CN110090165B - 一种小核酸纳米美白霜及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种小核酸纳米美白霜，由小核酸活性成分、纳米材料、乳膏基质组成。本发明采用TYR‑siRNA作为小核酸活性成分，利用纳米材料复合TYR‑siRNA，并且乳膏中还含有保湿因子，促进透皮的成分等制备，本发明所述小核酸纳米美白霜能有效抑制黑色素生成，抑制皮肤络氨酸酶的表达，具有美白保湿功效，可应用于化妆品领域，发挥美白作用。

Description

一种小核酸纳米美白霜及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，涉及一种小核酸纳米美白霜及其制备方法与在制备抑制皮肤络氨酸酶的表达的制剂中的应用。
背景技术
长期以来，美白一直是女性所追求的目标，目前市场上已经有许多的美白产品。最早的美白方法是用醇和酸等进行脱皮漂白，但是有一定的危险性，不适合作为长期使用的化妆品的配方。目前，随着大众对美白的认识加深，人们了解到深浅肤色的差异与皮肤中的黑色素含量有密切的关系。黑色素是存在于每个人皮肤基底层的一种蛋白质。紫外线的照射会令黑色素产生变化，生成一种保护皮肤的物质，然后黑色素又经由细胞代谢的层层移动，到了肌肤表皮层，形成了我们所看到的色斑和肤色不匀等皮肤问题。而黑色素的合成需要络氨酸酶的参与，于是含有各种不同的络氨酸酶抑制剂的美白产品不断出现。常用的络氨酸酶的抑制剂有曲酸，熊果苷和一些中草药提取物，然而这些物质用于美白产品中，效果并不是非常明显。随着科研工作者的不断研究，一种新的美白思路出现，利用小核酸即siRNA来产生美白作用。siRNA能够与特异的mRNA结合，并沉默mRNA，使与黑色素合成相关的基因表达水平降低，从而产生美白作用。(Geusens B,Sanders N,Prow T,et al.Cutaneousshort-interfering RNA therapy[J].Expert opinion on drug delivery,2009,6(12):1333-1349；Yi X,Zhao G,Zhang H,et al.MITF-siRNA formulation is a safe andeffective therapy for human melasma[J].Molecular Therapy,2011,19(2):362-371.)这种美白方式较为安全有效。与黑色素形成相关的基因有：络氨酸酶(tyr)，络氨酸酶相关蛋白(tyrp)和小眼相关转录因子(mitf)。
为了能使小核酸即siRNA能够更加有效地透过皮肤表层而发挥其对mRNA的沉默作用，许多纳米材料得以运用，比如阳离子柔性脂质体。(Gonzalez-Rodriguez M L,RabascoA M.Charged liposomes as carriers to enhance the permeation through the skin[J].Expert opinion on drug delivery,2011,8(7):857-871.)这些纳米材料复合siRNA后能够增加siRNA的稳定性，并且促进siRNA的透皮。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种小核酸纳米美白霜，主要由小核酸活性成分、纳米材料、乳膏基质组成，各组分质量百分比如下：小核酸活性成分0.002％-0.01％，纳米材料0.03％-0.4％，乳膏基质99.59％-99.968％。
进一步的，所述小核酸活性成分为TYR-siRNA。TYR-siRNA的序列如SEQ.NO.1：5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)和SEQ.NO.2：3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU所述。二条序列为互补链。
进一步的，所述纳米材料选用柔性脂质体、聚乙烯亚胺、固体脂质纳米粒、angiopep-2多肽中的任何一种。
进一步的，所述柔性脂质体由(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵和胆酸钠组成,其质量比为6:1。其制备方法为：(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵溶于氯仿，胆酸钠溶于无水乙醇，混合两溶液后,置于无水的圆底烧瓶中，55℃旋蒸除去溶剂，再用氮气吹干，然后用羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，冰浴中探头超声。
进一步的，所述固体脂质纳米粒由单硬脂酸甘油酯和硬脂铵组成，其质量比为4:1。其制备方法为：单硬脂酸甘油酯与硬脂铵溶于70℃的乙醇，快速注入到快速搅拌的70℃的羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)中，然后冷却至室温。
进一步的，所述乳膏基质由如下重量百分数的组分组成：单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％-0.5％，余量为去离子水。
本发明的另一个目的是提供一种小核酸纳米美白霜的制备方法，包括以下步骤：
(1)用羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)将小核酸活性成分和纳米材料溶解，在搅拌状态下将小核酸活性成分的溶液缓慢逐滴地加入到纳米材料溶液中，继续搅拌使小核酸活性成分和纳米材料能充分混合，直至形成纳米复合物，备用。
(2)在搅拌状态下向水中加入透明质酸钠、吐温60和丙二醇，加热至65℃形成水相原料，备用。
(3)将单硬脂酸甘油酯、鲸蜡醇、辛酸癸酸甘油三酯、凡士林混合，在搅拌下加热到65℃形成油相原料，备用。
(4)在65℃并快速搅拌下，将所述油相原料逐步加入到所述水相原料中，混合均匀后，于室温下不停搅拌，待其冷却到35℃，形成乳膏基质。
(5)将步骤(1)所得的纳米复合物加入到步骤(4)所得的乳膏基质中，搅拌混合均匀，然后冷却至室温，即得所述的小核酸纳米美白霜。在制备抑制皮肤络氨酸酶的表达的制剂中的应用。
本发明的在一个目的是一种小核酸纳米美白霜在制备抑制皮肤络氨酸酶的表达的制剂中的应用。
本发明采用TYR-siRNA作为小核酸活性成分，利用纳米材料复合TYR-siRNA，并且乳膏中还含有保湿因子，促进透皮的成分等，可应用于化妆品领域，发挥美白作用。本发明所述小核酸纳米美白霜能有效抑制黑色素生成，抑制皮肤络氨酸酶的表达，具有美白保湿功效。
附图说明
图1是western blot条带。
具体实施方式
本发明用以下实施例予以解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例1
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.002％，柔性脂质体0.028％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。
该小核酸纳米美白霜的制备方法，包括如下步骤：
(1)(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵溶于氯仿，胆酸钠溶于无水乙醇，混合两溶液后,置于无水的圆底烧瓶中，55℃旋蒸除去溶剂，再用氮气吹干，然后用羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，冰浴中探头超声，形成柔性脂质体。
(2)用羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)将TYR-siRNA溶解，在搅拌状态下将TYR-siRNA溶液缓慢逐滴地加入到柔性脂质体溶液中，继续搅拌使TYR-siRNA和柔性脂质体能充分混合，直至形成纳米复合物，备用。
(3)在搅拌状态下向水中加入透明质酸钠、吐温60和丙二醇，加热至65℃形成水相原料，备用。
(4)将单硬脂酸甘油酯、鲸蜡醇、辛酸癸酸甘油三酯、凡士林混合，在搅拌下加热到65℃形成油相原料，备用。
(5)在65℃并快速搅拌下，将所述油相原料逐步加入到所述水相原料中，混合均匀后，于室温下不停搅拌，待其冷却到35℃，形成乳膏基质。
(6)将步骤(2)所得的纳米复合物加入到步骤(5)所得的乳膏基质中，搅拌混合均匀，然后冷却至室温，即得所述的小核酸纳米美白霜。
实施例2
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.005％，柔性脂质体0.07％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温606.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。
该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例1。
实施例3
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.01％，柔性脂质体0.14％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温606.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例1。
实施例4
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.005％，柔性脂质体0.07％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温606.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.2％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例1。
实施例5
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.01％，柔性脂质体0.14％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温606.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.2％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例1。
实施例6
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.002％，柔性脂质体0.028％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.5％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例1。
实施例7
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.005％，柔性脂质体0.07％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温606.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.5％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例1。
实施例8
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.005％，固体脂质纳米粒0.02％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。
该小核酸纳米美白霜的制备方法，包括如下步骤：
(1)单硬脂酸甘油酯与硬脂铵溶于70℃的乙醇，快速注入到快速搅拌的70℃的羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)中，然后冷却至室温，形成固体脂质纳米粒。
(2)用羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)将TYR-siRNA溶解，在搅拌状态下将TYR-siRNA溶液缓慢逐滴地加入到固体脂质纳米粒溶液中，继续搅拌使TYR-siRNA和固体脂质纳米粒能充分混合，直至形成纳米复合物，备用。
(3)在搅拌状态下向水中加入透明质酸钠、吐温60和丙二醇，加热至65℃形成水相原料，备用。
(4)将单硬脂酸甘油酯、鲸蜡醇、辛酸癸酸甘油三酯、凡士林混合，在搅拌下加热到65℃形成油相原料，备用。
(5)在65℃并快速搅拌下，将所述油相原料逐步加入到所述水相原料中，混合均匀后，于室温下不停搅拌，待其冷却到35℃，形成乳膏基质。
(6)将步骤(2)所得的纳米复合物加入到步骤(5)所得的乳膏基质中，搅拌混合均匀，然后冷却至室温，即得所述的小核酸纳米美白霜。
实施例9
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.01％，固体脂质纳米粒0.04％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.1％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例8。
实施例10
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.005％，聚乙烯亚胺0.00665％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。
该小核酸纳米美白霜的制备方法，包括如下步骤：
(1)用羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)将TYR-siRNA和聚乙烯亚胺溶解，在搅拌状态下将TYR-siRNA溶液缓慢逐滴地加入到聚乙烯亚胺溶液中，继续搅拌使TYR-siRNA和聚乙烯亚胺能充分混合，直至形成纳米复合物，备用。
(2)在搅拌状态下向水中加入透明质酸钠、吐温60和丙二醇，加热至65℃形成水相原料，备用。
(3)将单硬脂酸甘油酯、鲸蜡醇、辛酸癸酸甘油三酯、凡士林混合，在搅拌下加热到65℃形成油相原料，备用。
(4)在65℃并快速搅拌下，将所述油相原料逐步加入到所述水相原料中，混合均匀后，于室温下不停搅拌，待其冷却到35℃，形成乳膏基质。
(5)将步骤(1)所得的纳米复合物加入到步骤(4)所得的乳膏基质中，搅拌混合均匀，然后冷却至室温，即得所述的小核酸纳米美白霜。
实施例11
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.01％，聚乙烯亚胺0.0133％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例10。
实施例12
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.005％，angiopep-2多肽0.2％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.05％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。
该小核酸纳米美白霜的制备方法，包括如下步骤：
(1)用羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液(pH7.4)将TYR-siRNA和angiopep-2多肽溶解，在搅拌状态下将TYR-siRNA溶液缓慢逐滴地加入到angiopep-2多肽溶液中，继续搅拌使TYR-siRNA和angiopep-2多肽能充分混合，直至形成纳米复合物，备用。
(2)在搅拌状态下向水中加入透明质酸钠、吐温60和丙二醇，加热至65℃形成水相原料，备用。
(3)将单硬脂酸甘油酯、鲸蜡醇、辛酸癸酸甘油三酯、凡士林混合，在搅拌下加热到65℃形成油相原料，备用。
(4)在65℃并快速搅拌下，将所述油相原料逐步加入到所述水相原料中，混合均匀后，于室温下不停搅拌，待其冷却到35℃，形成乳膏基质。
(5)将步骤(1)所得的纳米复合物加入到步骤(4)所得的乳膏基质中，搅拌混合均匀，然后冷却至室温，即得所述的小核酸纳米美白霜。
实施例13
一种小核酸纳米美白霜，包括如下重量百分比的组分：TYR-siRNA0.01％，angiopep-2多肽0.4％，单硬脂酸甘油酯4％、鲸蜡醇6％、辛酸癸酸甘油三酯7.5％、凡士林25.5％、吐温60 6.5％、丙二醇10％、透明质酸钠0.1％，余量为去离子水。
本发明中TYR-siRNA的序列如下：
序列方向5’-3’AAGCGAGUCUUGAUUAGAA(dTdT)，3’-5’UUCGCUCAGAACUAAUCUU，二条序列为互补链。该小核酸纳米美白霜的制备方法同实施例12。
实施例14
取实施例2，实施例8，实施例12所提供的乳膏，进行动物实验，考察TYR-siRNA对络氨酸酶表达的抑制效果。
实验步骤如下：
以Balb/c小鼠为模型，在实验前一天剔除背部的毛，把实施例2，实施例8，实施例12所提供的乳膏分别均匀涂在小鼠背部皮肤上(大约黄豆大乳膏，抹匀)，每天涂抹2次，一共16天。然后处死小鼠并取出皮肤，用冰的PBS洗涤，用液氮速冻后，研磨成粉末，加入组织裂解液和蛋白酶抑制剂，研磨使其充分混合后，吸取至EP管中；4℃下15000rpm离心15min，上清液用上样缓冲液稀释，95摄氏度加热5min使蛋白变性。采用western blot考察络氨酸酶的表达情况。Western blot结果见图1。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种小核酸纳米美白霜及制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
aagcgagucu ugauuagaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
uucgcucaga acuaaucuu 19

Claims (4)

1.一种小核酸纳米美白霜，其特征在于，由小核酸活性成分、纳米材料、乳膏基质组成，各组分质量百分比如下：小核酸活性成分0.002%-0.01%，纳米材料0.03%-0.4%，乳膏基质99.59%-99.968%，所述小核酸活性成分为TYR-siRNA，TYR-siRNA的序列如SEQ.NO.1和SEQ.NO.2所示；所述纳米材料选用柔性脂质体、聚乙烯亚胺、固体脂质纳米粒中的任何一种；所述柔性脂质体由(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵和胆酸钠组成，其质量比为6:1；所述固体脂质纳米粒由单硬脂酸甘油酯和硬脂铵组成，其质量比为4:1。
2.根据权利要求1所述的一种小核酸纳米美白霜，其特征在于：所述乳膏基质由如下重量百分数的组分组成：单硬脂酸甘油酯4%、鲸蜡醇6%、辛酸癸酸甘油三酯7.5%、凡士林25.5%、吐温60 6.5%、丙二醇10%、透明质酸钠0.05%-0.5%，余量为去离子水。
3.权利要求1所述的小核酸纳米美白霜的制备方法，其特征在于：通过以下步骤实现：
（1）用pH7.4的羟乙基哌嗪乙磺酸盐缓冲液将小核酸活性成分和纳米材料溶解，在搅拌状态下将小核酸活性成分的溶液缓慢逐滴地加入到纳米材料溶液中，继续搅拌使小核酸活性成分和纳米材料能充分混合，直至形成纳米复合物，备用；
（2）在搅拌状态下向水中加入透明质酸钠、吐温60和丙二醇，加热至65℃形成水相原料，备用；
（3）将单硬脂酸甘油酯、鲸蜡醇、辛酸癸酸甘油三酯、凡士林混合，在搅拌下加热到65℃形成油相原料，备用；
（4）在65℃并快速搅拌下，将所述油相原料逐步加入到所述水相原料中，混合均匀后，于室温下不停搅拌，待其冷却到35℃，形成乳膏基质；
（5）将步骤（1）所得的纳米复合物加入到步骤（4）所得的乳膏基质中，搅拌混合均匀，然后冷却至室温，即得所述的小核酸纳米美白霜。
4.根据权利要求1所述的一种小核酸纳米美白霜在制备抑制皮肤中络氨酸酶的表达制剂中的应用。
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