CN110092838A

CN110092838A - 一种增强蛋白降解多肽的发现及应用

Info

Publication number: CN110092838A
Application number: CN201910383227.1A
Authority: CN
Inventors: 尹秀山; 李学龙; 李�根
Original assignee: Bayaotaike Biomedical Technology (shenyang) Co Ltd
Current assignee: Bayaotaike Biomedical Technology (shenyang) Co Ltd
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110092838B

Abstract

本发明公开了一种增强目的蛋白降解的多肽。所述多肽信息包括编码多肽的cDNA序列，RNA序列和蛋白序列及其延伸序列、修饰过的氨基酸序列以及同5源性不低于70%的蛋白序列。本发明还提供了一种增强蛋白降解多肽的应用，通过与目的蛋白融合，该多肽可以特异增强自身降解并可以介导融合蛋白的共降解，其降解程度显著，可以达到近乎敲除的效果。该多肽可用做调控蛋白水平的工具，在体外或者体内调节融合蛋白的表达水平来研究其功能和调节生物学通路。该多肽可以通过体内和体外合成得到，方便快捷，为今后关于蛋白聚集疾病的治疗提供新的途径和方法。

Description

一种增强蛋白降解多肽的发现及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种增强蛋白降解的多肽及其应用。

背景技术

蛋白稳定性的调控发挥重要的生物学功能。在体内，蛋白稳定性失调与众多疾病相关。由于蛋白质聚集体的形成而促发的疾病被称为蛋白质聚集疾病。其中最常见的是神经退行性疾病，如蛋白质异常聚集并沉积在大脑的特定区域并阻碍其功能（参考文献：Protein aggregation and neurodegenerative diseases: From theory to therapy）。蛋白降解主要有蛋白酶体介导的泛素级联反应以及溶酶体介导的降解途径。其中泛素化在癌症，代谢综合症，神经退行性疾病，自身免疫疾病，炎症性失常，感染和肌肉营养不良的蛋白稳定调控方面发挥重要作用（参考文献：Ubiquitination in disease pathogenesisand treatment）。通过激活（E1），结合（E2）和连接（E3）酶进行的级联酶促反应，特异的蛋白序列被识别，标记，在特定信号通路的调解下，使得目的蛋白得到精确的降解（参考文献：The ubiquitin system）。特定的蛋白序列可以在体外作为一种标签，通过与要研究的目的蛋白融合介导其快速地酶解来研究其功能和调节生物学通路。直接靶向蛋白质的方法比靶向DNA和RNA的方法在在特异性，可逆性和时间方面上具有优势（参考文献：ConditionalDegrons for Controlling Protein Expression at the Protein Level）。

发明内容

本发明设计一种增强蛋白降解的多肽及其应用，具体为该多肽及同源多肽的序列，及作为标签，调节融合目的蛋白稳定性的方法。

本发明包括蛋白降解多肽J100的序列、包括J100的延伸序列、修饰过的氨基酸序列以及同源性不低于70%的蛋白序列。通过与目的蛋白融合，我们发现该降解多肽J100具有调控融合蛋白共同降解的功能，因此该降解多肽J100可以作为一种多肽标签，应用在分子生物学及细胞生物学领域。

附图说明

图1为J1-J6截短体的蛋白表达情况。图中，左侧为截短体western blot检测目的蛋白的表达；右侧为待检测蛋白的区域示意图，星号表示表达强度，灰色为表达，黑色为不表达。

具体实施方式

下文分别提供降解多肽J100鉴定过程及方法，以及与荧光蛋白tdTomato融合从而增强tdTomato降解的效果。降解多肽J100的鉴定过程及方法，以及对荧光蛋白的促降解作用，并不以任何方式限制本发明的范围。

1，降解多肽J100的鉴定及方法

HEK293细胞常规培养，培养条件为 5%二氧化碳培养箱，37度恒温。培养基为DMEM，双抗， 10%血清和L-谷氨酰胺。细胞生长到50%-80%时，进行转染，转染方法参照脂质体2000的说明，转染两到四天后收集细胞，裂解后按照每孔上样10 µg进行western blot，利用flag抗体进行检测目的蛋白的表达情况。

利用高通量筛选方法，我们发现一段蛋白序列J2 （图1 所示）显著影响蛋白稳定，Flag标签无法检测到J2的表达。通过截短体筛选，最终将影响蛋白稳定性的序列锁定到100aa内（见图1 中J5与J6的表达）。本实验鉴定到了降解多肽J100。

2，降解多肽J100对荧光蛋白tdTomato的促降解作用

实验方法与结果

HEK293细胞常规培养，培养条件为 5%二氧化碳培养箱，37度恒温。培养基为DMEM，双抗， 10%血清和L-谷氨酰胺。细胞生长到50%-80%时，进行转染，转染方法参照脂质体2000的说明。转染12-36小时后在荧光显微镜下进行观察tdTomato红色荧光，普通视野作为对照。

我们可以看到，在单独转染tdTomato的细胞内，能观测到红色荧光信号，在共表达降解多肽J100的细胞中，几乎没有红色荧光的表达。该数据证明降解多肽J100对tdTomato蛋白表达的促降解作用。

序列表

<110> 拜澳泰克生物医学科技（沈阳）有限公司

<120> 一种增强蛋白降解多肽的发现及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 303

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

agaagactgg ccaacaagat cgagcacgag ctgagcagag gcagcttcca ccccgtgccc 60

accagaggca gcgccctgga gaccaccaag agccccctga tcatcgacaa gaacgagcac 120

ttcaccgtgt acagagaccc cgccctgatc ggcagcgaga ccggcgccaa ccacatcagc 180

cccttcctga gccagcaccc cttcagcctg cacagcagca gccacagaac ctgcctgaac 240

cccggcaccc accaccccgc cctgaccccc ggcccccacc tgctggccgg cagcaccagc 300

tga 303

<210> 2

<211> 303

<212> RNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

agaagacugg ccaacaagau cgagcacgag cugagcagag gcagcuucca ccccgugccc 60

accagaggca gcgcccugga gaccaccaag agcccccuga ucaucgacaa gaacgagcac 120

uucaccgugu acagagaccc cgcccugauc ggcagcgaga ccggcgccaa ccacaucagc 180

cccuuccuga gccagcaccc cuucagccug cacagcagca gccacagaac cugccugaac 240

cccggcaccc accaccccgc ccugaccccc ggcccccacc ugcuggccgg cagcaccagc 300

uga 303

<210> 3

<211> 100

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Arg Arg Leu Ala Asn Lys Ile Glu His Glu Leu Ser Arg Gly Ser Phe

1 5 10 15

His Pro Val Pro Thr Arg Gly Ser Ala Leu Glu Thr Thr Lys Ser Pro

20 25 30

Leu Ile Ile Asp Lys Asn Glu His Phe Thr Val Tyr Arg Asp Pro Ala

35 40 45

Leu Ile Gly Ser Glu Thr Gly Ala Asn His Ile Ser Pro Phe Leu Ser

50 55 60

Gln His Pro Phe Ser Leu His Ser Ser Ser His Arg Thr Cys Leu Asn

65 70 75 80

Pro Gly Thr His His Pro Ala Leu Thr Pro Gly Pro His Leu Leu Ala

85 90 95

Gly Ser Thr Ser

100

Claims

1.一种增强蛋白降解的方法，其特征在于：通过与目的蛋白融合并具有调控融合蛋白共同降解的功能，所述多肽包括Seq ID NO.1 所示的cDNA序列和/或如Seq ID NO.2 所示的RNA序列和/或如 SEQ ID NO:3 所示的蛋白序列及其延伸序列、修饰过的氨基酸序列和/或与如SEQ ID NO:1 所示的cDNA序列同源性不低于70%的同源序列和/或与如SEQ ID NO:2所示的RNA序列同源性不低于70%的同源序列和/或与如 SEQ ID NO:3 所示的蛋白序列同源性不低于70%的同源序列。

2.根据权利要求1中所述的一种增强蛋白降解的方法，其特征在于，根据权利要求1所述的增强基因表达的方法，其特征在于：所述同源序列为与如SEQ ID NO:1 所示的cDNA序列同源性高于80%的同源序列和/或与如SEQ ID NO:2所示的RNA序列同源性高于80%的同源序列和/或与如 SEQ ID NO:3 所示的蛋白序列同源性高于80%的同源序列。

3.根据权利要求1中所述的一种增强蛋白降解的方法，其特征在于，该多肽能与目的蛋白融合并调控共同降解。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的增强基因表达的方法，其特征在于：转染对象为真核细胞。

5.一种检测蛋白降解水平的方法，其特征在于：通过权利要求1所述的多肽做为增强剂转染到真核细胞中，利用蛋白免疫印迹法检验多肽对目的蛋白的降解情况。

6.根据权利要求5所述的检测蛋白降解的方法，步骤如下：

步骤一：对HEK293细胞常规培养；

步骤二：细胞生长到50%-80%时，进行转染，2-4天后收集细胞；

步骤三：细胞裂解；

步骤四：蛋白印迹法检测裂解产物的蛋白的降解情况。

7.一种根据权利要求4所述的蛋白降解检测方法，具体如下：选取HEK293细胞进行增强蛋白降解多肽转染，利用荧光显微镜观测该多肽对目的蛋白降解情况。

8.根据权利要求7所述的检测蛋白降解的方法，步骤如下：

步骤一:对HEK293细胞常规培养；

步骤二：细胞生长到50%-80%时，进行转染；

步骤三：转染12-36小时后在荧光显微镜下观察tdTomato红色荧光。