CN110088276B

CN110088276B - 增加塑料降解的蛋白酶

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Publication number: CN110088276B
Application number: CN201780076589.5A
Authority: CN
Inventors: A·马蒂; S·迪奎斯内; M·吉谢尔; M·维耶曼; M·本·卡勒德
Original assignee: Carbios SA
Current assignee: Carbios SA
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: US20210009980A1; JP7179002B2; US10829754B2; CN110088276A; US11345906B2; BR112019012258A2; EP3555281A1; AU2017378120B2; JP2020513746A; WO2018109183A1; US20190345472A1; CA3045106A1; AU2017378120A1; CN115927269A; MX2019007024A

Abstract

本发明涉及新型蛋白酶，更具体地，涉及与SEQ ID NO：1的蛋白酶相比具有改进活性的蛋白酶变体，及其用于降解含聚酯材料如塑料产品的用途。本发明的蛋白酶特别适于降解聚乳酸和含聚乳酸的材料。

Description

增加塑料降解的蛋白酶

技术领域

本发明涉及新型蛋白酶，更具体地，涉及与亲本蛋白酶相比具有改进活性的蛋白酶及其用于降解含聚酯材料如塑料产品的用途。本发明的蛋白酶特别适于降解聚乳酸和含聚乳酸的材料。

背景技术

蛋白酶能够催化多种聚合物(包括聚酯)的水解。在这种情况下，蛋白酶在许多工业应用中显示出有希望的效果，包括作为洗碗和洗衣应用的洗涤剂，作为用于处理生物质和食品的降解酶，作为环境污染物解毒中的生物催化剂或用于处理纺织工业中的聚酯织物。同样，使用蛋白酶作为水解聚乳酸(PLA)的降解酶特别令人感兴趣。实际上，PLA是用于许多技术领域的一种生物基聚合物，例如柔性和刚性包装、袋子、覆盖薄膜，以及制造衣服和地毯。因此，填埋场中的PLA积聚成为一个日益严重的生态问题。

在蛋白酶中，丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)是切割蛋白质中的肽酰胺键的酶，其中丝氨酸用作酶活性位点中的亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶在真核生物和原核生物中普遍存在。许多细菌丝氨酸蛋白酶最初在芽孢杆菌(Bacillus)中被鉴定，最近也在其他嗜常温宿主中被鉴定。然而，已经从嗜热和超嗜热细菌中分离越来越多的丝氨酸蛋白酶。例如，来自水生栖热菌(Thermus aquatic)YT-1的aqualysin I已被克隆、测序并在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达。

生物降解，尤其是酶降解，被认为是减少塑料废物积聚的令人感兴趣的解决方案。实际上，酶能够加速含聚酯材料，尤其是塑料产品的水解，甚至低至单体水平。此外，水解物(即单体和低聚物)可以作为合成新聚合物的材料回收。最近，已开发出新的塑料材料，其整合了适于降解塑料材料的至少一种聚合物的生物实体，从而产生可生物降解的塑料产品。例如，已经生产出含有蛋白酶的由PLA制成的塑料产品。这种可生物降解的塑料可以至少部分地解决填埋场和自然栖息地中塑料堆积的问题。

在这种情况下，已经鉴定了几种蛋白酶作为候选降解酶。例如，已经描述了小单孢菌属(Micromonospora sp.)(WO 2016/146540)的蛋白酶降解聚酯，更特别是聚乳酸的能力。

然而，仍然需要在高温下具有改进的活性和/或改进的稳定性的蛋白酶，使得降解过程效率更高，从而提高可生物降解塑料生产过程、生物聚酯降解过程和/或生物回收过程的竞争力。

发明简述

本发明提供了新型蛋白酶，其是亲本或野生型蛋白酶的变体，与所述野生型蛋白酶相比显示出增加的聚酯降解活性。更具体地，本发明提供了具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的亲本蛋白酶的变体，其对应于UniProtKB中称为P80146的氨基酸序列的133-410位氨基酸，并且其对应于Munro等，1995 Jul,Microbiology,141(Pt 7):1731-8描述的成熟蛋白酶的氨基酸序列(来自栖热菌属(Thermus sp.)菌株Rt41A的碱性丝氨酸蛋白酶)，并且在Munro等，1995中描述为在70℃下表现出超过24小时的稳定性。野生型蛋白酶和变体都被认为是枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶特别适用于降解塑料材料和产品，例如含有聚乳酸(PLA)的塑料材料和产品的方法。因此，本发明进一步提供了使用蛋白酶来降解含有聚乳酸(PLA)的塑料材料和产品的方法，所述蛋白酶与SEQ ID NO：1所示的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％的同一性，并且与SEQ ID NO:1相比，可能在特定氨基酸上具有一个或多个取代。

在这方面，本发明的一个目的是提供一种蛋白酶变体，其(i)与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性，和(ii)具有至少一个选自以下位置的取代：N102、S104、S106、N107、G132、G134、D160或Y167，其中所述位置参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号。有利地，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，所述蛋白酶变体表现出聚酯降解活性，并且优选增加的聚酯降解活性。

在一个具体的实施方案中，蛋白酶包含至少一个在S104位置的取代。

根据一个具体的实施方案，蛋白酶可以包含至少一种选自以下取代的组合：S104L+N107I、S104L+Y167R、D160E+Y167R、N102S+D160E+Y167R、S106T+D160E+Y167R、N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+D160E+Y167R、S106T+N107T+D160E+Y167R、N102S+N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I、N102F+S104L+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I、N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+Y167R和N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167R，其中所述位置参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号。

本发明的另一个目的是提供编码本发明的蛋白酶的核酸。本发明还涉及包含所述核酸的表达盒或表达载体，和包含所述核酸、表达盒或载体的宿主细胞。

本发明的进一步目的是提供产生本发明的蛋白酶的方法，包括：

(a)在适于表达编码蛋白酶的核酸的条件下培养根据本发明的宿主细胞；和任选地

(b)从细胞培养物回收所述蛋白酶。

本发明还涉及降解包含至少一种聚酯，优选PLA的塑料产品的方法，包括：

(a)将塑料产品与根据本发明的蛋白酶或宿主细胞接触，从而降解所述塑料产品；和任选地

(b)回收单体和/或低聚物，优选乳酸(LA)的单体和/或低聚物。

本发明还涉及含有聚酯的材料，其包含根据本发明的蛋白酶或宿主细胞。更优选地，本发明涉及含有聚乳酸(PLA)的材料，其包含根据本发明的蛋白酶或宿主细胞。本发明还提供一种生产这种含有聚酯的材料的方法，该方法包括混合聚酯(优选PLA)和本发明的蛋白酶或宿主细胞的步骤，其中混合步骤在聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，优选在挤出过程中进行。

本发明的另一个目的是提供含有聚酯的材料，更优选含有PLA的材料，其包含具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白酶。本发明还提供一种生产这种含有聚酯的材料的方法，该方法包括混合聚酯(优选PLA)和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白酶的步骤，其中混合步骤在聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，优选在挤出过程中进行。

本发明进一步涉及如上所述的蛋白酶变体和/或具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白酶用于降解含聚酯材料，更优选含PLA材料的用途。

发明详述

定义

通过参考以下定义将最好地理解本公开。

本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“酶”是指通过肽键连接的氨基酸链，而不管形成所述链的氨基酸的数量。根据以下命名法，本文中的氨基酸由它们的单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(精氨酸)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。

术语“蛋白酶”或“蛋白质酶”是指根据酶命名法属于分类为EC3.4的一类水解酶的酶，其催化肽或蛋白质中肽键的水解以产生更短的肽。术语“丝氨酸蛋白酶”是指根据酶委员会的命名法分类为EC 3.4.21的蛋白酶。

术语“野生型蛋白质”或“亲本蛋白质”可互换使用，是指天然存在的多肽的非突变形式。在本文中，亲本蛋白酶是指具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白酶。

因此，术语“突变体”和“变体”可互换使用，是指衍生自SEQ ID NO:1的多肽，其包含在一个或多个(例如，几个)位置的修饰或改变，即取代、插入和/或缺失，并且优选具有聚酯降解活性。可以通过本领域熟知的各种技术获得变体。特别地，用于改变编码野生型蛋白质的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建。

本文所用的与位置或氨基酸有关的术语“修饰”或“改变”是指与野生型蛋白质的氨基酸相比，特定位置的氨基酸已被修饰。

“取代”是指氨基酸残基被另一个氨基酸残基替换。优选地，术语“取代”是指用选自以下的另一个氨基酸残基替换氨基酸残基：天然存在的标准20个氨基酸残基、罕见的天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、异羟基赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别-异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和非天然存在的氨基酸残基，通常是合成的(例如环己基-丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指用另一种选自天然存在的标准20个氨基酸残基(G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S和T)替换氨基酸残基。符号“+”表示取代的组合。在本文中，以下术语用于表示取代：Y167R表示亲本序列的第167位氨基酸残基酪氨酸(Y)变为精氨酸(R)。Y167V/I/M表示亲本序列的第167位氨基酸残基酪氨酸(Y)被下列氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守或非保守取代。保守取代的实例在以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。

与氨基酸有关的术语“缺失”是指氨基酸已被除去或不存在。

术语“插入”是指添加了一个或多个氨基酸。

除非另有说明，否则本申请中公开的位置通过参考SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行编号。

如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指两个多肽序列之间匹配(相同氨基酸残基)的数目(或以百分比表示的分数)。通过在比对时比较序列来测定序列同一性，以便最大化重叠和同一性，同时最小化序列空位。特别地，取决于两个序列的长度，可以使用许多数学全局或局部比对算法中的任何一种来测定序列同一性。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970)进行比对，其在整个长度上最佳地比对序列，而明显不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等，1997；Altschul等，2005))进行比对。用于测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用互联网网站例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/or http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上可获得的公共可用计算机软件)。本领域技术人员可以测定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。为了本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle(其使用Needleman-Wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对)产生的值，其中将所有检索参数设置为默认值，即，Scoring matrix＝BLOSUM62，Gap open＝10，Gap extend＝0.5，End gappenalty＝false，End gap open＝10和End gap extend＝0.5。

术语“重组”是指通过基因工程产生的核酸构建体、载体、多肽或细胞。

如本文所用，术语“表达”是指涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

术语“表达盒”表示包含编码区(即本发明的核酸)和可操作地连接的调控区(即包含一个或多个控制序列)的核酸构建体。

如本文所用，术语“表达载体”是指包含本发明的表达盒的DNA或RNA分子。优选地，表达载体是线性或环状双链DNA分子。

“聚合物”是指化学化合物或化合物的混合物，其结构由通过共价化学键连接的多个单体(重复单元)构成。在本发明的上下文中，术语聚合物包括天然或合成聚合物，其由单一类型的重复单元(即，均聚物)或不同重复单元的混合物(即，共聚物或杂聚物)构成。根据本发明，“低聚物”是指含有2至约20个单体的分子。

在本发明的上下文中，“含有聚酯的材料”或“含有聚酯的产品”是指包含至少一种聚酯的产品，例如塑料产品，所述聚酯是结晶、半结晶或完全无定形的形式。在一个具体的实施方案中，含有聚酯的材料是指由至少一种塑料材料制成的任何物品，例如塑料片、管、棒、型材、形状、膜、大块、纤维、纺织品等，其包含至少一种聚酯和可能的其他物质或添加剂，如增塑剂、矿物或有机填料。在另一个具体实施方案中，含有聚酯的材料是指包含至少一种含聚酯纤维的纺织品或织物。在另一个具体实施方案中，含有聚酯的材料是指熔融或固体状态的塑料复合物或塑料制剂，其适于制造塑料产品。

在本说明书中，“聚酯”包括聚乳酸(PLA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸异山梨酯(PEIT)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚丁二酸丁二酸己二酸酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚呋喃乙酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)和这些聚合物的共混物/混合物。

新型蛋白酶

通过开发与目前可获得的酶相比具有改进的聚酯降解活性的新型蛋白酶，本发明人发现了一种具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列并且在70℃下表现出超过24小时稳定性的丝氨酸蛋白酶(Munro等，1995)，有趣的是还表现出聚酯降解活性。本发明人进一步研究了该酶，并开发了该酶的特定变体，与该亲本蛋白质相比，其表现出改进的聚酯降解活性。更具体地，本发明人设计了用于工业过程的具有优异性质的新型酶。为了在可以进行可降解塑料产品的工业生产和/或可以获得塑料产品的环境降解的条件下改进蛋白酶的活性，本发明人开发了衍生自SEQ ID NO:1蛋白酶的新型蛋白酶，与该亲本蛋白酶相比，其显示出更高的活性。本发明的蛋白酶特别适合降解含有PLA的塑料产品。与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶有利地表现出增加的对聚酯，特别是对PLA的特异性降解活性。有趣的是，本发明人已经鉴定了特定的氨基酸残基，其在蛋白质结构中意欲与聚酯底物接触，并且可以被有利地修饰以促进聚酯底物与蛋白质的接触，从而增加该聚酯上的酶的吸附和/或蛋白质的降解活性。

在本发明的上下文中，术语“增加的降解活性”表示与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，酶降解塑料产品或材料，更具体是含聚酯的塑料产品或材料，甚至更具体是含PLA的塑料产品或材料的能力增加。与亲本蛋白酶相比，这种增加通常为约5％、10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。

根据本领域本身已知的方法，本领域技术人员可以评估蛋白质的降解活性。例如，可以通过以下来评估活性：测量蛋白酶的比活性率、测量pNA(N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺)的水解、测定聚酯的比解聚活性率、测量降解分散在琼脂板中的固体聚酯化合物的速率、测量含聚酯的乳液的浊度降低，或测量反应器中聚酯的比解聚活性率。

在本发明的上下文中，用于目标聚酯的术语“比降解活性”表示在适当的温度、pH和缓冲液条件下，当将含有所述目标聚酯的塑料产品与根据本发明的蛋白酶接触时，每mg酶每小时释放的单体和/或低聚物的初始速率(以mg表示)。例如，PLA的比降解活性对应于每mg酶每小时产生的mg乳酸和乳酸二聚体，或者对应于每mg酶每分钟水解的μmol PLA，如在水解曲线的线性部分所测定。

根据本发明的一个实施方案，蛋白酶是SEQ ID NO:1的蛋白酶的变体，其与SEQ IDNO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性，并且具有至少一个选自N102、S104、S106、N107、G132、G134或Y167位置的取代，其中所述位置参照SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列编号。在一个具体的实施方案中，蛋白酶变体还包含在D160位置的额外取代。

根据另一个实施方案，蛋白酶是SEQ ID NO:1的蛋白酶的变体，其与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性，并且具有至少一个选自N102、S104、S106、N107、G132、G134、D160或Y167位置的取代，其中所述位置参照SEQID NO：1所示的氨基酸序列编号。

根据本发明，可以用选自标准天然存在的氨基酸残基、罕见的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的任何一种其他氨基酸取代目标氨基酸。优选地，可以用19种其他氨基酸中的任何一种取代目标氨基酸。在一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，蛋白酶变体包含选自N102、S104、S106、N107、G132、G134、D160和Y167位置的单个取代。优选地，蛋白酶变体包含选自N102S/F、S104L、S106T、N107T/I、G132I、G134K、D160E和Y167R，更优选选自N102F、S104L、N107I、G132I、G134K、D160E和Y167R，甚至更优选地选自S104L和Y167R的单个取代。

在另一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，蛋白酶变体包含一个以上的取代，并且至少一个取代在选自N102、S104、S106、N107、G132、G134、D160和Y167的位置，优选地，在选自Y167、S106和S104的位置处。

有利地，蛋白酶变体包含至少一个选自N102S/F，S104L、S106T、N107T/I、G132I、G134K，D160E和Y167R，优选选自Y167R、N102F、S104L、S106T和N107I，更优选选自Y167R、S106T和S104L的取代。

在一个具体实施方案中，蛋白酶变体包含至少两个选自N102、S104、S106、N107、G132、G134、D160和Y167位置的取代。在一个具体实施方案中，蛋白酶变体包含至少两个选自N102S/F、S104L、S106T、N107T/I、G132I、G134K、D160E和Y167R的取代。

根据一个具体实施方案，变体包含至少选自以下的两个取代的组合：D160E+Y167R；N102S+Y167R；S106T+Y167R；G134K+Y167R；S104L+G134K；N107T+Y167R；S104L+Y167R；S104L+N107I，优选D160E+Y167R、S104L+N107I和S104L+Y167R。

在一个具体实施方案中，蛋白酶变体包含至少三个选自N102、S104、S106、N107、G132、G134、D160和Y167位置的取代。在一个具体实施方案中，蛋白酶变体包含至少选自以下的三个取代的组合：N102S+S106T+Y167R；N102S+N107T+Y167R；N102S+D160E+Y167R；S106T+N107T+Y167R；S106T+D160E+Y167R；N107T+D160E+Y167R；N102F+S104L+Y167R；N102F+S104L+N107I；S104L+G134K+Y167R；G134K+D160E+Y167R；S104L+N107I+G134K；N102F+N107I+Y167R；S104L+N107I+Y167R和S104L+G132I+Y167R。

根据一个具体实施方案，变体包含至少选自以下的取代的组合：N102S+S106T+N107T+Y167R、N102S+S106T+D160E+Y167R、N102S+N107T+D160E+Y167R、S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+G134K、S104L+N107I+G134K+Y167R、N102F+S104L+D160E+Y167R和N102F+S104L+S106T+N107I，优选N102F+S104L+S106T+N107I和N102F+S104L+D160E+Y167R，更优选N102F+S104L+S106T+N107I。

根据一个具体实施方案，变体包含至少选自以下的取代的组合：N102S+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+G134K+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G134K、S104L+S106T+N107I+G134K+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R和N102F+S104L+S106T+N107I+G132I,优选N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R或N102F+S104L+S106T+N107I+G132I。

根据一个具体实施方案，变体包含至少选自以下的取代的组合：N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G134K+Y167R或N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+Y167R，优选N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R。

根据一个具体实施方案，变体包含至少以下取代的组合：N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167R或N102F+S104L+S106T+N107I+G134K+D160E+Y167R，优选N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167R。

根据一个具体实施方案，变体包含至少取代的组合N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+G134K+D160E+Y167R。

有利地，蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶在N末端包含作为“前肽”的氨基酸序列，其至少部分地负责3D折叠和蛋白酶成熟。

特别地，蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶在N末端包含与SEQ ID NO:42所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

根据一个具体实施方案，蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶在N末端包含与SEQ ID NO:42所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有至少一个选自R24、Y75、D106、Q107、E108、V109、R110、A111和F112的位置的氨基酸取代，其中所述位置参考SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列编号。根据本发明，可以用选自标准天然存在的氨基酸残基、罕见的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的任何一种其他氨基酸取代目标氨基酸。优选地，可以用19种其他氨基酸中的任何一种取代目标氨基酸。

变体的聚酯降解活性

本发明的一个目的是提供具有蛋白酶活性的新型酶。

在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶变体具有聚酯降解活性，优选聚乳酸降解活性。有趣的是，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的亲本蛋白酶也具有聚酯降解活性，优选聚乳酸降解活性。优选地，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶变体表现出增加的聚酯降解活性。

有利地，本发明的蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶至少在10℃至90℃，优选40℃至80℃，更优选60℃至80℃，甚至更优选70℃至80℃的温度范围内，甚至更优选在75℃表现出聚酯降解活性。在另一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶变体和/或亲本蛋白酶在20℃至80℃，优选30℃至70℃，更优选40℃至60℃，甚至更优选40℃至50℃，优选45℃下表现出聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，聚酯降解活性在40℃至80℃，优选在40℃至60℃，甚至更优选在45℃的温度下仍可测量。在另一个具体实施方案中，聚酯降解活性在对应于天然环境中的平均温度的10℃至30℃，优选15℃至28℃的温度下仍可测量。

在一个具体实施方案中，蛋白酶变体在45℃下的聚酯降解活性比SEQ ID NO:1蛋白酶的聚酯降解活性高至少5％，优选高至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％或更高。

在另一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶变体在10℃-90℃，更优选在40℃-80℃，甚至更优选在60℃-80℃，甚至更优选在75℃的温度下具有增加的聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，蛋白酶变体在75℃下的聚酯降解活性比SEQ ID NO:1蛋白酶的聚酯降解活性高至少5％，优选高至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％或更高。

在一个具体实施方案中，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶变体在10℃-30℃，更优选在15℃-30℃，甚至更优选在20℃-30℃，甚至更优选在28℃的温度下具有增加的聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，蛋白酶变体在28℃下的聚酯降解活性比SEQID NO:1蛋白酶的聚酯降解活性高至少5％，优选高至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％或更高。

在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶变体至少在5至11的pH范围内，优选在6至10的pH范围内，更优选在6.5至9的pH范围内，甚至更优选在7至8的pH范围内显示出可测量的聚酯降解活性。

变体的热稳定性

有利地，与亲本蛋白酶的热稳定性相比，变体的热稳定性没有被显著损害。更有利地，与SEQ ID NO:1的亲本蛋白酶的热稳定性相比，变体的热稳定性提高。在本发明的上下文中，术语“提高的热稳定性”表示酶在高温下，特别是在40℃-90℃的温度下，与SEQ IDNO:1的蛋白酶相比，抵抗其化学和/或物理结构变化的能力增强。特别地，与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，本发明的蛋白酶在40℃-90℃的温度下可具有增加的半衰期。特别地，与SEQID NO:1的蛋白酶相比，蛋白酶可以表现出更高或相同的熔融温度(Tm)。特别地，本发明的变体在挤出过程中，更具体地在50℃-250℃，优选130℃-180℃的温度下实施的挤出过程中显示提高的热稳定性。

本发明的蛋白酶可包含如上公开的一种或几种修饰。

根据本领域本身已知的方法，本领域技术人员可以评估蛋白质的热稳定性。例如，可以通过测量在不同温度下孵育后，酶的残留蛋白酶活性和/或残留聚酯解聚活性(即聚酯降解活性)来评估热稳定性。还可以评估在不同温度下进行多轮聚酯解聚测定的能力。快速定性测试可以包括通过光晕直径测量评估在不同温度下孵育后，酶降解分散在琼脂板中的固体聚酯化合物的能力。或者，或另外，可以进行差示扫描荧光测定(DSF)来评估蛋白质/酶的热稳定性。在本发明的上下文中，圆二色性用于量化蛋白质热变性温度的变化，从而测定其熔融温度(Tm)。在本发明的上下文中，给定蛋白质的“熔融温度(Tm)”对应于50％所述蛋白质变性的温度。可以使用圆二色性测量Tm，如实施例部分所公开。

在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶变体的熔融温度(Tm)高于70℃，优选高于75℃。有趣的是，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的亲本蛋白酶的熔融温度(Tm)也高于70℃，优选高于75℃。

核酸、表达盒、载体、宿主细胞

本发明的另一个目的是提供编码如上定义的蛋白酶的核酸。

如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，并且是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。核酸可以是DNA(cDNA或gDNA)、RNA或两者的混合物。它可以是单链形式或双链形式或两者的混合物。它可以是重组的、人造的和/或合成来源，并且它可以包含修饰的核苷酸，包括例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的糖。本发明的核酸可以是分离的或纯化的形式，并且可以通过本领域本身已知的技术，例如cDNA文库的克隆和表达、扩增、酶促合成或重组技术来制备、分离和/或操作。核酸也可以通过众所周知的化学合成技术，如在Belousov(1997)Nucleic AcidsRes.25:3440-3444中所述在体外合成。

本发明还包括在严格条件下与编码如上定义的蛋白酶的核酸杂交的核酸。优选地，这种严格条件包括：在约42℃下，在2×SSC/0.1％SDS中孵育杂交过滤器约2.5小时，然后在65℃下，在1×SSC/0.1％SDS中洗涤过滤器4次，每次15分钟。使用的方案在例如Sambrook等(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in MolecularBiology(1989))的参考文献中描述。

本发明还包括编码本发明蛋白酶的核酸，其中所述核酸的序列或至少一部分所述序列已经使用优化的密码子使用工程化。

或者，可以从根据本发明的蛋白酶的序列推导出根据本发明的核酸，并且可以根据其中转录核酸的宿主细胞来调整密码子使用。这些步骤可以根据本领域技术人员熟知的方法进行，其中一些步骤在Sambrook等(Sambrook等，2001)的参考手册中描述。

本发明的核酸可以进一步包含额外的核苷酸序列，例如调控区，即，可以用于在选定的宿主细胞或系统中引起或调节多肽表达的启动子、增强子、沉默子、终止子、信号肽等。或者或另外，本发明的核酸可进一步包含编码融合蛋白的其他核苷酸序列，例如麦芽糖结合蛋白(MBP)或谷胱甘肽S转移酶(GST)，其可用于促进多肽表达和/或溶解度。

本发明进一步涉及表达盒，其包含与一个或多个控制序列可操作地连接的根据本发明的核酸，所述控制序列指导所述核酸在合适的宿主细胞中的表达。通常，表达盒包含与控制序列，例如转录启动子和/或转录终止子可操作地连接的根据本发明的核酸，或由其组成。控制序列可包括被宿主细胞或体外表达系统识别的启动子，用于表达编码本发明蛋白酶的核酸。启动子含有介导酶表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子可操作地连接到编码蛋白酶的核酸的3'末端。本发明可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。通常，表达盒包含与转录启动子和转录终止子可操作地连接的根据本发明的核酸，或由其组成。

本发明还涉及包含如上定义的核酸或表达盒的载体。

术语“载体”是指用作将重组遗传物质转移到宿主细胞中的介质的DNA分子。载体的主要类型是质粒、噬菌体、病毒、fosmid、粘粒和人工染色体。载体本身通常是由插入物(异源核酸序列，转基因)和作为载体“骨架”的较大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移至宿主的载体的目的通常是在靶细胞中分离、繁殖或表达插入物。称为表达载体的载体(表达构建体)特别适合于在靶细胞中表达异源序列，并且通常具有驱动编码多肽的异源序列表达的启动子序列。通常，存在于表达载体中的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选存在的操纵子。优选地，表达载体还包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择性标志物、有限数量的有用限制酶位点和高拷贝数的可能性。表达载体的实例是克隆载体、修饰的克隆载体、特别设计的质粒和病毒。在不同宿主中提供合适水平的多肽表达的表达载体是本领域熟知的。载体的选择通常取决于载体与要引入载体的宿主细胞的相容性。

本发明的另一个目的是提供包含如上所述的核酸、表达盒或载体的宿主细胞。因此，本发明涉及根据本发明的核酸、表达盒或载体用于转化、转染或转导宿主细胞的用途。载体的选择通常取决于载体与必须引入载体的宿主细胞的相容性。

根据本发明，可以以瞬时或稳定的方式转化、转染或转导宿主细胞。将本发明的表达盒或载体引入宿主细胞，使得盒或载体保持为染色体整合体或自我复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”还包括由于在复制过程中发生的突变而与亲本宿主细胞不同的亲本宿主细胞的任何后代。宿主细胞可以是用于产生本发明变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。宿主细胞也可以是真核细胞，例如酵母、真菌、哺乳动物、昆虫或植物细胞。在一个具体实施方案中，宿主细胞选自大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、栖热菌属或耶氏酵母属(Yarrowia)。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法将根据本发明的核酸、表达盒或表达载体引入宿主细胞，例如电穿孔、偶联、转导、感受态细胞转化、原生质体转化、原生质体融合、生物射弹“基因枪”转化、PEG介导的转化、脂质辅助转化或转染、化学介导的转染、乙酸锂介导的转化、脂质体介导的转化。

任选地，可以将多于一个拷贝的本发明的核酸、盒或载体插入宿主细胞以增加变体的产生。

在一个具体实施方案中，宿主细胞是重组微生物。本发明确实允许将具有改进的降解含聚酯材料的能力的微生物工程化。例如，本发明的序列可用于补充已知能够降解聚酯的真菌或细菌的野生型菌株，以改进和/或增加菌株的能力。

生产蛋白酶变体

本发明的另一个目的是提供一种生产本发明蛋白酶变体的方法，包括表达编码蛋白酶的核酸，和任选地回收蛋白酶。

具体地，本发明涉及生产本发明蛋白酶的体外方法，包括(a)将本发明的核酸、盒或载体与体外表达系统接触；(b)回收产生的蛋白酶。体外表达系统是本领域技术人员公知的并且是可商购的。

优选地，生产方法包括：

(a)在适于表达核酸的条件下培养包含编码本发明蛋白酶的核酸的宿主细胞；和任选地

(b)从细胞培养物中回收所述蛋白酶。

有利地，宿主细胞是重组芽孢杆菌、重组大肠杆菌、重组曲霉属、重组木霉属、重组链霉菌属、重组酵母属、重组毕赤酵母属、重组栖热菌属或重组耶氏酵母属。优选地，宿主细胞是重组芽孢杆菌。

使用本领域已知的方法在适于生产多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或在合适的培养基和允许酶表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。培养在合适的营养培养基中进行，所述营养培养基来自商业供应商或根据公开的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备或适于细胞生长的任何其他培养基。

如果蛋白酶被分泌到营养培养基中，则可以直接从培养物上清液中回收蛋白酶。相反，可以从细胞裂解物中或在透化后回收蛋白酶。可以使用本领域已知的任何方法回收蛋白酶。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收蛋白酶，包括但不限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。任选地，可以通过本领域已知的各种方法部分或完全纯化蛋白酶，包括但不限于热楔、色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取以获得基本上纯的多肽。

蛋白酶可以以纯化形式单独使用或与其它酶组合使用，以催化含聚酯材料(例如含聚酯的塑料产品)的降解和/或回收中涉及的酶促反应。蛋白酶可以是可溶形式，也可以是固相。特别地，它可以与细胞膜或脂质囊泡结合，或与例如珠、柱、板等形式的合成支持物，例如玻璃、塑料、聚合物、过滤器、膜结合。

组合物

本发明的另一个目的是提供包含本发明的蛋白酶或宿主细胞的组合物。在本发明的上下文中，术语“组合物”涵盖任何种类的包含本发明蛋白酶的组合物。在一个具体实施方案中，蛋白酶是分离的或至少部分纯化的形式。

组合物可以是液体或干燥的，例如为粉末的形式。在一些实施方案中，组合物是冻干物。例如，组合物可包含蛋白酶和/或编码本发明蛋白酶的宿主细胞，或其含有所述蛋白酶的提取物，和任选的赋形剂和/或试剂等。适当的赋形剂包括生物化学中常用的缓冲剂、用于调节pH的试剂、防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钠或抗坏血酸钠，保守剂、保护剂或稳定剂，如淀粉、糊精、阿拉伯树胶、盐、糖，例如山梨糖醇、海藻糖或乳糖，甘油、聚乙二醇(polyethyleneglycol)、聚乙二醇(polyethene glycol)、聚丙二醇、丙二醇、二价离子如钙，螯合剂如EDTA，还原剂、氨基酸、载体如溶剂或水溶液等。可以通过将蛋白酶与一种或多种赋形剂混合来获得本发明的组合物。

本发明的组合物可以包含按重量计0.1％至99.9％，优选0.1％至50％，更优选0.1％至30％，甚至更优选0.1％至5％的本发明的蛋白酶和按重量计0.1％至99.9％，优选50％至99.9％，更优选70％至99.9％，甚至更优选95％至99.9％的赋形剂。优选的组合物包含按重量计0.1-5％的本发明蛋白酶。

在一个具体实施方案中，组合物可以进一步包含表现出酶活性的其他多肽。本领域技术人员可以容易地调整本发明的蛋白酶的量，这取决于例如待降解的含有聚酯的材料的性质和/或组合物中含有的其它酶/多肽。

在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶与一种或多种赋形剂，尤其是能够稳定或保护多肽免于降解的赋形剂一起溶解在水性介质中。例如，本发明的蛋白酶可以最终与其他组分，例如甘油、山梨醇、糊精、淀粉、二醇如丙二醇、盐等一起溶解在水中。然后可以干燥所得混合物以获得粉末。干燥这种混合物的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于冻干、冷冻干燥、喷雾干燥、超临界干燥、倒灌蒸发、薄层蒸发、离心蒸发、输送干燥、流化床干燥、滚筒干燥或其任何组合。

在另一个具体实施方案中，本发明的组合物包含至少一种表达本发明蛋白酶的宿主细胞或其提取物。“细胞提取物”表示从细胞获得的任何部分，例如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制剂，或通过化学、物理和/或酶处理从细胞衍生的任何制剂，其基本上不含活细胞。优选的提取物是酶活性提取物。本发明的组合物可包含一种或多种本发明的宿主细胞，或其含有本发明蛋白酶的提取物，和任选的一种或几种另外的细胞。

在一个具体实施方案中，该组合物包含表达和/或分泌本发明蛋白酶的重组微生物的冻干培养基，或由其组成。在一个具体实施方案中，粉末包含本发明的蛋白酶和稳定/增溶量的甘油、山梨醇或糊精，例如麦芽糖糊精和/或环糊精、淀粉、阿拉伯树胶、二醇如丙二醇和/或盐。

蛋白酶的用途

发明人还出乎意料地发现，亲本蛋白也具有聚酯降解活性，由其是聚乳酸降解活性。

因此，本发明的另一个目的是提供使用多肽的方法，所述多肽包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且具有在好氧或厌氧条件下降解和/或回收含有聚酯的材料，例如含有聚酯或由其制成的塑料产品，和/或产生含有聚酯的可生物降解的塑料产品的聚酯降解活性。这种蛋白酶尤其可用于产生含有PLA的可生物降解的塑料产品，和/或用于降解含有PLA的塑料产品。

本发明的进一步目的是提供使用本发明的蛋白酶变体在好氧或厌氧条件下降解和/或回收含有聚酯的材料，例如含有聚酯或由其制成的塑料产品，和/或产生含有聚酯的可生物降解的塑料产品的方法。本发明的蛋白酶变体尤其可用于产生含有PLA的可生物降解的塑料产品，和/或用于降解含有PLA的塑料产品。

因此，本发明的一个目的是使用本发明的蛋白酶，或相应的包含这种蛋白酶的宿主细胞或其提取物，或组合物，或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶来酶促降解含有聚酯的材料，例如含有PLA的材料。

本发明的另一个目的是提供一种降解含有至少一种聚酯的塑料产品的方法，其中塑料产品与本发明的蛋白酶或宿主细胞或组合物，或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶接触，从而降解塑料产品。有利地，含聚酯材料的聚酯被解聚成单体和/或低聚物。在降解方法的一个实施方案中，降解至少一种聚酯以产生可再聚合的单体和/或低聚物，其有利地被回收以便使用。在降解方法的一个优选实施方案中，至少PLA被降解以产生可再聚合的乳酸(LA)的单体和/或低聚物，其有利地被回收以便用于例如生产新的PLA聚合物。

在一个实施方案中，含聚酯材料的聚酯被完全降解。

在一个具体实施方案中，塑料产品包含至少一种选自以下的聚酯：聚乳酸(PLA)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PEIT)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚丁二酸丁二酸己二酸酯(PBSA)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)和这些材料的共混物/混合物，优选聚乳酸。

在一个具体实施方案中，将含有PLA的塑料产品与本发明的蛋白酶或包含与SEQID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶接触，PLA被降解为乳酸的单体和/或低聚物。在一个优选的实施方案中，回收乳酸的单体和/或低聚物用于例如再循环、聚合PLA或甲烷化。

本发明还涉及从含有聚酯的材料产生单体和/或低聚物的方法，包括将含有聚酯的材料暴露于本发明的蛋白酶，或相应的宿主细胞或其提取物，或组合物，或包含与SEQ IDNO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶，和任选地回收所述单体和/或低聚物。本发明的方法尤其可用于从含有PLA的塑料产品产生单体，例如乳酸。

降解含聚酯材料所需的时间可以根据含聚酯材料本身(即，塑料产品的性质和来源、其组成、形状等)、所用的蛋白酶的类型和含量，以及各种处理参数(即，温度、pH、其他试剂等)而变化。本领域技术人员可以容易地使处理参数适应含聚酯材料。

有利地，降解过程在20℃-90℃，优选40℃-80℃，更优选60℃-80℃，更优选70℃-80℃，甚至更优选在75℃的温度下进行。更通常地，将温度保持在低于失活温度，所述失活温度对应于蛋白酶失活和/或重组微生物不再合成蛋白酶的温度。优选地，将温度保持在低于含聚酯材料中的聚酯的玻璃转变温度(Tg)。在该实施方案中，降解过程在20℃-80℃，优选30℃-70℃，更优选40℃-60℃，更优选40℃-50℃，甚至更优选在45℃的温度下进行。更具体地，在可以多次使用和/或回收蛋白酶的温度下，以连续方式进行该过程。

有利地，降解过程在5-11的pH，优选6-10的pH，更优选6.5-9的pH，甚至更优选7-8的pH下进行。

在一个具体实施方案中，可在与蛋白酶接触之前将含聚酯材料进行预处理以物理改变其结构，从而增加聚酯和酶之间的接触表面。

任选地，可以依次或连续地回收由解聚产生的单体和/或低聚物。取决于起始的含聚酯材料，可以回收单一类型的单体和/或低聚物，或几种不同类型的单体和/或低聚物。

可以使用所有合适的纯化方法进一步纯化回收的单体和/或低聚物，并以可再聚合的形式进行调节。纯化方法的实例包括汽提过程、水溶液分离、蒸汽选择性冷凝、生物加工后的介质过滤和浓缩、分离、蒸馏、真空蒸发、萃取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶、浓缩和酸添加脱水和沉淀、纳米过滤、酸催化剂处理、半连续模式蒸馏或连续模式蒸馏、溶剂萃取、蒸发浓缩、蒸发结晶、液/液萃取、加氢、共沸蒸馏、吸附、柱层析、简单真空蒸馏和微滤，合并或不合并。

然后，可再聚合的单体和/或低聚物可用于例如合成聚酯。有利地，相同性质的聚酯被再聚合。然而，可以将回收的单体和/或低聚物与其他单体和/或低聚物混合，以便例如合成新的共聚物。或者，回收的单体可用作化学中间体，以产生新的目标化合物。

本发明的另一个目的是提供一种含聚酯的材料，其中包含本发明的蛋白酶，和/或表达和/或分泌所述蛋白酶重组微生物，和/或其含有这种蛋白酶的提取物，和/或本发明的组合物，和/或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶。在一个具体实施方案中，这种含聚酯材料可以是塑料复合物，母料组合物和/或塑料产品。在本发明的上下文中，“母料组合物”是指所选成分(例如活性剂、添加剂等)的浓缩混合物，其可用于将所述成分引入塑料复合物或产品中以赋予其所需性质。母料组合物可以是固体或液体。优选地，本发明的母料组合物含有至少10重量％的活性成分，更优选本发明的蛋白酶。

因此，本发明的另一个目的是提供一种塑料复合物，其包含本发明的蛋白酶，和/或表达和/或分泌所述蛋白酶的重组微生物或其含有这种蛋白酶的提取物，和/或本发明的组合物，和/或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶，和至少一种聚酯。在一个具体实施方案中，聚酯是聚乳酸(PLA)，优选聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)或聚(DL-乳酸)(PDLLA)。在一个具体实施方案中，塑料复合物可含有其他聚合物，优选选自聚酯，如PBAT、PCL、PET；聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯或天然聚合物如淀粉、纤维素或面粉；和它们的共混物/混合物。更具体地，塑料复合物可含有选自PBAT、面粉或淀粉的其他聚合物。在另一个具体实施方案中，聚酯优选为聚己内酯(PCL)。

因此，本发明的进一步目的是提供一种母料组合物，其包含本发明的蛋白酶，和/或表达和/或分泌所述蛋白酶的重组微生物或其含有这种蛋白酶的提取物，和/或本发明的组合物，和/或包含与SEQ IDNO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶，和至少一种聚酯。在一个具体实施方案中，聚酯是聚乳酸(PLA)，优选聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)或聚(DL-乳酸)(PDLLA)。在另一个具体实施方案中，聚酯优选为聚己内酯(PCL)。

特别地，本发明涉及运用于生产包含这种聚酯的材料(即，塑料复合物、母料组合物或塑料产品)的方法，包括在聚酯是部分或完全熔融状态的温度下，将聚酯与本发明的蛋白酶，和/或重组微生物或其含有这种蛋白酶的提取物，和/或本发明的组合物，和/或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列(其降解所述聚酯)的蛋白酶混合的步骤，使得蛋白酶/微生物整合入含聚酯材料的结构中。在一个具体的实施方案中，方法是挤出方法。

例如，可以在聚酯的玻璃转变温度和熔点之间的温度下，将本发明的蛋白酶和/或组合物，和/或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶与聚酯混合。或者，可以在对应于所述聚酯的熔点的温度或更高温度下，将本发明的蛋白酶和/或组合物，和/或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶与聚酯混合。在一个具体实施方案中，在40℃-250℃，优选50℃-180℃的温度下，将蛋白酶和/或组合物，和/或包含与SEQID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且具有聚酯降解活性的蛋白酶与聚酯混合。或者，在高于40℃，优选高于50℃，甚至更优选高于60℃的温度下，将多肽/组合物与聚酯混合。

在一个优选的实施方案中，聚酯选自聚乳酸(PLA)，并且将蛋白酶/组合物和PLA在60℃-250℃，优选100℃-200℃，更优选130℃-180℃，甚至更优选140℃-160℃的温度下混合。或者，将多肽/组合物和PLA在高于80℃，优选高于100℃，甚至更优选高于130℃，且低于180℃的温度下混合。

在另一个优选的实施方案中，聚酯选自聚己内酯(PCL)，并且将蛋白酶/组合物和PCL在40℃-100℃，优选50℃-80℃的温度下混合。或者，将多肽/组合物和PCL在高于40℃，优选高于50℃，甚至更优选高于55℃，且低于80℃的温度下混合。

更优选地，使用以下进行混合步骤：挤出、双螺杆挤出、单螺杆挤出、注塑、浇铸、热成型、旋转模塑、压缩、压延、熨烫、涂布、分层、膨胀、拉挤成型、挤出吹塑、挤出-膨胀、压缩-造粒、水包油包水双乳液蒸发、3D打印，或本领域技术人员已知的任何技术。

所得塑料复合物、母料组合物或塑料产品整合了包埋在化合物、母料组合物或塑料产品基质中的本发明的蛋白酶/微生物或组合物。

有利地，这种塑料复合物或母料组合物可用于生产因此含有本发明多肽的含聚酯材料和/或塑料制品。

在一个具体实施方案中，所得塑料复合物、母料组合物或塑料制品是可生物降解的塑料复合物、母料组合物或塑料制品，其符合本领域技术人员已知的至少一种相关标准和/或标签，例如标准EN 13432、标准ASTM D6400、OK Biodegradation Soil(Label

)、OK Biodegradation Water(Label

)、OK Compost(Label

)、OK Home Compost(Label

)。

有利地，含聚酯材料(即，塑料复合物、母料组合物或塑料产品)的降解过程在10℃-50℃，优选15℃-40℃，更优选20℃-30℃，更优选在28℃±2℃的温度下进行。

或者，含聚酯材料(即，塑料复合物、母料组合物或塑料产品)的降解过程在50℃-60℃，更优选在55℃±2℃的温度下进行。

通常，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶可用于洗涤剂、食品、动物饲料和药物应用。

更具体地，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶可用作洗涤剂组合物的成分。

洗涤剂组合物包括但不限于：手工或机器洗衣洗涤剂组合物，例如适用于染色织物预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物，用于一般家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，用于手工或机器洗碗操作的洗涤剂组合物。

在一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶可用作洗涤剂添加剂。因此，本发明提供洗涤剂组合物，其包含本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶。

本发明还涉及在动物饲料中使用本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶的方法，以及涉及饲料组合物和饲料添加剂，其包含本发明的蛋白酶或包含与SEQID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶。术语“饲料”和“饲料组合物”是指适于或意欲用于动物摄取的任何化合物、制剂、混合物或组合物。

在另一个具体实施方案中，本发明的蛋白酶或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶用于水解蛋白质，和用于生产包含肽的水解物。这种水解物可用作饲料组合物或饲料添加剂。

本发明还涉及将含聚酯材料表面水解或表面功能化的方法，包括将含聚酯材料暴露于本发明的蛋白酶，或包含与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列的蛋白酶，或相应的重组细胞或其提取物，或组合物。本发明的方法尤其可用于增加聚酯材料的亲水性或吸水性。这种增加的亲水性可能对纺织品生产、电子和生物医学应用特别有用。

具体实施方案

实施例1-构建、蛋白酶的表达和纯化

构建

将编码来自栖热菌属(菌株Rt41A)的亲本蛋白酶的基因克隆至质粒pET26b⁺(EMDMillipore,Billerica,Massachusetts,USA)。将编码亲本蛋白酶SEQ ID NO：1及其天然前肽(SEQ ID NO：42)的基因(SEQ ID NO：1)与在基因上游的编码PelB信号肽(SEQ ID NO:43:MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA)和在基因下游的编码6x组氨酸标签(SEQ ID NO:44:LEHHHHHH)的序列整码插入质粒pET26b⁺。用构建的质粒转化大肠杆菌One

BL21DE3(Lifetechnologies,Carlsbad,California,USA)。所得菌株表达野生型蛋白酶，其在蛋白质的N末端具有PelB信号序列，在C末端具有6x组氨酸标签。根据供应商的建议，使用QuikChangeII定点诱变试剂盒来构建变体(Santa Clara,California,USA)。表1给出了定点诱变所用的正向和反向引物。

表1.用于产生本发明的蛋白酶变体的用于对编码亲本蛋白酶的基因进行定点诱变的正向和反向引物

突变的密码子用下划线示出。

蛋白酶的表达和纯化

在23℃下，在50mL ZYM5052自诱导培养基中进行表达野生型蛋白酶及其变体的菌株的重组表达24小时(Studier等,2005-Prot.Exp.Pur.41,207-234)。在Avanti J-26XP离心机(Beckman Coulter,Brea,USA)中通过离心(8000rpm，10℃20分钟)停止培养。将细胞在-80℃下冷冻至少2.5小时，然后悬浮于10mL Tris HCl缓冲液(Tris 0.1M，pH 7.5)。根据供应商的建议，使用Lysonase^TM Bioprocessing Reagent(EMD Millipore)来裂解细胞。然后，在10℃下，将细胞悬液以11000rpm离心30分钟。收集可溶部分，并使用

MetalAffinity树脂(Clontech,CA,USA)进行钴亲和层析。用20mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH 8.0中的100mM咪唑洗脱蛋白。在45℃用pH调节的Tris HCl缓冲液(Tris 0.1M，5mM CaCl₂，pH7.5)透析的步骤后，从纯化的提取物中除去咪唑。根据制造商(Lifescience Bio-Rad,France)的说明，用Bio-Rad Bradford蛋白测定定量纯化的蛋白，并将其储存在+4℃。在TCA沉淀后，在SDS-PAGE上评估纯化的质量，预期的蛋白大小为约29kDa。

实施例2-评估蛋白酶的比降解活性

测定PLA水解期间野生型蛋白酶和变体的比降解活性。称重50mg的500μm PLA粉末(PLLA 001-Natureplast)，并将其引入透析管。然后在透析管中加入酶样品：1.5mL含有固定浓度的酶的蛋白酶制剂(66.7mg/L、30mg/L、10mg/L或5mg/L以测量准确的比活性)，然后关上并将其引入含有25mL 0.1M Tris-HCl缓冲液pH 7.5(在45℃调节)和5mM CaCl₂的玻璃瓶。野生型蛋白酶(SEQ ID NO:1)用作对照。

在Max Q 4450孵育器(Thermo Fisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)中，将各样品在45℃下以150rpm孵育，从而开始解聚。

通过以下测定解聚反应的初始速率，以产生的g乳酸和乳酸二聚体/g酶/小时表示：在开始的24小时内的不同时间进行取样，并通过超高效液相色谱(UHPLC)分析。如果需要，将样品稀释于0.1MTris-HCl缓冲液pH 7.5。在0.45μm针筒式过滤器上过滤后，将样品加载到UHPLC上，以监测乳酸和乳酸二聚体的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)，其包含泵模块、自动取样器、恒温在50℃的柱温箱和210nm的UV检测器。使用的柱是Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)，其配备有前置柱(Supelco,Bellefonte,USA)。用流动相H₂SO₄ 5mM以0.5mL.min^-1的流速分离乳酸和乳酸二聚体。注射20μL样品。根据标准曲线测量乳酸和乳酸二聚体，所述标准曲线用商购乳酸(Sigma-Aldrich L1750-10G)和与样品在相同条件下自己合成的乳酸二聚体制备。在水解曲线的线性部分测定PLA水解的比降解活性(g当量乳酸(即，g乳酸和乳酸二聚体)/小时/g酶)。

不同实验的结果如表2所示。

表2.野生型蛋白酶(SEQ ID NO：1)和变体的比降解活性

实施例3-评估本发明蛋白酶的比降解活性

测定本发明蛋白酶的比降解活性，并与野生型蛋白酶SEQ ID NO：1的比降解活性比较。

使用多种方法来评估比活性：

(1)基于pNA水解的比降解活性；

(2)基于固体形式的聚酯(PLA)降解的比降解活性；

(3)基于含有PLA的乳液的浊度降低的比降解活性；

(4)基于反应器中的PLA水解的比降解活性。

3.1pNA水解

将20μL蛋白溶液加入180μL在Tris HCl缓冲液,0.1M pH7.5(在30℃调节)中的5mMN-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺(pNA)。在30℃下搅拌进行酶促反应至少15分钟，并通过微板分光光度计(Versamax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)获得405nm处的吸光度，以定量反应中的pNA释放。在水解曲线的线性部分测定比活性(以405nm处的吸光度(A405nm)/分钟/mg酶表示初始速度)，并将其用于测定野生型蛋白酶或变体的蛋白酶活性。不含酶的20μL 0.1M Tris HCl缓冲液溶液pH7.5用作阴性对照。

评估变体V18的比活性为21.5A405nm.min^-1.mg^-1。这表明，蛋白酶变体V18能够降解pNA，因此保留了其蛋白酶活性。

3.2降解固体形式的聚酯

将20μL酶制剂置于在含有PLA的琼脂板上产生的孔中。通过以下制备琼脂板：将450mg PLA溶于10mL二氯甲烷(DCM)，并用涡流均质化。加入90mL Tris HCl缓冲液0.1MpH7-9后进行超声步骤(Fisher Scientific^TM Model 705Sonic Dismembrator，以最大功率的30％)，然后在50℃蒸发DCM。过滤所得溶液，以除去未溶解的残渣。最后，将12mL 0.5％PLA乳液与3mL 1M Tris HCl缓冲液pH7.5(在45℃调节)和15mL 2％琼脂混合以制备omnitray(储存于4℃)。

在45℃下4-24小时后，测量并比较由于野生型蛋白酶和变体降解聚酯形成的晕圈的直径。

3.3基于含有PLA的乳液的浊度降低的比降解活性

在45℃、pH 7.5(在45℃调节)、在100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中最终浓度为0.1％(w/v)的乳化PLA的条件下，基于在630nm波长的浊度降低测定PLA降解酶活性(使用Sonic Dismembrator，以最大功率的30％)。一个单位的PLA降解活性定义为在所述测定条件下每分钟光密度降低1个单位。

反应器中的PLA水解

用5g PLA和100mL含有2.5-10mg蛋白酶的100mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5(在45℃调节)启动Minibio 500生物反应器(Applikon Biotechnology B.V.,Delft,TheNetherlands)。用海运叶轮将搅拌设置为250rpm。通过浸入外部水浴，将生物反应器恒温在45℃。加入3M KOH将pH调节为7.5。通过BioXpert软件V2.95监测不同参数(pH、温度、搅拌、碱的添加)。定期取样500μL反应介质。

如实施例2所述，通过HPLC测定LA和LA二聚体的量。

比活性对应于降解比速率，且计算为mg总释放的LA和LA二聚体/小时/mg酶。

实施例4-评估蛋白酶变体的热稳定性

使用不同方法来评估热稳定性：

(1)在给定的温度、时间和缓冲液条件下进行蛋白质孵育后的残留聚酯的解聚活性；

(2)溶液中蛋白质的圆二色性。

4.1残留聚酯的降解活性

通过测量热激后回收的残留比降解活性(如实施例2所述的PLA水解)来测定本发明的野生型蛋白酶和变体的热稳定性。如下进行热激：将0.1M Tris-HCl缓冲液pH 7.5(在45℃调节)和20mM CaCl₂中含有固定酶浓度(0.2或0.1g/L)的酶样品浸入调节至固定温度(70℃、75℃、85℃或98℃)的水浴中持续给定时间(5、30、45、60或240分钟)。热激后立即将样品置于冰上。将酶稀释步骤后(直至0.03g/L或0.01g/L)，如实施例2所述(缓冲液:Tris-HCl 0.1M pH7.5；CaCl₂浓度:5mM)测量热激和未热激样品回收后的比降解活性(PLA水解)。残留降解活性结果表示为参考条件(对应于未热激样品)的比活性的百分比。

a.野生型蛋白酶(SEQ ID NO：1)和变体V14(N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R)的热稳定性

热激条件和热激后的残留降解活性结果如表3所示。对于这些实验，用0.03g/L的酶浓度评估比降解活性。

表3.热激后野生型蛋白酶和本发明的变体V14的残留降解活性

表3表明，高温处理后，蛋白酶变体V14保留降解活性。特别地，本发明的蛋白酶变体在高于70℃的温度热激后保留聚酯降解活性。

b.蛋白酶变体V14(N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R)、V16(N102F+S104L+S106T+N107I)和V15(N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R)的热稳定性

热激条件和热激后的残留活性结果如表4所示。对于这些实验，用0.01g/L的酶浓度评估比降解活性。

表4.热激后本发明的蛋白酶变体的残留降解活性

表4表明，高温处理后，本发明的蛋白酶变体保留聚酯降解活性。特别地，本发明的蛋白酶变体在70℃下60分钟后保持约100％的残留活性。

4.2圆二色性

在J-815CD分光仪(JASCO)上进行圆二色性(CD)以测定并比较SEQ ID NO：1的蛋白酶和本发明的蛋白酶变体的熔融温度(Tm)。Tm对应于50％的蛋白质变性的温度。

在含有100mM Tris-HCl pH7.5(在45℃调节)的缓冲液中制备0.2mg/mL的蛋白质样品。在1mm光路石英杯(Starna Scientific Ltd,UK)中进行实验，并首先测量远-UV(195-206)谱来测定对应于蛋白质正确折叠的CD的两个最大强度。

通过监测220nm处的CD值随温度升高的变化获得蛋白质的热变性曲线。温度升高的速度为1.5℃.min^-1。使用11.0版本的Sigmaplot软件在最小二乘分析的基础上，对所得CD值和温度数据进行曲线拟合来计算转变的中点温度Tm。

所得Tm反应了给定蛋白质的热稳定性。Tm越高，变体在高温下越稳定。在82.4℃±2℃评估野生型蛋白酶SEQ ID NO：1的Tm。

本发明蛋白酶变体的热稳定性(以Tm值表示)比较如下表5所示。括号中示出了与野生型蛋白酶的Tm(设定为100％)相比，Tm的损失或增加。

表5.本发明蛋白酶变体的Tm

结果表明，蛋白酶变体V15(N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R)、V17(N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167R)和V18(N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R)的Tm略微受损，因为这些变体的Tm对应于大于野生型蛋白酶Tm的95％。本发明变体V26(N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+Y167R)的Tm与野生型蛋白酶相比增加，是野生型蛋白酶Tm的104％。

实施例5-含有本发明蛋白酶的可生物降解的聚酯材料

-通过挤出方法制备塑料复合物

制备包括本发明的蛋白酶变体的塑料复合物制剂，并将其与包括商购酶

的塑料复合物制剂比较。两种制剂如表6所示。百分比表示基于制剂总重量的重量。

表6.塑料复合物制剂

制剂B对应于包含本发明变体V16(N102F+S104L+S106T+N107I)的塑料复合物。

制剂A对应于包含商购酶的对照。在本实验中，商购酶是来自Novozyne的固体形式的

16L，已知其降解PLA(Degradation of Polylactide by commercialproteases；Y.Oda等2000)。

为比较结果，每种酶制剂包含相同量的纯酶(按重量计2.1％，基于酶制剂的总重量)。

使用以下制备制剂：

-粉末形式的PLA(聚乳酸聚合物，来自NatureWorks的PLA 4043D)，其从浸在液氮中并且用Ultra Centrifugal Mill ZM 200系统微粉化的PLA颗粒获得(<1mm)。

-固体形式的

16L，其通过以下从商购液体形式获得：在3.5kDa膜上超滤、透滤、加入阿拉伯树胶(来自Nexira)并通过冷冻干燥进行干燥。

-固体形式的变体V16，其通过以下获得：发酵过程，然后在钴柱上纯化、透滤、加入阿拉伯树胶并通过冷冻干燥进行干燥。

基于这些制剂，通过挤出方法制备可生物降解的基于聚乳酸的塑料组合物。使用复合压片机或共转双螺杆挤压机(“Haake MiniLab II ThermoFisher”)。该复合压片机依次包含手动进料元件、两个共转螺杆和双螺杆头。

通过手摇将所有粉末混合在一起，然后引入复合压片机。然后将混合物引入进料区，并人工施加压力推到螺杆挤压机中。使用转速为80RPM的双螺杆，混合物通过共转螺杆。挤出温度固定为165℃。然后PLA和蛋白酶的混合物到达螺杆头(其包含直径为0.4mm的一个孔)，其中推进混合物以形成条状。然后用剪线钳切割该挤出物以获得颗粒形式的塑料组合物，即塑料复合物。

-测试塑料组合物的可生物降解性

评估了以上获得的塑料复合物的可生物降解性。

称重100mg各颗粒样品A和B，并引入透析管。在透析管中加入3mL 0.1M Tris-HCl缓冲液pH 8，然后关上。然后将透析管引入含有50mL 0.1M Tris-HCl缓冲液pH 8的塑料瓶中。

在150rpm的Infors HT Multitron Pro孵育摇床中，在28℃或45℃下孵育各样品开始解聚。定期取样1mL缓冲液等分试样，在0.22μm的针筒式过滤器上过滤，并用具有Aminex HPX-87H的高压液相色谱(HPLC)分析，以监测乳酸(LA)和乳酸二聚体(DP2)的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)，其包含泵模块、自动取样器、恒温在50℃的柱温箱和220nm的UV检测器。洗脱液是5mM H₂SO₄。注射20μL样品。根据标准曲线测量乳酸和乳酸二聚体，所述标准曲线用商购乳酸(Sigma-Aldrich L1750-10G)和与样品在相同条件下自己合成的乳酸二聚体制备。

基于释放的LA和LA二聚体计算塑料制品的水解。通过以下计算降解百分比：在给定时间LA和LA二聚体中含有的LA的摩尔比vs塑料组合物中PLA初始含有的LA。在28℃反应10天或在45℃反应24小时后的解聚结果如表7所示。

表7.在28℃反应10天和在45℃反应24小时后，包含

16L或本发明的变体V16的塑料复合物的解聚

结果表明，与包含商购酶的塑料组合物相比，含有蛋白酶变体V16的塑料组合物的降解更高。这些结果表明本发明的变体具有更高的PLA降解活性和/或更高的热稳定性。

Claims

1.蛋白酶变体，其具有在Y167R位置的氨基酸取代，其中所述位置参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号，并且其与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，表现出聚酯降解活性增加。

2.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶包含至少一种选自以下的取代的组合：S104L+Y167R、D160E+Y167R、N102S+D160E+Y167R、S106T+D160E+Y167R、N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+D160E+Y167R、S106T+N107T+D160E+Y167R、N102S+N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+Y167R、N102F+S104L+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R、N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+Y167R和N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167R，其中所述位置参考SEQ ID NO:1的氨基酸序列编号。

3.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶包含单个氨基酸取代Y167R。

4.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶在N-末端包含其他序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：42所示的全长氨基酸序列具有100％的同一性。

5.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:1的蛋白酶相比，表现出PLA降解活性增加。

6.编码权利要求1-5任一项所定义的蛋白酶变体的核酸。

7.包含权利要求6所述的核酸的表达盒或载体。

8.包含权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的表达盒或载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞不是植物细胞。

9.包含权利要求1-5任一项所定义的蛋白酶变体，或根据权利要求8所述的宿主细胞，或其包含所述蛋白酶变体的提取物的组合物。

10.一种产生蛋白酶的方法，包括：

在适于表达编码所述蛋白酶的核酸的条件下培养根据权利要求8所述的宿主细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法进一步包括从细胞培养物回收所述蛋白酶。

12.一种降解包含至少一种聚酯的塑料产品的方法，包括：

将所述塑料产品与根据权利要求1-5任一项所述的蛋白酶或根据权利要求8所述的宿主细胞或根据权利要求9所述的组合物或具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白酶接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括回收单体和/或低聚物。

14.权利要求12或13所述的方法，其中所述塑料产品包含至少一种选自以下的聚酯：聚乳酸(PLA)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PEIT)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚丁二酸丁二酸己二酸酯(PBSA)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)和这些材料的共混物/混合物。

15.权利要求14所述的方法，其中所述塑料产品包含至少聚乳酸(PLA)。

16.一种塑料复合物，其包含根据权利要求1-5任一项所述的蛋白酶，或根据权利要求8所述的宿主细胞或其包含所述蛋白酶的提取物，或根据权利要求9所述的组合物，或具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白酶和至少一种聚酯。

17.权利要求16所述的塑料复合物，包含至少聚乳酸。

18.一种母料组合物，其包含根据权利要求1-5任一项所述的蛋白酶，或根据权利要求8所述的宿主细胞或其包含所述蛋白酶的提取物，或根据权利要求9所述的组合物，或具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白酶和至少一种聚酯。

19.用于生产权利要求16或17所述的塑料复合物，或权利要求18所述的母料组合物的方法，其中在所述聚酯是部分或完全熔融状态的温度下，将至少一种聚酯和权利要求1-5任一项所述的蛋白酶，或根据权利要求8所述的宿主细胞或其包含所述蛋白酶的提取物，或根据权利要求9所述的组合物，或具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白酶混合。

20.权利要求19所述的方法，其中所述至少一种聚酯和所述蛋白酶、宿主细胞或其包含所述蛋白酶的提取物或所述组合物或具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白酶通过挤出混合。

21.权利要求1-5任一项所述的蛋白酶，或根据权利要求8所述的宿主细胞，或根据权利要求9所述的组合物，或具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白酶用于降解含聚酯材料的用途。

22.权利要求20所述的用途，用于降解含聚乳酸材料。