CN110105377A - 一种检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针化合物、制备方法、一种荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌β‑内酰胺酶的探针化合物，由生物素部分、头孢类结构和发光部分三个部分构成。本发明还公开了上述所述探针化合物的制备方法和一种荧光探针。包括本发明制备得到的探针化合物作为检测结核分枝杆菌β‑内酰胺酶的荧光探针，通过所述探针分子与结核分枝杆菌β‑内酰胺酶作用释放出发光部分，其中有未参与反应的探针分子通过其生物素部分和亲和素作用除去未反应探针分子，这时通过检测发光部分的含量，从而可获得β‑内酰胺酶的数据和特性，可用来检测结核分枝杆菌，提高检测灵敏度。本发明的探针化合物具有易于使用、快速检测、低成本且灵敏度高的优点。

Description

一种检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针化合物、制备方法、 一种荧光探针
技术领域
本发明涉及医学，病原微生物学领域，涉及检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针化合物、制备方法、一种荧光探针。
背景技术
目前，很多细菌感染在全世界引起显着的发病率和死亡率，并且多数最重要的细菌物种是β-内酰胺酶阳性，使得它们对标准的青霉素样抗生素具有抗性。目前多数这些感染的诊断和青霉素抗性的存在通常是困难的，并且在敏感性测定之前需要广泛的诊断实验室培养。
其中结核病目前影响着世界近三分之一的人口，并且仍然是一个严重的公共卫生威胁。目前在实验室，组织培养细胞和动物模型和人体感染期间量化和评估结核病活力的方法仅限于菌落形成单位(CFU)和/或组织和痰的显微镜检查。这些方法耗时，通常难以解释且相对不敏感。大多数方法需要侵入性程序，所以对于动物和人类，必须在死后进行，可操作性弱。上述的缺点使得在动物模型和患者中难以跟踪疾病进展，疫苗功效和治疗结果。光学成像方法将允许使用活体动物以非侵入性方式实时直接观察感染期间的结核病活力，治疗效果和疾病期间细菌的定位。
活结核菌的临床诊断及结核菌敏感性检测均很困难,目前，结核杆菌的检测方法主要有以下几种：①涂片镜检；②直接培养法；③核酸扩增检测Xpert MTB/RIF技术；④线性探针技术；⑤γ-干扰素释放试验(TB-spot)；⑥DNA测序菌种鉴定。涂片镜检价格便宜，但是灵敏度差，容易照成漏检，而且无法区分结核杆菌的活性；直接培养法被WHO称为结核病诊断的金标准，但耗时非常长；新开发的Xpert MTB/RIF、线性探针技术、Xpert MTB/RIF技术(TB-spot)、DNA测序等技术虽然都有较好的灵敏度，但存在价格昂贵、操作复杂的缺点，不利于广泛应用。
β-内酰胺酶，属于Bush分类，该群酶最大特点是可以水解青霉素类、头孢类等抗生素。近年来已将β-内酰胺酶当作观察活细胞中的四核酶(Tetrahymena ribozyme)生理活性的荧光靶标。
基于荧光的生物分析测定提供了高灵敏度、易于使用、快速检测、低成本，且在分析之前很少需要或不需要生物样品处理。专利CN106061949A公开了一种用于检测表达金属-β-内酰胺酶的细菌的基于6,7-反式头孢菌素的探针，其包含具有6,7-反式构型的头孢菌素和附连至其的可检测的标记物。此方法虽然能够通过检测金属-β-内酰胺酶的方法检测到细菌，但存在由于未参与反应的探针分子残余物的标记物部分会降低检测结果的精确度。
现有的探针对结核分枝杆菌β-内酰胺酶(Mtb BlaC)的活动并不是最佳的，且检测准确度和灵敏度不高，因此，设计并使用结核分枝杆菌β-内酰胺酶改善酶动力学的探针将为检测和成像提供更高的灵敏度。结核分枝杆菌β-内酰胺酶的晶体结构显示出与其他A类β-内酰胺酶的主要区别，即结核分枝杆菌β-内酰胺酶具有更大的活性位点袋。这种结构差异表明设计具有改进的结核分枝杆菌β-内酰胺酶动力学的探针的可能性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种检测分枝杆菌β-内酰胺酶探针化合物，由生物素部分、头孢类结构和发光部分三个部分构成，所述探针化合物具有通式Ⅳ：
其中，Biotin表示生物素部分；
Dye表示发光部分，选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、AlexaFluor系列染料、东京绿中的任一种；
R选自H、OCH3、OCH2CH3中的任一种；
R1选自H、Na盐、Li盐、K盐、酯基、铵离子、甲氧基羰基氧基甲基、苯基中的任一种；
R2选自H、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基中的任一种。
应当解释，上述所述的Alexa Fluor系列染料是由美国生命技术公司旗下的分子探针公司开发的系列荧光染料，其激发光和发射光光谱覆盖大部分可见光和部分红外线光谱区域。
优选地，所述生物素部分通过羰基官能团被连接到所述探针，所述生物部分是具有以下式Ⅴ结构的5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基：
优选地，所述发光部分是通过芳香醚键被连接到所述探针，所述发光部分是具有以下式Ⅵ结构的(2-氧代-二氢苯并哌喃-7-基)氧基：
优选地，本发明的探针化合物选自以下任何一个探针化合物：
本发明还提供一种制备如上所述的探针化合物的方法，包括以下步骤：
(1)化合物II的合成：
化合物I先和NaI发生取代反应，所得物再与发光结构Dye发生取代反应，以将发光部分的结构通过芳香醚键与化合物I中的头孢类结构相连接，以将发光部分的结构通过芳香醚键与化合物I中的头孢类结构相连接，制得化合物II；
其中，发光结构Dye选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、AlexaFluor系列染料、东京绿中的任一种；
化合物I为具备以下式I结构的(6R，7R)-R1-3-(氯甲基)-4-R2-8-氧代-7-(2-苯乙酰胺基)7-R-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯：
化合物II为具有以下式II结构的(6R，7R)-R1-8-氧代-3-((Dye)甲基)-4-R2-7-(2-苯乙酰胺基)7-R-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯：
(2)化合物III的合成：
化合物II与五氯化磷和吡啶发生脱酰去保护反应，以制得化合物III；
其中，化合物III为具有以下式III结构的(6R，7R)-R1-4-R2-7-氨基-7-R-8-氧代-3-((Dye)甲基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯：
(3)化合物IV的合成：
化合物III和d-生物素在N,N-二异丙基乙胺和缩合剂2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐作用下，通过活化羧基，形成酰胺键，发生酰化反应，以将生物素部分通过羰基官能团与化合物I中的头孢类结构相连接，以制得如上所述的探针化合物IV；
其中，上述所述的化合物I、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ的结构及化学名称中的Dye表示发光部分，选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、AlexaFluor系列染料、东京绿中的任一种；R选自H、OCH3、OCH2CH3中的任一种；R1选自H、Na盐、Li盐、K盐、酯基、铵离子、甲氧基羰基氧基甲基、苯基中的任一种。
优选地，本发明提供的制备探针化合物的方法，包括以下步骤：
(1)化合物2的合成：
向化合物1和丙酮的悬浮液中加入NaI，发生取代反应，所得粗产混合物分离各层并萃取水层，洗涤合并的有机层后依次经过干燥、过滤、真空浓缩后溶解于乙腈,再与7-羟基香豆素发生取代反应，制得化合物2；其中，化合物1的化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-8-氧代-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯；化合物2的化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯；
(2)化合物3的合成：
在0℃并搅拌的条件下，向五氯化磷和二氯甲烷的悬浮液中添加吡啶，0℃温度下继续搅拌，搅拌完毕后向混合物中添加化合物2，化合物2与五氯化磷和吡啶发生发生脱酰去保护反应，以制得化合物3；其中，化合物3的化学名称为化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基7-氨基-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯；
(3)化合物4-H的合成：
化合物3和d-生物素在N,N-二异丙基乙胺和缩合剂2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐作用下，通过活化羧基，形成酰胺键，发生酰化反应，以制得化合物4-H；其中，化合物4-H的化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-((3AS，4S，6AR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯。
优选地，本发明提供的制备探针化合物的方法，还包括以下步骤：
(1)在氩气氛下，将化合物4-H溶于无水四氢呋喃，混和溶液被冷至-78℃；
(2)在-78℃温度并搅拌的条件下，向步骤(1)的混合溶液中加入甲醇锂的无水四氢呋喃和无水甲醇溶液，然后加入次氯酸叔丁酯，在-78℃温度下继续搅拌，化合物4-H和甲醇锂和次氯酸叔丁酯发生甲氧基化反应，以制得4-OMe化合物；其中，化合物4-OMe的化学名称为(6R，7S)4-甲氧苄基-7-甲氧基-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯。。
优选地，本发明提供的制备探针的方法，还包括以下步骤：将化合物4-H冷却到0℃，添加三氟乙酸和茴香醚的混合液，在0℃下搅拌，发生反应脱保护，制得5-H化合物；其中，化合物5-H的化学名称为(6R，7R)-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-((3AS，4S，6AR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸。
优选地，本发明提供的制备探针的方法，还包括以下步骤：将化合物4-OMe冷却到0℃，添加三氟乙酸和茴香醚的混合液，在0℃下搅拌，发生反应脱保护，以制得白色固体的5-OMe化合物；其中，化合物5-OMe的化学名称为(6R，7S)-7-甲氧基-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-((3AS，4S，6AR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸。
本发明还提供了一种荧光探针，所述荧光探针为包括以上所述的探针化合物作为检测结核分支分枝杆菌β-内酰胺酶的荧光探针。
本发明利用结核杆菌的β-内酰胺酶结构与大多数β-内酰胺酶的差异，设计并合成了高选择性的β-内酰胺酶的探针。它的选择性是大肠杆菌β-内酰胺酶的6000倍。
本发明所提供的用于检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针，探针分子与结核分枝杆菌中的β-内酰胺酶反应，释放出发光物质和生物素-头孢类结构部分,可能还会残留一些未反应的探针分子,这时与亲和素类化合物作用,亲和素将与生物素作用能除去含生物素的物质或化合物等,从而将探针分子与结核分枝杆菌β-内酰胺酶反应产物之一的发光物质分离出来，因此可以降低背景噪音信号，这时通过检测发光部分的含量，可获得β-内酰胺酶的数据和特性，可精准的检测结核分枝杆菌，提高灵敏度，且本发明用于检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针具有易于使用、快速检测、低成本的优点。
另外，通过本发明提供的用于检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针的制备方法，可以制得如上所述的用于检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以一些实施例来详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
附图说明
图1表示通式Ⅳ化合物的制备流程图。
图2表示4-H化合物的制备流程图。
图3表示用4-H化合物制备4-OMe化合物的流程图。
图4表示用4-H化合物制备5-H化合物的流程图。
图5表示用4-OMe化合物制备5-OMe化合物的流程图。
术语解释：
术语“当量”如本发明所用描述了通过与预定的起始物质相比试剂或反应化合物的化学计量(摩尔比率)。
本发明使用以下缩写：
Biotin 生物素部分
Dye 发光部分
Mtb BlaC 结核分枝杆菌β-内酰胺酶
Mtb 结核分枝杆菌
BlaC β-内酰胺酶
NaI 碘化钠
acetone 丙酮
MeCN 乙腈
H<sub>2</sub>O 水
EtOAc 乙酸乙酯
NaS<sub>2</sub>O<sub>3</sub> 亚硫酸钠
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 硫酸钠
K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 碳酸钾
PCL<sub>5</sub> 五氯化磷
DCM 二氯甲烷
pyridine 吡啶
MTBE 甲基叔丁基醚
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DIEA N,N-二异丙基乙胺
TFA 三氟乙酸
anisole 茴香醚
MTBE 甲基叔丁基醚
THF 四氢呋喃
LiOMe 甲醇锂
tBuOCl 次氯酸叔丁酯
MeOH 甲醇
MES 2-(N-吗啡啉)乙磺酸
BCG 卡介苗
具体实施方式
为了可以更充分地理解本文描述的发明，阐述以下实施例。应当理解这些实施例仅用于说明性目的并且不应被理解为以任何方式限制本发明。
制备本发明的探针化合物的一般方法和实验在下面阐述。在某些情况下，特别的化合物通过实施例描述。应当理解在每种情况下，一系列的本发明的化合物根据下面描述的方案和实验制备。
实施例1
通式Ⅳ化合物的制备，如附图1所示，包括以下步骤：
(1)化合物II的合成
化合物I先和NaI发生取代反应，所得物再与发光结构Dye发生取代反应，以将发光部分的结构通过芳香醚键与化合物I中的头孢类结构相连接，以将发光部分的结构通过芳香醚键与化合物I中的头孢类结构相连接，制得化合物II；
其中，发光结构Dye选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、AlexaFluor系列染料、东京绿中的任一种；化合物I和化合物II的结构式如附图1所示；
(2)化合物III的合成
化合物II与五氯化磷和吡啶发生脱酰去保护反应，以制得化合物III；其中化合物III的结构式如附图1所示；
(3)化合物IV的合成
化合物III和d-生物素在N,N-二异丙基乙胺和缩合剂2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐作用下，通过活化羧基，形成酰胺键，发生酰化反应，以将生物素部分通过羰基官能团与化合物I中的头孢类结构相连接，以制得通式探针化合物IV。
实施例2
化合物4-H的制备，如附图2所示，包括以下步骤：
(1)化合物2的制备
向化合物1(4.86g，10毫摩尔)与丙酮(110毫升)的悬浮液中添加NaI(15g，100毫摩尔，10当量)。在室温下搅拌2小时，发生取代反应，然后在真空中去除溶剂。将粗混合物在H2O(100ml)和有机溶剂(100ml)之间分配，分离各层。用相同的有机溶剂(2×100ml)萃取水层，然后用5％NaS2O3水溶液100ml)和盐水(100ml)洗涤合并有机层。有机层经干燥剂干燥，过滤，真空浓缩。将粗产物溶解于乙腈(150ml)中，加入7-羟基香豆素(3.24g，20毫摩尔，2当量)和碳酸钾(5.52g，40毫摩尔，4当量)，发生取代反应。在室温下将反应混合物搅拌12小时。将溶剂在真空中蒸发，所得粗混合物在水(100ml)和有机溶剂(100ml)之间分配。分离各层后，用相同的有机溶剂(2×100ml)萃取水层，然后用5％NaS2O3水溶液(2×100ml)和盐水(100ml)洗涤合并的有机层。有机层经干燥剂干燥，过滤，真空浓缩。通过柱层析法(石油醚/乙酸乙酯，1:1)纯化粗产物，得到呈浅棕色固体的化合物2(2.4g，39％)。
化合物2的结构表征
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.21(d,J＝7.5Hz,1H),8.00(d,J＝9.4Hz,1H),7.61(d,J＝7.6Hz,1H),7.36–7.16(m,7H),6.93(s,2H),6.89(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(d,J＝7.1Hz,2H),6.32(d,J＝9.4Hz,1H),5.51–5.41(m,1H),5.22–5.12(m,2H),5.11–5.01(m,2H),4.72(q,J＝11.8Hz,2H),3.71(s,3H),3.53–3.48(m,2H).LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝613.1.
(2)化合物3的制备
在0℃搅拌的PCL5(0.65g，3.18毫摩尔，1.5当量)与15毫升二氯甲烷(DCM)悬浮液中添加吡啶(0.25g，3.18毫摩尔，1.5当量)。将所得悬浮液在0℃搅拌30分钟至60分钟。向混合物中添加化合物2(1.3g，2.12毫摩尔，1.0当量)，化合物2与PCL5和吡啶发生发生脱酰去保护反应。在0℃搅拌2.5小时后，将反应混合物冷却至-40℃。向冷却混合物中逐滴添加预冷却甲醇(5ml)。在0℃搅拌30分钟至60分钟后，将混合物在45℃浓缩，得到粗残渣。用水(15ml)和乙酸乙酯(20ml)研磨残余物，通过过滤收集所得沉淀，用甲基叔丁基醚(MTBE)洗涤并用干燥剂干燥，得到呈深黄色固体的化合物3(0.6g，60％)。
化合物3的结构表征
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.68(s,1H),8.86(s,1H),8.07(s,1H),7.69(t,J＝7.7Hz,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,1H),6.92(d,J＝8.0Hz,1H),3.14(s,3H),3.01(s,3H),2.87(s,6H).1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.07(br s,2H),8.01(d,J＝9.5Hz,1H),7.62(d,J＝8.6Hz,1H),7.23(d,J＝8.6Hz,2H),6.93(s,2H),6.88(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),6.32(d,J＝9.5Hz,1H),5.27(d,J＝4.2Hz,1H),5.22(s,1H),5.15–5.06(m,2H),5.04(d,J＝4.2Hz,1H),4.81–4.68(m,2H),3.71(s,3H).LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝495.1.
(3)化合物4-H的制备
向d-生物素(0.35g，1.45毫摩尔，1.2当量)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(0.55g，1.45毫摩尔，1.2当量)在DMF(30ml)中的溶液中添加化合物3(0.6g，1.21毫摩尔，1.0当量)和N,N-二异丙基乙胺(0.3ml，1.81毫摩尔，1.5当量)。在室温下将所得混合物搅拌1小时，活化羧基，形成酰胺键，发生酰化反应。将混合物浓缩以得到残渣。残余物在有机溶剂(30ml)和水(30ml)之间分配。分离各层并用相同的有机溶剂(2×30ml)萃取水相。用盐水(30ml)洗涤合并的有机相，经干燥剂干燥，过滤，减压浓缩，得到棕色残渣。通过快速色谱法(含0-8％甲醇的二氯甲烷溶液)纯化残余物，得到淡黄色固体化合物4-H(0.6g，68％)。
化合物4-H的结构表征
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.93(d,J＝7.5Hz,1H),8.01(d,J＝9.5Hz,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,1H),7.22(d,J＝8.6Hz,2H),6.93(s,2H),6.88(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.81(d,J＝8.6Hz,2H),6.44(s,1H),6.38(s,1H),6.32(d,J＝9.5Hz,1H),5.43(dd,J＝7.5,3.9Hz,1H),5.17(d,J＝3.8Hz,1H),5.13(s,1H),5.08(q,J＝12.0Hz,2H),4.71(dd,J＝22.6,11.9Hz,2H),4.35–4.26(m,1H),4.17–4.09(m,2H),3.71(s,3H),3.14–3.06(m,1H),2.83(dd,J＝12.4,5.0Hz,1H),2.58(d,J＝12.4Hz,1H),2.23–2.13(m,2H),1.60–1.45(m,4H),1.37–1.25(m,2H).LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝721.2.
实施例3
化合物4-OMe的制备，如附图2、附图3所示，包括以下步骤：
(1)重复实施例2中步骤(1)至步骤(3)的操作，以制得淡黄色固体化合物4-H；
(2)在氩气氛下，将化合物4-H(105mg，0.16毫摩尔)溶于无水四氢呋喃(1.4ml)中，该混合溶液被冷致-78℃，逐滴加入甲醇锂(13mg，0.34毫摩尔)的无水四氢呋喃(4mL)和无水甲醇(0.64ml)溶液，然后逐滴添加叔丁基次氯酸盐(29ml，0.26毫摩尔)，并在相同温度下将混合物搅拌半小时，化合物4-H和甲醇锂和次氯酸叔丁酯发生甲氧基化反应，。将反应溶液倒入氯化铵水溶液中并用乙酸乙酯(15ml×3)萃取。在硅胶柱上用快速色谱法进行后续纯化，得到化合物4-OMe(80毫克，73％)。
化合物4-OMe的结构表征
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.93(d,J＝7.5Hz,1H),8.01(d,J＝9.5Hz,1H),7.61(d,J＝8.6Hz,1H),7.22(d,J＝8.6Hz,2H),6.93(s,2H),6.88(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),6.81(d,J＝8.6Hz,2H),6.44(s,1H),6.38(s,1H),6.32(d,J＝9.5Hz,1H),5.43(dd,J＝7.5,3.9Hz,1H),5.17(d,J＝3.8Hz,1H),5.13(s,1H),5.08(q,J＝12.0Hz,2H),4.71(dd,J＝22.6,11.9Hz,2H),4.35–4.26(m,1H),4.17–4.09(m,2H),3.71(s,3H),3.30(s,3H)3.14–3.06(m,1H),2.83(dd,J＝12.4,5.0Hz,1H),2.58(d,J＝12.4Hz,1H),2.23–2.13(m,2H),1.60–1.45(m,4H),1.37–1.25(m,2H).LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝751.2.
实施例4
化合物5-H的制备，如附图2、附图4所示，包括以下步骤：
(1)重复实施例2步骤(1)至步骤(3)的操作，以制得淡黄色固体化合物4-H；
(2)将化合物4-H(450mg，0.62毫摩尔)冷却到0℃，然后添加三氟乙酸/茴香醚(4:1，25ml)，在0℃下将所得反应混合物搅拌30分钟至60分钟，发生反应脱保护，并通过TLC分析持续监测转化(CH2Cl2/EtOAc，8:2)。反应完成后，加入冷的MTBE(30ml)，形成沉淀。通过过滤收集固体并用MTBE(2×10ml)洗涤，随后在高真空下干燥以获得粗产物。通过制备高效液相色谱对粗产物进行纯化，以制得呈白色固体的化合物5-H(130mg，34％)。
化合物5-H的结构表征
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.89(d,J＝7.6Hz,1H),8.00(d,J＝9.5Hz,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,1H),7.04(d,J＝2.3Hz,1H),6.97(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.86(s,1H),6.42(br s,1H),6.35(br s,1H),6.31(d,J＝9.5Hz,1H),5.42(dd,J＝7.6,3.9Hz,1H),5.17(d,J＝3.8Hz,1H),4.98(d,J＝1.3Hz,1H),4.77(q,J＝12.0Hz,2H),4.30(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),4.13(dd,J＝7.7,4.4Hz,1H),3.10(dt,J＝8.4,6.2Hz,1H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.58(d,J＝12.4Hz,1H),2.19(t,J＝7.3Hz,2H),1.66–1.40(m,4H),1.40–1.25(m,2H).LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝601.2.
实施例5
化合物5-OMe的制备，如附图2、附图3、附图5所示，包括以下步骤：
(1)重复实施例3步骤(1)至步骤(2)的操作，以制得化合物4-OMe；
(2)将化合物4-OMe(450mg，0.62毫摩尔)冷却到0℃，然后添加三氟乙酸/茴香醚(4:1，25ml)，在0℃下将所得反应混合物搅拌30分钟至60分钟，发生反应脱保护，并通过TLC分析持续监测转化(CH2Cl2/EtOAc，8:2)。反应完成后，加入冷的MTBE(30ml)，形成沉淀。通过过滤收集固体并用MTBE(2x 10ml)洗涤，随后在高真空下干燥以获得粗产物。通过制备高效液相色谱对粗产物进行纯化，以提供呈白色固体的所需产物(130mg，34％)。
化合物5-OMe的结构表征
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.89(d,J＝7.6Hz,1H),8.00(d,J＝9.5Hz,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,1H),7.04(d,J＝2.3Hz,1H),6.97(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.86(s,1H),6.42(br s,1H),6.35(br s,1H),6.31(d,J＝9.5Hz,1H),5.42(dd,J＝7.6,3.9Hz,1H),5.17(d,J＝3.8Hz,1H),4.98(d,J＝1.3Hz,1H),4.77(q,J＝12.0Hz,2H),4.30(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),4.13(dd,J＝7.7,4.4Hz,1H),3.30(s,3H),3.10(dt,J＝8.4,6.2Hz,1H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.58(d,J＝12.4Hz,1H),2.19(t,J＝7.3Hz,2H),1.66–1.40(m,4H),1.40–1.25(m,2H).LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝631.1.
应当理解，本发明实施例1-实施例5中出现的比例均为化学物质组分之间的体积比。
应当理解，本发明实施例1-实施例5中出现的“有机溶剂”为为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯中的一种。
应当理解，本发明实施例1-实施例5中出现的“干燥剂”为无水氯化钙、无水硫酸钠、无水硫酸镁中的一种。
本发明的探针在检测检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶中的应用，具体以以下实施例进行阐述，
实施例6
以下对按本发明实施例2-实施5中的方法所制备的探针化合物在检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶中的应用进行描述：
A.原料
(1)4-H、4-OMe、5-H、5-OMe探针化合物
(2)结核分枝杆菌呈阴性的人痰
(3)牛结核分枝杆菌BCG
(4)链球菌
(5)铜绿假单胞菌
(6)大肠杆菌
(7)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
(8)MES缓冲液，200毫摩尔每升，pH＝6
B.实验步骤
实验一
(1)将牛结核分枝杆菌BCG在含10％油酸白蛋白葡萄糖复合物和0.25％吐温-80的7H9培养基中培养，直到达到牛结核分枝杆菌经检测为10CFU时结束培养。
(2)准备5组均为100微升的结核分枝杆菌呈阴性的人痰，分别加入步骤(1)所准备的10CFU的牛结核分枝杆菌，然后用120微升的上述原料中所述的MES缓冲液将上述人痰和牛结核分枝杆菌的混合液稀释。标名组1、组2、组3、组4、组5.
(3)按照步骤(2)组2中加入10微升的20微摩尔每升的探针4-H的MES缓冲液，组3中加入10微升的20微摩尔每升的探针4-OMe的MES缓冲液，组4中加入加入10微升的20微摩尔每升的探针5-H的MES缓冲液，组5中加入加入10微升的20微摩尔每升的探针5-OMe的MES缓冲液。
(4)将上述组1至组5的5组混合液分别静置5分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟、240分钟的7个时间点，用荧光仪分别检测各时间点的5个组别的荧光信号。
实验二
(1)向100微升的结核分枝杆菌呈阴性的人痰，加入10CFU的牛结核分枝杆菌，然后用120微升的上述原料中所述的MES缓冲液将上述人痰和菌种的混合液稀释。重复步骤，共准备4份含10CFU牛结核分枝杆菌的人痰的EMS混合液。
(2)向100微升的结核分枝杆菌呈阴性的人痰，加入106CFU的链球菌，然后用120微升的上述原料中所述的MES缓冲液将上述人痰和菌种的混合液稀释。重复步骤，共准备4份含106CFU的链球菌的人痰的EMS混合液。
(3)向100微升的结核分枝杆菌呈阴性的人痰，加入106CFU的大肠杆菌，然后用120微升的上述原料中所述的MES缓冲液将上述人痰和菌种的混合液稀释。重复步骤，共准备4份含106CFU的肠杆菌的人痰的EMS混合液。
(4)向100微升的结核分枝杆菌呈阴性的人痰，加入106CFU的铜绿假单胞菌，然后用120微升的上述原料中所述的MES缓冲液将上述人痰和菌种的混合液稀释。重复步骤，共准备4份含106CFU的铜绿假单胞菌的人痰的EMS混合液。
(5)向100微升的结核分枝杆菌呈阴性的人痰，加入106CFU的金黄色葡萄球菌，然后用120微升的上述原料中所述的MES缓冲液将上述人痰和菌种的混合液稀释。重复步骤，共准备4份含106CFU的金黄色葡萄球菌的人痰的EMS混合液。
(6)向步骤(1)所制备的4份含10CFU牛结核分枝杆菌的人痰的EMS混合液中分别添加10微升的20微摩尔每升的探针4-H的MES缓冲液、10微升的20微摩尔每升的探针4-OMe的MES缓冲液、0微升的20微摩尔每升的探针5-H的MES缓冲液、10微升的20微摩尔每升的探针5-OMe的MES缓冲液。上述4份混合液只分别添加一种探针化合物。
(7)按照步骤(6)的方法，对步骤(2)至步骤(5)中所得各菌种的的人痰的EMS混合液做相同处理。
(8)将步骤(6)至步骤(7)的20组混合液均静置3小时，用荧光仪测试步骤(6)和步骤(7)所得20组混合液的荧光强度。
C.实验结果
实验一的5组荧光强度见表一。
表一
如表一所示，可知，随着时间的推移，没有加入探针化合物的含10CFU牛结核分枝杆菌的人痰对照组的荧光信号始终弱于含有探针化合物的组2、组3、组4、组5。牛结核分枝杆菌在人痰中分解探针化合物，释放出的荧光部分，即可被荧光仪检测到。
实验二的4组使用不同菌种进行检测时的荧光强度见表二。
表二
如表二所示，可知，本发明的实施例2-实施例5所制备的4-H、4-OMe、5-H、5-OMe探针化合物，对于牛结核分枝杆菌具有特异性。这也验证了分枝杆菌β-内酰胺酶具有更大的活性位点袋这一特性，所以牛结核分枝杆菌分解本发明所述的4-H、4-OMe、5-H、5-OMe探针化合物的能力高于其他4个菌种链球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
应当解释，实施例6所用的荧光仪是Varian Cary Eclipse荧光仪。
本发明所提供的用于检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针，探针分子与结核分枝杆菌中的β-内酰胺酶反应，释放出发光物质和生物素-头孢类结构部分,可能还会残留一些未反应的探针分子,这时与亲和素类化合物作用,亲和素将与生物素作用能除去含生物素的物质或化合物等,从而将探针分子与结核分枝杆菌β-内酰胺酶反应产物之一的发光物质分离出来，因此可以降低背景噪音信号，这时通过检测发光部分的含量，可获得β-内酰胺酶的数据和特性，可精准的检测结核分枝杆菌，提高灵敏度，且本发明用于检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针具有易于使用、快速检测、低成本的优点。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (10)

1.一种检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针化合物，其特征在于，由生物素部分、头孢类结构和发光部分三个部分构成，所述探针化合物具有通式Ⅳ：
其中，
Biotin表示生物素部分；
Dye表示发光部分，选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、AlexaFluor系列染料、东京绿中的任一种；
R选自H、OCH3、OCH2CH3中的任一种；
R1选自H、Na盐、Li盐、K盐、酯基、铵离子、甲氧基羰基氧基甲基、苯基中的任一种；
R2选自H、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基中的任一种。
2.根据权利要求1所述的探针化合物，其特征在于，所述生物素部分通过羰基官能团被连接到所述探针，所述生物部分是具有以下式Ⅴ结构的5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基：
3.根据权利要求1所述的探针化合物，其特征在于，所述发光部分是通过芳香醚键被连接到所述探针，所述发光部分是具有以下式Ⅵ结构的(2-氧代-二氢苯并哌喃-7-基)氧基：
4.根据权利要求1-3任意一项所述的探针化合物，其特征在于，所述探针化合物选自以下任何一个探针化合物：
5.一种制备权利要求1所述的检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)化合物II的合成：
化合物I先和NaI发生取代反应，所得物再与发光结构Dye发生取代反应，以将发光部分的结构通过芳香醚键与化合物I中的头孢类结构相连接，制得化合物II；
其中，发光结构Dye选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、AlexaFluor系列染料、东京绿中的任一种；
化合物I为具备以下式I结构的(6R，7R)-R1-3-(氯甲基)-4-R2-8-氧代-7-(2-苯乙酰胺基)7-R-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯：
化合物II为具有以下式II结构的(6R，7R)-R1-8-氧代-3-((Dye)甲基)-4-R2-7-(2-苯乙酰胺基)7-R-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯：
(2)化合物III的合成：
化合物II与五氯化磷和吡啶发生脱酰去保护反应，以制得化合物III；
其中，化合物III为具有以下式III结构的(6R，7R)-R1-4-R2-7-氨基-7-R-8-氧代-3-((Dye)甲基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯：
(3)化合物IV的合成：
化合物III和d-生物素在N,N-二异丙基乙胺和缩合剂2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐作用下，通过活化羧基，形成酰胺键，发生酰化反应，以将生物素部分通过羰基官能团与化合物I中的头孢类结构相连接，以制得如权利要求1所述的探针化合物IV；
其中，上述所述的化合物I、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ的结构及化学名称中的Dye表示发光部分，选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、AlexaFluor系列染料、东京绿中的任一种；R选自H、OCH3、OCH2CH3中的任一种；R1选自H、Na盐、Li盐、K盐、酯基、铵离子、甲氧基羰基氧基甲基、苯基中的任一种。
6.根据权利要求5所述的制备探针化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)化合物2的合成：
向化合物1和丙酮的悬浮液中加入NaI，发生取代反应，所得粗产混合物分离各层并萃取水层，洗涤合并的有机层后依次经过干燥、过滤、真空浓缩后溶解于乙腈,再与7-羟基香豆素发生取代反应，制得化合物2；其中，化合物1的化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-8-氧代-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯；化合物2的化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(2-苯乙酰胺基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯；
(2)化合物3的合成：
在0℃并搅拌的条件下，向五氯化磷和二氯甲烷的悬浮液中添加吡啶，0℃温度下继续搅拌，搅拌完毕后向混合物中添加化合物2，化合物2与五氯化磷和吡啶发生发生脱酰去保护反应，以制得化合物3；其中，化合物3的化学名称为化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基7-氨基-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯；
(3)化合物4-H的合成：
化合物3和d-生物素在N,N-二异丙基乙胺和缩合剂2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐作用下，通过活化羧基，形成酰胺键，发生酰化反应，以制得化合物4-H；其中，化合物4-H的化学名称为(6R，7R)-4-甲氧基苄基8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-((3AS，4S，6AR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯。
7.根据权利要求6所述的制备探针化合物的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
(1)在氩气氛下，将化合物4-H溶于无水四氢呋喃，混和溶液被冷至-78℃；
(2)在-78℃温度并搅拌的条件下，向步骤(1)的混合溶液中加入甲醇锂的无水四氢呋喃和无水甲醇溶液，然后加入次氯酸叔丁酯，在-78℃温度下继续搅拌，化合物4-H和甲醇锂和次氯酸叔丁酯发生甲氧基化反应，以制得4-OMe化合物；其中，化合物4-OMe的化学名称为(6R，7S)4-甲氧苄基-7-甲氧基-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯。
8.根据权利要求6所述的制备探针化合物的方法，其特征在于，还包括以下步骤：将化合物4-H冷却到0℃，添加三氟乙酸和茴香醚的混合液，在0℃下搅拌，发生反应脱保护，以制得5-H化合物；其中，化合物5-H的化学名称为(6R，7R)-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-((3AS，4S，6AR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸。
9.根据权利要求7所述制备探针化合物的方法，其特征在于，还包括以下步骤：将化合物4-OMe冷却到0℃，添加三氟乙酸和茴香醚的混合液，在0℃下搅拌，发生反应脱保护，以制得5-OMe化合物；其中，化合物5-OMe的化学名称为(6R，7S)-7-甲氧基-8-氧代-3-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(5-((3AS，4S，6AR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-5-硫代-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸。
10.一种荧光探针，其特征在于：包括权利要求1-4任意一项所述的探针化合物作为检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的荧光探针。
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