kg；磷酸二氢钾0.4重量份，例如0.4kg；磷酸氢二钾0.4重量份，例如0.4kg；硫酸镁0.088重量份，例如88g；硫酸亚铁0.245重量份，例如245g；硫酸锰0.013重量份，例如13g；氯化钙0.006重量份，例如6g。

所述用于制备复合菌液B的厌氧发酵营养液按以下制备：将组成成分混合搅拌均匀，加热至100℃并持续煮沸4～6分钟，例如5分钟后注入厌氧发酵容器内，冷却至30～45℃，优选为32～42℃，更优选为36～40℃，例如36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，或上述范围内的任意数值。

在发酵完成以后，在所制得的复合菌液B中活菌菌群总数≥2.0×10⁸CFU/ml，其中作为优势菌种的菌群数量各自独立地为：地衣芽孢杆菌≥0.7×10⁶CFU/ml，优选为≥0.8×10⁶CFU/ml，更优选为≥0.9×10⁶CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁶CFU/ml；丁酸梭菌≥0.7×10⁸CFU/ml，优选为≥0.8×10⁸CFU/ml，更优选为≥0.9×10⁸CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁸CFU/ml；乳酸杆菌≥0.7×10⁸CFU/ml，优选为≥0.8×10⁸CFU/ml，更优选为≥0.9×10⁸CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁸CFU/ml；奥尔森氏菌≥0.7×10⁶CFU/ml，优选为≥0.8×10⁶CFU/ml，更优选为≥0.9×10⁶CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁶CFU/ml；红蝽菌≥0.7×10⁶CFU/ml，优选为≥0.8×10⁶CFU/ml，更优选为≥0.9×10⁶CFU/ml，最优选为≥1.0×10⁶CFU/ml。在所制得的复合菌液B中还可以包含其他非优势菌种，其中优势菌种所占菌群总数的比例≥60％。

在经过步骤(2)的发酵以后，在所得的复合菌液B中还可以包括有机酸成分。所述有机酸一般为C1-C8的一元、二元或更多元的有机酸，其上可任选地具有一个、两个或更多个取代基，例如羟基、氨基、卤素等。在优选的实施方案中，所述有机酸是任选地具有一个、两个或更多个取代基的C1-C4的一元、二元或更多元的有机酸，例如但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、乳酸等。在优选的实施方案中，所述有机酸包括选自由甲酸、乙酸和/或乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。

当在所得的复合菌液B中存在时，每一种有机酸的含量为1.0～12.0mmol/L，优选为1.0～10.0mmol/L，更优选为1.0～8.0mmol/L，最优选为1.0～6.0mmol/L。在具体的实施方案中，当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，甲酸的含量为1.0～10.0mmol/L，优选为1.0～8.0mmol/L，更优选为1.0～6.0mmol/L，再更优选为1.0～4.0mmol/L，例如1.0～3.2mmol/L。当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，乙酸的含量为1.0～10.0mmol/L，优选为1.0～8.0mmol/L，更优选为1.0～6.0mmol/L，再更优选为1.0～4.0mmol/L，例如1.6～3.5mmol/L。当在本发明的复合微生物菌剂中存在时，乳酸的含量为1.0～10.0mmol/L，优选为1.0～8.0mmol/L，更优选为2.0～6.0mmol/L，再更优选为3.0～6.0mmol/L，例如3.0～5.5mmol/L。当在所得的复合菌液B中存在时，有机酸的总含量为1.0～20.0mmol/L，优选为1.0～18.0mmol/L，更优选为1.0～16.0mmol/L，最优选为1.0～14.0mmol/L。

在步骤(3)中，制备解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌液。首先将解淀粉芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于NA固体培养基上。在本发明中使用时，所述NA固体培养基代表加葡萄糖的营养琼脂培养基。所述NA固体培养基可以使用本领域中常用的固体培养基，其中可以包括但不限于选自以下组的一种或更多种成分：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、琼脂，和/或其他可用于菌种培养的成分，例如氯化钠。在一些实施方案中，优选的NA固体培养基成分为：葡萄糖2.5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，琼脂18g/L，pH 7.0～7.2。培养温度通常保持恒温在28～32℃，例如28℃、29℃、30℃、31℃和32℃，或上述范围内的任意数值。培养时长通常为70～74小时，例如70、71、72、73和74小时，或上述范围内的任意数值。

其次，将经固体培养基培养的解淀粉芽孢杆菌菌种接种于NB液体培养基中进行振荡培养。在本发明中使用时，所述NB液体培养基代表加葡萄糖的营养肉汤培养基。所述NB液体培养基可以使用本领域中常用的液体培养基，其中可以包括但不限于选自以下组的一种或更多种成分：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏，和/或其他可用于菌种培养的成分，例如氯化钠。在一些实施方案中，优选的NB液体培养基成分为：葡萄糖2.5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，pH7.0～7.2。在一些实施方案中，所述NB液体培养基在115℃～125℃的温度下灭菌25～35分钟。

将经固体培养基培养的解淀粉芽孢杆菌菌种以5.0％～10.0％，优选6.0％～9.0％，更优选为7.0％～8.0％，例如8.0％的接种量接种于NB液体培养基中。培养温度通常保持恒温在28～32℃，例如28℃、29℃、30℃、31℃和32℃，或上述范围内的任意数值。培养时长通常为22～26小时，例如22、23、24、25和26小时，或上述范围内的任意数值。振荡速度通常为180～220r/min，例如180、190、200、210和220r/min，或上述范围内的任意数值。

在发酵完成得到的解淀粉芽孢杆菌菌液中解淀粉芽孢杆菌≥1.4×10⁸CFU/ml，优选为≥1.6×10⁸CFU/ml，更优选为≥1.8×10⁸CFU/ml，最优选为≥2.0×10⁸CFU/ml。

在步骤(4)中，将步骤(2)制备的复合菌液B与步骤(3)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液相混合即得到本发明所述的复合微生物菌剂。所述复合菌液B和所述解淀粉芽孢杆菌菌液的混合比例通常为200:1～50:1，优选为160:1～70:1，更优选为140:1～80:1，最优选为120:1～80:1，例如120:1、110:1、100:1、90:1和80:1，或上述范围内的任意数值。

本发明提供了所述复合微生物菌剂在草莓种植中的应用。本发明的复合微生物菌剂可以在草莓种植的任意阶段进行施用以实现对草莓根部病原菌明显抑制和降解的作用，同时对草莓的生长和物质代谢也具有明显的正向影响及促进作用，可以大大促进草莓果实品质的提高。本专利所述复合生物菌剂产品具有各优势菌种间协同及互补性强，所得到的次生代谢产物丰富。本专利所述复合微生物菌剂产品的生产工艺方法简单，便于大规模生产操作。其中除解淀粉芽孢杆菌外，其它菌种均可混合发酵，且发酵时间较其它同类产品短，因而生产效率较高，综合生产成本较低。

例如可以在土壤准备阶段进行施用。在一些实施方案中，以每亩20L的用量，复合菌剂稀释200倍。在清除了上一茬的残根和杂草，施放了一定量的有机底肥并翻耕后，将复合菌剂稀释液浇灌于土壤中。在土壤表面覆盖塑料地膜，并将大棚密闭。记录地膜下15cm～20cm土壤的温度。当日平均温度累加至600℃时可掀去地膜。待土壤湿度达到栽种幼苗时即可实施草莓苗栽种。

例如可以在生长阶段进行施用。在一些实施方案中，每隔2周，以每亩10L的用量，稀释100倍对草莓实施根部滴灌。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合以下实施例，对本发明进一步地详细说明。应当理解，此处所描述的实施例仅仅用以解释本发明，而不是限定本发明。

实施例

下面通过本发明的实施案例对本发明的技术方案进行完整详细的描述。

在此所述的实施案例仅为本发明的部分实施例。基于本发明中的实施例，凡除本发明团队人员外的其他人在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范畴。

实施例1.复合微生物菌剂的制备

如下制备复合微生物菌剂：

(1)制备用于复合菌种A制备的厌氧发酵营养液：将纯净水16L、糖蜜4kg、氢氧化钠200g、碳酸氢铵64g、磷酸二氢钾0.8g、磷酸氢二钾0.8g、硫酸镁1.3g、硫酸亚铁0.5g、硫酸锰0.25g、氯化钙0.16g和碳酸钙100g相互混合为发酵营养液，将发酵营养液加热至100℃并持续煮沸5分钟后注入厌氧发酵容器内，冷却至35℃。

(2)制备复合菌种A：将地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌、奥尔森氏菌、红蝽菌菌种分别按照5％、7.5％、15.5％、15％、3.8％的比例接入厌氧发酵营养液中搅拌均匀，保持发酵容器内温度为35℃，发酵72小时，完成标准为pH＝4.5～5.0，发酵罐内氧化还原电位值(ORP)达到-100～-200mV。

(3)制备用于复合菌液B制备的厌氧发酵营养液：将纯净水1000L、糖蜜(含糖量≥45％)120kg、氢氧化钠1kg、碳酸氢铵3.4kg、磷酸二氢钾0.4kg、磷酸氢二钾0.4kg、硫酸镁88g、硫酸亚铁245g、硫酸锰13g和氯化钙6g相互混合为发酵营养液，将发酵营养液加热至100℃并持续煮沸5分钟后注入厌氧发酵容器内，待其冷却至38℃。

(4)制备复合菌液B：将步骤(1)中制备所得复合菌种A 10L接入厌氧发酵营养液中搅拌均匀，此时发酵液pH调至7.0～7.5，保持发酵容器内温度为38℃，发酵10小时，完成标准为pH＝5.0～5.5，发酵罐内氧化还原电位值(ORP)达到-100～-200mV。

(5)制备解淀粉芽孢杆菌菌液：

①将解淀粉芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于NA固体培养基上，恒温30℃培养

72小时待用，其中，NA固体培养基成分为：葡萄糖2.5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏

3g/L，琼脂18g/L，pH 7.0～7.2。

②取上述固体培养的菌种按8％的接种量接种于NB液体培养基中，于30℃，

200r/min条件下振荡培养24小时即为所需解淀粉芽孢杆菌菌液，此时所得到的解淀粉

芽孢杆菌菌液中解淀粉芽孢杆菌≥2.0×10⁸CFU/ml，其中如下制备NB液体培养基制备方

法为：将牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，加蒸馏水定容至1L，调pH值为7.0～

7.2，121℃灭菌30分钟后冷却。

(6)制备复合微生物菌剂：取步骤(2)所述方法制备的复合菌液B 100L与步骤(3)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液1L混合即得到复合微生物菌剂的最终产品。

经检测，在所制得的复合微生物菌剂最终产品中，活菌菌群总数≥2×10⁸CFU/ml，其中作为优势菌的菌种数量为：地衣芽孢杆菌≥1.0×10⁶CFU/ml，丁酸梭菌≥1.0×10⁸CFU/ml，乳酸杆菌≥1.0×10⁸CFU/ml，奥尔森氏菌≥1.0×10⁶CFU/ml，红蝽菌≥1.0×10⁶CFU/ml，其中主要优势菌群所占菌群总数的比例≥60％。其中还包括有机酸成分，其中甲酸含量为2.1mmol/L，乙酸含量为2.9mmol/L和乳酸含量为4.8mmol/L。

实施例2.复合微生物菌剂在防治草莓苗根腐病中的应用

草莓根腐病是由多种病原物和环境相互作用引起的一大类病害的总称。发病时由细小侧根或新生根开始，初出现浅红色褐色不规则的斑块，颜色逐渐变深呈暗褐色。随病害发展，所有根系迅速坏死变褐。地上部分是外叶叶缘发黄、变褐、坏死至卷缩，病株表现缺水状，逐渐向心发展至全株枯黄死亡。草莓根腐病植株根系比健康植株根系短小，颜色灰暗，地下部不定根大量死亡，新生根受到病原菌的侵害，生长稀疏。根部受害，吸收能力下降，又导致水分、无机物和营养物质不能正常输送，致使地上部弱小或整株青枯。草莓根腐病病情发展很快，一般自发病到植株死亡不超过一周。

试验目的：以本发明所述的新型农用复合微生物菌剂对草莓实施根施为主要手段，探索其在防治草莓根腐病中的作用。

实施地点：云南省昆明市西山区古莲社区草莓种植基地。

实施时间：2018年9～10月。

试验开始前，试验地共种植了三亩五个品种的草莓新苗。新苗栽种后即开始出现新苗因感染草莓根腐病而死苗的现象。本试验开始前，已经对所种植的草莓实施过恶霉灵、百菌清、复配中生菌素、农用链霉素等农药进行全田冲施。虽然不断实施补苗，但是还是没能制止住根腐病的发生和蔓延。每周都有约20％的草莓苗染病和坏死。

试验第一阶段，采用根据实施例1所制备的复合微生物菌剂对部分区块(试验组)的草莓地尝试救治。用量及用法为，10L/亩用量，稀释100倍灌根。一周后对试验组和相邻未施救的区块同样数量(200株)的样本苗进行试验效果的对照统计。其结果为，试验组，在这一周内有3株苗染病，0株苗死亡。对照组有18株苗染病，10株苗死亡。

试验第二阶段，对全部栽种区域实施了复合微生物菌剂的浇灌。用量用法仍旧沿用第一阶段的方案。一周后继续对全体试验区域进行观察，并抽取其中三个品种，每种仍旧随机选取200株草莓苗进行试验效果统计。其结果参见表1。

随后的第三周，仍旧沿用前两个阶段的实施方案继续对全部种植区域实施本发明的复合微生物菌剂的浇灌。然后对第一、二阶段所选取的4组试验区进行了试验效果统计。其结果参见表1。

在三个阶段的试验过程中，从对染病草莓植株的发展情况中，可以发现在对草莓种植地实施生物菌剂浇灌后，之前已经染病的植株基本上都发出了新的嫩芽，根部原先已经变黑褐色的病根开始由黑褐色变为黄色了，同时也出现了新的根长出来了。在复合微生物菌剂的作用下，到本次试验的第三周，染病植株对周边土壤和其它植株的传染和扩散现象也随之基本得到了控制。

试验结果数据与分析

表1.试验效果数据统计表

经过对试验的几个阶段的观察和对样本统计数据的分析中，可以得出了以下结论。本发明所述的新型农用复合微生物菌剂在防治草莓根腐病的应用中具有很明显的效果。多数染病植株都能在浇灌了本种微生物菌剂产品后缓解了病情的继续恶化。病株对周边土壤和其它植株的传染也被有效地控制住了。

实施例3.复合微生物菌剂在提高草莓果实品质中的应用效果

试验目的：以本发明的复合微生物菌剂对草莓实施根施为主要手段，探索其在促进草莓植株在生长中自身物质代谢，进而提高草莓果实品质的作用。

实施地点：云南省昆明市西山区西华街地区草莓种植基地。

实施时间：2017年12月～2018年2月。

实施方案：针对开花结果期的生长草莓作物，设定两个样本组，一个作为对照组，不使用本发明的复合微生物菌剂。而另一个作为试验组，使用本发明的农用复合微生物菌剂。并按照10L/亩，稀释100倍，每周灌根一次。同时以100ml/亩用量，稀释100倍，对植株地上部分实施喷施。一个月后分别对2个处理组的草莓果品指标进行测定。

对草莓内在品质(如可溶性固形物、可滴定酸、糖酸比以及果实硬度等)相关指标进行定量和定性观测，分别从试验区域和对照区域各随机选取10株草莓植株，每株草莓各采1颗成熟度为九成熟左右的果实进行相关指标的测定，结果见表2。

表2.复合微生物菌剂处理后草莓果实内在品质动态情况对比

由表2可知：经过复合微生物菌剂施用的草莓，其可溶性固形物(％)与糖酸比指标与对照组相比均有所增加，其中对施用了40天、70天的果实采样检测结果中可溶性固形物(％)的增量幅度分别为5.84％和9.08％，平均提高7.5个百分点。糖酸比指标增量幅度分别为22.3％和15.3％，平均提高18.8个百分点；而在可滴定酸指标上与对照组相比则有所减少，减量分别为：12.1％、8.8％，平均减少10.4个百分点。由此可知，复合微生物菌剂的施用有利于降低草莓果实的可滴定酸含量，提高果实可溶性固形物和糖酸比指标值，从而提高草莓果实的内在品质。

本发明不限于本申请中描述的特定实施例，其旨在作为本发明的各个方面的单一说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，这对本领域技术人员是显而易见的。除了本文列举的那些之外，在本发明范围内的功能上等效的方法和装置对于本领域技术人员而言将从上述描述中变得显而易见。这些修改和变化旨在落在所附权利要求的范围内。本发明仅由所附权利要求的术语以及这些权利要求的等同物的全部范围来限制。应当理解，本发明不限于当然可以变化的特定方法、试剂、化合物组合物或生物系统。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的。

Claims (10)

1.复合微生物菌剂，其包括地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌、奥尔森氏菌、红蝽菌和解淀粉芽孢杆菌。

2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其包括地衣芽孢杆菌≥0.4×10⁶CFU/ml，丁酸梭菌≥0.4×10⁸CFU/ml，乳酸杆菌≥0.4×10⁸CFU/ml，奥尔森氏菌≥0.4×10⁶CFU/ml，红蝽菌≥0.4×10⁶CFU/ml，和解淀粉芽孢杆菌≥0.4×10⁶CFU/ml。

3.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂，其还包括有机酸。

4.如权利要求3所述的复合微生物菌剂，其中，所述有机酸包括选自由甲酸、乙酸和/或乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。

5.如权利要求4所述的复合微生物菌剂，其中，当存在时，甲酸含量为1.0～6.0mmol/L，乙酸含量为1.0～6.0mmol/L，以及乳酸含量为2.0～6.0mmol/L。

6.复合微生物菌剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)制备复合菌种A：将地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌、奥尔森氏菌、红蝽菌菌种在厌氧发酵营养液中搅拌均匀，发酵得到复合菌种A；

(2)制备复合菌液B：将步骤(1)中制备得到的复合菌种A在厌氧发酵营养液中搅拌均匀，发酵得到复合菌液B；

(3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液：将解淀粉芽孢杆菌菌种接种于培养基中，培养得到解淀粉芽孢杆菌菌液；

(4)将步骤(2)中制备的复合菌液B与步骤(3)中制备的解淀粉芽孢杆菌菌液相混合得到所述复合微生物菌剂。

7.如权利要求6所述的复合微生物菌剂的制备方法，步骤(3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液包括：①将解淀粉芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于NA固体培养基上，恒温培养后待用；②将上述经固体培养的解淀粉芽孢杆菌菌种接种于NB液体培养基中，振荡培养得到解淀粉芽孢杆菌菌液。

8.如权利要求1-5所述的复合微生物菌剂在草莓种植中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其中，在土壤准备阶段施用所述复合微生物菌剂。

10.如权利要求8所述的应用，其中，在生长阶段施用所述复合微生物菌剂。