CN116368225A - 新型酯酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新型酯酶，更具体地涉及与SEQ ID N°1的酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的酯酶变体及其用于降解含聚酯材料如塑料产品的用途。本发明的酯酶特别适合于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的材料。
Description
技术领域
本发明涉及新型酯酶，更具体地涉及与亲本酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的酯酶。本发明还涉及所述新型酯酶用于降解含聚酯材料如塑料制品的用途。本发明的酯酶特别适合于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和含聚对苯二甲酸乙二醇酯的材料。
背景技术
酯酶能够催化多种聚合物(包括聚酯)的水解。在此背景下，酯酶在许多工业应用中显示出有希望的效果，包括作为用于餐具洗涤和洗衣应用的洗涤剂、作为用于加工生物质和食品的降解酶、作为环境污染物解毒中的生物催化剂或用于纺织工业中聚酯织物的处理。酯酶作为用于水解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的降解酶的用途是特别引人关注的。实际上，PET用于许多技术领域，例如用于制造衣物、地毯，或以热固性树脂的形式用于制造包装或汽车塑料件等，使得填埋场中PET的累积成为日益严重的生态问题。
聚酯，特别是PET的酶降解被认为是减少塑料废物累积的引人关注的解决方案。实际上，酶可以加速含聚酯材料，更特别是塑料产品的水解，甚至达到单体水平。此外，水解产物(即，单体和低聚物)可以作为合成新聚合物的材料循环使用。
在此背景下，几种酯酶已经被鉴定为聚酯的候选降解酶，并且已经开发了这些酯酶的一些变体。在酯酶中，角质酶，也称为角质水解酶(EC 3.1.1.74)，是特别引人关注的。已从各种真菌(P.E.Kolattukudy,"Lipases",Ed.B.Borg-stróm和H.L.Brockman,Elsevier1984,471-504)、细菌和植物花粉中鉴定出角质酶。最近，宏基因组学方法已经使得鉴定出另外的酯酶。
然而，仍然需要与已知的酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的酯酶，以提供更有效的以及因此更有竞争力的聚酯降解过程。
发明内容
本发明提供与具有如SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列的亲本或野生型酯酶相比表现出增加的活性和/或增加的热稳定性的新型酯酶。该野生型酯酶对应于在Uniprot数据库(www.uniprot.org)中以登录号6WX58引用并描述为具有聚酯降解活性的酯酶的氨基酸序列的氨基酸2-262。本发明的酯酶在降解塑料产品、更特别是含有PET的塑料产品的方法中特别有用。
因此，本发明的目的是提供一种酯酶，其(i)与SEQ ID N°1中所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和(ii)在对应于选自T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、F209、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251、E253、S14、R73、D85、T86、T89、A179、A206、N215、T217、F239、S245、G249及V252的残基的位置处具有至少一个氨基酸取代，其中所述位置参考SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性及优选地(iv)与SEQID N°1的酯酶相比表现出增加的热稳定性和/或增加的降解活性。
在另一具体实施方案中，酯酶在选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253的位置处包含至少一个氨基酸取代，优选包含选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C的至少一个取代，更优选包含选自T61M、S65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N、S183E、D204C、F209I/W、N212D/M、S214P和E253C的至少一个取代，甚至更优选包含选自Q92G、S183E、D204C、F209I、S214P和E253C的至少一个取代。
本发明的另一个目的是提供编码本发明的酯酶的核酸。本发明还涉及包含所述核酸的表达盒或表达载体，以及包含所述核酸、表达盒或载体的宿主细胞。
本发明还提供了包含本发明的酯酶、本发明的宿主细胞或其提取物的组合物。
本发明的另一个目的是提供生产本发明的酯酶的方法，所述方法包括：
(a)在适于表达编码酯酶的核酸的条件下培养根据本发明的宿主细胞；以及任选地
(b)从细胞培养物回收所述酯酶。
本发明的另一个目的是提供一种降解聚酯的方法，所述方法包括：
(a)使所述聚酯与根据本发明的酯酶或根据本发明的宿主细胞或根据本发明的组合物接触；以及，任选地
(b)回收单体和/或低聚物。
特别地，本发明提供降解PET的方法，所述方法包括使PET与至少一种本发明的酯酶接触，和任选地回收PET的单体和/或低聚物。
本发明还涉及本发明的酯酶用于降解PET或含有PET的塑料产品的用途。
本发明还涉及包含酯酶或宿主细胞或本发明组合物的含聚酯材料。
本发明还涉及包含本发明的酯酶或宿主细胞的洗涤剂组合物或包含本发明酯酶的组合物。
具体实施方式
定义
参考以下定义，将更好地理解本公开。
本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“酶”是指通过肽键连接的氨基酸链，而与形成所述链的氨基酸数目无关。本文中氨基酸根据以下命名法用其单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸；n：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。
术语“酯酶”是指属于根据酶命名法分类为EC 3.1.1的水解酶类的酶，其催化酯水解成酸和醇。术语“角质酶”或“角质水解酶”是指根据酶命名法分类为EC 3.1.1.74的酯酶，其能够催化由角质和水产生角质单体的化学反应。
术语“野生型蛋白”或“亲本蛋白”是指天然出现的多肽的非突变形式。在本发明的情况下，亲本酯酶是指具有如SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列的酯酶。
术语“突变体”和“变体”是指源自SEQ ID N°1并且在一个或多个(例如，若干个)位置处包含至少一个修饰或改变(即，取代、插入和/或缺失)并且具有聚酯降解活性的多肽。变体可通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，改变编码野生型蛋白的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建。因此，本文所用的与特定位置相关的术语“修饰”和“改变”是指与野生型蛋白中该特定位置的氨基酸相比，该特定位置的氨基酸已被修饰。
“取代”是指一种氨基酸残基被另一种氨基酸残基代替。优选地，术语“取代”是指一种氨基酸残基被另一种氨基酸残基替换，所述另一种氨基酸残基选自天然存在的20种标准氨基酸残基，稀有的天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和通常合成制备的非天然存在的氨基酸残基(例如环己基丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指一种氨基酸残基被选自天然存在的20种标准氨基酸残基(G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S和T)的另一种氨基酸残基替换。符号“+”表示取代的组合。在本文中，以下术语用于表示取代：L82A表示亲本序列82位的氨基酸残基(亮氨酸，L)被丙氨酸(A)取代。A121V/I/M表示亲本序列第121位的氨基酸残基(丙氨酸，A)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守取代或非保守取代。保守取代的实例包括碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
除非另有说明，本申请公开的位置参考SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号。
如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指两个多肽序列之间匹配(相同氨基酸残基)的数目(或以百分比％表示的部分)。通过比对(以使重叠和同一性最大化，同时使序列空位最小化)时比较序列来确定序列同一性。特别地，根据两个序列的长度，可以使用多种数学全局或局部比对算法中的任一种来确定序列同一性。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970)进行比对，该算法在整个长度上对序列进行最佳比对，而长度明显不同的序列优选使用局部比对算法进行比对(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等人，1997；Altschul等人，2005))。可以以本领域技术范围内的各种方式实现用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，使用可在因特网网站例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上获得的公众可获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法创建两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数都设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝11，空位延伸＝1。
“聚合物”是指其结构由通过共价化学键连接的多个单体(重复单元)构成的化合物或化合物的混合物。在本发明的上下文中，术语聚合物包括由单一类型的重复单元(即均聚物)或不同重复单元的混合物(即共聚物或杂聚物)构成的天然或合成聚合物。根据本发明，“低聚物”是指含有2至约20个单体的分子。
在本发明的上下文中，“含聚酯材料”或“含聚酯产品”是指包含结晶、半结晶或完全无定形形式的至少一种聚酯的产品，例如塑料产品。在具体实施方案中，含聚酯材料是指由至少一种塑料材料(例如塑料片、管、棒、型材、形状、膜、大块等)制成的任何物品，其含有至少一种聚酯和可能的其他物质或添加剂，例如增塑剂、矿物或有机填料。在另一个具体实施方案中，含聚酯材料是指熔融或固态的塑料化合物或塑料制剂，其适合于制备塑料产品。在另一个具体实施方案中，含聚酯材料是指包含至少一种聚酯的纺织品、织物或纤维。在另一个具体实施方案中，含聚酯材料是指包含至少一种聚酯的塑料废物或纤维废物。
在本说明书中，术语“聚酯”包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些聚合物的共混物/混合物。
新型酯酶
本发明提供与亲本酯酶相比具有改善的活性和/或改善的热稳定性的新型酯酶。更具体地，本发明人设计了特别适合用于工业过程的新型酶。本发明的酯酶特别适合于降解聚酯，更特别是PET，包括含PET的材料，特别是含PET的塑料产品。在具体的实施方案中，酯酶表现出增加的活性和增加的热稳定性。
因此，本发明的一个目的是提供与具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列的酯酶(也称为亲本酯酶)相比表现出增加的活性的酯酶。
特别地，本发明人已经鉴定了SEQ ID N°1中所示的具体氨基酸残基，其旨在与酯酶的X射线晶体结构(即，折叠3D结构)中的聚合物底物接触，所述聚合物底物可以被有利地修饰以促进底物与酯酶的接触，并且有利地导致聚合物的吸附增加和/或由此导致酯酶对该聚合物的活性增加。
在本发明的上下文中，术语“增加的活性”或“增加的降解活性”表示与SEQ ID N°1的酯酶在相同条件下降解和/或吸附在相同聚酯上的能力相比，酯酶在给定条件(例如温度、pH、浓度)下降解聚酯的能力增加和/或吸附在聚酯上的能力增加。特别地，本发明的酯酶具有增加的PET降解活性。这样的增加可以是比SEQ ID N°1的酯酶的PET降解活性高至少5％，优选高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％或更多。特别地，降解活性是导致聚酯的单体和/或低聚物的解聚活性，所述单体和/或低聚物可被进一步回收和任选地再利用。
酯酶的“降解活性”可以由本领域技术人员根据本领域本身已知的方法来评价。例如，降解活性可以通过测量特定聚合物的解聚活性速率、测量分散在琼脂平板中的固体聚合物化合物的降解速率或测量反应器中聚合物的解聚活性速率来评估。特别地，降解活性可以通过测量酯酶的“特异性降解活性”来评价。酯酶对PET的“比降解活性”对应于在反应的初始时期(即，前24小时)期间每毫克酯酶每分钟水解的PET(μmol)或每小时产生的当量TA(mg)，并且由反应的水解曲线的线性部分确定，这样的曲线通过在前24小时期间在不同时间进行的若干次取样来建立。作为另一个实例，“降解活性”可以通过以下方式评估：在聚合物或含聚合物的塑料产品与降解酶接触时，在确定的一段时间后，在适当的温度、pH和缓冲液条件下，测量低聚物和/或单体的释放速率和/或收率。
酶吸附在底物上的能力可由本领域技术人员根据本领域本身已知的方法来评价。例如，酶吸附在底物上的能力可以从含有酶的溶液中测定，其中酶已经预先与底物在合适的条件下孵育。
本发明人还发现了SEQ ID N°1中的靶氨基酸残基，其可以被有利地修饰以改善相应酯酶在高温下(有利地在高于50℃，优选高于60℃，更优选高于65℃的温度下)的稳定性(即改善的热稳定性)。
因此，本发明的一个目的是提供与具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列的酯酶(即亲本酯酶)的热稳定性相比表现出增加的热稳定性的新型酯酶。
在本发明的上下文中，除非另外指明，否则给定温度对应于所述温度+/-1℃。
在本发明的上下文中，术语“增加的热稳定性”表示酯酶在30℃至90℃之间、30℃至80℃之间、30℃至70℃之间、30℃至65℃之间、30℃至50℃之间的温度下抵抗其化学和/或物理结构变化的能力增加。优选地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，其指示酯酶在高温下，特别是在50℃和90℃之间的温度下抵抗其化学和/或物理结构变化的能力增加。在具体实施方案中，与亲本酯酶的热稳定性相比，在50℃和90℃之间、50℃和80℃之间、50℃和75℃之间、50℃和70℃之间、50℃和65℃之间、55℃和90℃之间、55℃和80℃之间、55℃和75℃之间、55℃和70℃之间、55℃和65℃之间、60℃和90℃之间、60℃和80℃之间、60℃和75℃之间、60℃和70℃之间、60℃和65℃之间、65℃和90℃之间、65℃和80℃之间、65℃和75℃之间、65℃和70℃之间的温度下，酯酶的热稳定性得到改善。在另一个具体实施方案中，与亲本酯酶的热稳定性相比，在30℃、50℃和/或65℃下，优选在50℃和/或65℃下，酯酶的热稳定性得到改善。
特别地，热稳定性可以通过评估酯酶的熔融温度(Tm)来评价。在本发明的上下文中，“熔融温度”是指所考虑的酶群体的一半展开或错误折叠时的温度。通常，与SEQ ID N°1的酯酶的Tm相比，本发明的酯酶显示约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃或更高的增加的Tm。特别地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在30℃和90℃之间的温度下可以具有增加的半衰期。特别地，本发明的酯酶在30℃至90℃、30℃至80℃、30℃至70℃、30℃至50℃之间的温度下可以具有增加的半衰期。在另一个具体实施方案中，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在50℃和90℃之间的温度下可以具有增加的半衰期。特别地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在50℃和90℃之间、50℃和80℃之间、50℃和75℃之间、50℃和70℃之间、50℃和65℃之间、55℃和90℃之间、55℃和80℃之间、55℃和75℃之间、55℃和70℃之间、55℃和65℃之间、60℃和90℃之间、60℃和80℃之间、60℃和75℃之间、60℃和70℃之间、60℃和65℃之间、65℃和90℃之间、65℃和80℃之间、65℃和75℃之间、65℃和70℃之间的温度下可以具有增加的半衰期。在另一个具体实施方案中，本发明的酯酶在30℃、50℃和/或65℃下，优选在50℃和/或65℃下可以具有增加的半衰期。酯酶的熔融温度(Tm)可以由本领域技术人员根据本领域本身已知的方法来测量。例如，可以使用DSF来定量酯酶的热变性温度的变化，从而确定其Tm。或者，可通过使用圆二色性分析蛋白质折叠来评估Tm。优选地，使用在实验部分中暴露的DSF或圆二色性测量Tm。在本发明的上下文中，将Tm与在相同条件(例如pH、聚酯的性质和量等)下测量的Tm进行比较。
或者，可通过测量在不同温度下孵育后酯酶的酯酶活性和/或聚酯解聚活性并与亲本酯酶的酯酶活性和/或聚酯解聚活性进行比较来评估热稳定性。还可以评价在不同温度下进行多轮聚酯解聚测定的能力。快速且有价值的测试可以包括通过晕圈直径测量(halo diameter measurement)来评价在不同温度下孵育后酯酶降解分散在琼脂平板中的固体聚酯化合物的能力。
因此，本发明的目的是提供酯酶，其(i)与SEQ ID N°1中所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和(ii)在对应于选自T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、F209、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251、E253、S14、R73、D85、T86、T89、A179、A206、N215、T217、F239、S245、G249及V252的残基的位置处具有至少一个氨基酸取代，其中所述位置参考SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性及优选地(iv)与SEQ IDN°1的酯酶相比表现出增加的热稳定性和/或增加的降解活性。
具体地，本发明的目的是提供酯酶，其(i)与SEQ ID N°1中所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和(ii)在对应于选自T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、F209、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251及E253的残基的位置处具有至少一个氨基酸取代，其中所述位置参考SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，(iii)具有聚酯降解活性及优选地(iv)与SEQ ID N°1的酯酶相比表现出增加的热稳定性和/或增加的降解活性。
优选地，酯酶包含在选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253的位置处的至少一个氨基酸取代，优选选自Q92、S183、D204、F209、N212、S214和E253，更优选选自Q92、S183、D204、F209、S214和E253，甚至更优选包含在选自D204、F209或E253的位置处的至少一个氨基酸取代。
在一个实施方案中，酯酶包含至少一个取代，所述取代选自T11N/D/E/I/M/Q/S、N12F/H/Y/R/D/E/G/L/N/P/Q/V、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M/V、G62A/D/S、T63N/Q、S65T/N/P/V、S66H、S68A、W69R/D/E/M、L90W/F、Q92G/N/P/Q/T/Y、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q/W、S158Q、K159T、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S180E/D、S183E/D、F188I/Y、D197P、E202M、D204C/K/R、G205K、S207D/L、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、A210T、P211A、N212D/M/Q/E/H/Y、L213F、S214D/P、T216N/P、A219S/E、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、G243Y/P、T246C/E/Y/D、G247Y/D/E/H/S、S250C、D251A/D/E/H/S、E253C、S14D/E、R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、N85A/E/F、T86E/S、T89F/H/Q、A179C、A206D、N215C/D/E、T217Q、F239E、S245C/E、G249T和V252T。
在一个实施方案中，酯酶包含至少一个取代，所述取代选自T11N/D/E/I/M/Q/S、N12F/H/Y/R/D/E/G/L/N/P/Q/V、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M/V、G62A/D/S、T63N/Q、S65T/N/P/V、S66H、S68A、W69R/D/E/M、L90W/F、Q92G/N/P/Q/T/Y、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q/W、S158Q、K159T、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S180E/D、S183E/D、F188I/Y、D197P、E202M、D204C/K/R、G205K、S207D/L、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、A210T、P211A、N212D/M/Q/E/H/Y、L213F、S214D/P、T216N/P、A219S/E、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、G243Y/P、T246C/E/Y/D、G247Y/D/E/H/S、S250C、D251A/D/E/H/S和E253C，优选选自T11N、N12F/H/Y/R、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M、G62A、T63N/Q、S65T、S66H、S68A、W69R、L90W、Q92G/P、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q、S158Q、K159T、T168Q、T177N、S180E/D、S183E、F188I、D197P、E202M、D204C、G205K、S207D/L、F209I/W、A210T、P211A、N212D/M、L213F、S214P、T216P、A219S、K220E、Q238D、L240A、P242K、G243Y、T246C/E/Y、G247Y、S250C、D251A和E253C。
在一个实施方案中，酯酶包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C，优选选自T61M、S65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N、S183E、D204C、F209I/W、N212D/M、S214P和E253C，更优选选自D204C、F209I/W和E253C。
在另一个实施方案中，酯酶包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C，优选选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、S214D/P和E253C，更优选选自Q92G/P、S183E、D204C、F209I/W、S214P和E253C，甚至更优选选自Q92G、S183E、D204C、F209I、S214P和E253C。
在一个实施方案中，酯酶包含在位置F209处的至少一个氨基酸取代。优选地，所述取代选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M，更优选选自F209I/W。
在一个实施方案中，酯酶包含至少一个选自D204K/R的氨基酸取代和至少亲本酯酶中的氨基酸残基E253。
在一个实施方案中，酯酶在位置D204+E253处具有至少一个取代组合。优选地，所述取代组合是D204C/K/R+E253C，更优选是D204C+E253C。在一个实施方案中，酯酶具有由SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列组成的氨基酸序列，其具有取代组合D204C/K/R+E253C，优选取代组合D204C+E253C。
在具体实施方案中，酯酶在位置D204+E253处具有取代组合及在选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、F209、N212和S214的位置，优选在选自Q92、S183、F209和S214的位置处具有至少一个取代，优选至少两个取代，更优选至少三个取代。优选地，酯酶包含取代组合D204C/K/R+E253C及选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y和S214D/P，优选选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M和S214D/P，更优选选自Q92G/P、S183E、F209I/W和S214P，甚至更优选选自Q92G、S183E、F209I和S214P的至少一个额外的取代，优选至少两个额外的取代，更优选至少三个额外的取代。更优选地，酯酶包含取代组合D204C+E253C和选自T61M、S65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N、S183E、F209I/W、N212D/M和S214P，更优选选自Q92G、S183E、F209I和S214P的至少一个额外的取代，优选至少两个额外的取代，更优选至少三个额外的取代。
在一个实施方案中，酯酶在以下位置包含至少两个、优选至少三个、更优选至少四个取代，所述位置选自：D204、F209、T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、G205、S207、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251、E253、S14、R73、D85、T86、T89、A179、A206、N215、T217、F239、S245、G249和V252，优选选自F209、T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251和E253，更优选选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253，甚至更优选选自Q92、S183、D204、F209、N212、S214和E253。在一个实施方案中，酯酶在位置F209+D204+E253处具有至少一个取代组合。优选地，取代组合选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C，更优选选自F209I/W+D204C/K/R+E253C，甚至更优选选自F209I/W+D204C+E253C。
在一个实施方案中，酯酶在位置F209+D204+E253处具有取代组合及在选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、N212和S214的位置，优选在选自Q92、S183和S214的位置处具有至少一个额外的取代，优选至少两个额外的取代。优选地，酯酶包含选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C的取代组合以及选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、N212D/M/Q/E/H/Y和S214D/P，更优选选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D和S214D/P的至少一个额外的取代，优选至少两个额外的取代。更优选地，酯酶包含取代组合F209I/W+D204C+E253C，优选F209I+D204C+E253C，以及选自T61M、S65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N、S183E、N212D/M和S214P，优选选自Q92G/P、S183E和S214P，更优选选自Q92G、S183E和S214P的至少一个或两个额外的取代。
在优选的实施方案中，酯酶包含选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C的取代组合以及选自Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、S183E/D、N212D/M/Q/E/H/Y和S214D/P的至少一个额外的取代，优选至少两个额外的取代。更优选地，酯酶包含取代组合F209I/W+D204C+E253C，优选F209I+D204C+E253C，以及选自Q92G/P、G135A、T168Q、S183E、N212D/M和S214P的至少一个或两个额外的取代。
在一个实施方案中，酯酶至少包含在选自F209+D204+E253+Q92的位置处的取代组合，优选选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y的取代组合，更优选选自F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P的取代组合，甚至更优选选自F209I+D204C+E253C+Q92G。
特别地，酯酶至少包含在选自D204+E253、F209+D204+E253、F209+D204+E253+Q92、F209+D204+E253+Q92+S214+S183、F209+D204+E253+Q92+S214+G135+T168、F209+D204+E253+Q92+S214+S183+T168、F209+D204+E253+Q92+S214+G135+T168+S183和F209+D204+E253+N212的位置处的取代组合，优选选自D204+E253、F209+D204+E253+Q92和F209+D204+E253+Q92+S214+S183。特别地，酯酶至少包含取代组合，所述取代组合选自D204C/K/R+E253C、D204C+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V+S183E/D和F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+N212D/M/Q，优选选自D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q+S183E和F209I/W+D204C+E253C+N212D/M，更优选选自D204C+E253C、F209I+D204C+E253C+Q92G和F209I+D204C+E253C+Q92G+S214P+S183E。有利地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，此酯酶表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。在特定实施方案中，与SEQ ID N°1的酯酶相比，此酯酶在30℃和65℃之间，优选在30℃、50℃和/或65℃，更优选在50℃和/或65℃的温度下表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。
在具体实施方案中，该酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比，在选自T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、F209、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251、E253、S14、R73、D85、T86、T89、A179、A206、N215、T217、F239、S245、G249和V252的位置处具有1至70个取代，优选在选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253的位置处具有1至12个取代，更优选在选自Q92、S183、D204、F209、N212、S214和E253的位置处具有1至7个取代，甚至更优选在选自Q92、S183、D204、F209、S214和E253的位置处具有1至6个取代。
优选地，酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比具有1至70个选自T11N/D/E/I/M/Q/S、N12F/H/Y/R/D/E/G/L/N/P/Q/V、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M/V、G62A/D/S、T63N/Q、S65T/N/P/V、S66H、S68A、W69R/D/E/M、L90W/F、Q92G/N/P/Q/T/Y、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q/W、S158Q、K159T、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S180E/D、S183E/D、F188I/Y、D197P、E202M、D204C/K/R、G205K、S207D/L、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、A210T、P211A、N212D/M/Q/E/H/Y、L213F、S214D/P、T216N/P、A219S/E、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、G243Y/P、T246C/E/Y/D、G247Y/D/E/H/S、S250C、D251A/D/E/H/S、E253C、S14D/E、R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、N85A/E/F、T86E/S、T89F/H/Q、A179C、A206D、N215C/D/E、T217Q、F239E、S245C/E、G249T和V252T的取代，优选具有1至12个选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C的取代，更优选具有1至7个选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C的取代，甚至更优选具有1至6个选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、S214D/P和E253C的取代。
在具体实施方案中，该酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比，在选自T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、F209、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251、E253、S14、R73、D85、T86、T89、A179、A206、N215、T217、F239、S245、G249和V252的位置处，优选在选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253的单个位置处，更优选在选自Q92、S183、D204、F209、N212、S214和E253的单个位置处，甚至更优选在选自Q92、S183、F209和S214的单个位置处具有单个氨基酸取代。
优选地，酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比具有单个氨基酸取代，所述取代选自T11N/D/E/I/M/Q/S、N12F/H/Y/R/D/E/G/L/N/P/Q/V、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M/V、G62A/D/S、T63N/Q、S65T/N/P/V、S66H、S68A、W69R/D/E/M、L90W/F、Q92G/N/P/Q/T/Y、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q/W、S158Q、K159T、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S180E/D、S183E/D、F188I/Y、D197P、E202M、D204C/K/R、G205K、S207D/L、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、A210T、P211A、N212D/M/Q/E/H/Y、L213F、S214D/P、T216N/P、A219S/E、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、G243Y/P、T246C/E/Y/D、G247Y/D/E/H/S、S250C、D251A/D/E/H/S、E253C、S14D/E、R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、N85A/E/F、T86E/S、T89F/H/Q、A179C、A206D、N215C/D/E、T217Q、F239E、S245C/E、G249T和V252T，优选选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C，更优选选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y和S214D/P，甚至更优选选自Q92G/P、S183E、F209I/W、N212D和S214P。
在一个实施方案中，酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比具有单个氨基酸取代，所述取代选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253，优选选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C，更优选选自T61M、S65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N、S183E、D204C、F209I/W、N212D/M、S214P和E253C，甚至更优选选自F209I/W。
在具体实施方案中，酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比具有单个氨基酸取代，所述取代选自N212D/M/Q/E/H/Y，优选N212D。有利地，与SEQ IDN°1的酯酶相比，所述酯酶表现出增加的热稳定性。
在另一个具体实施方案中，酯酶的氨基酸序列包含SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比在选自以下的位置处具有一个取代组合：D204+E253、F209+D204+E253、F209+D204+E253+Q92、F209+D204+E253+Q92+S214+S183、F209+D204+E253+Q92+S214+G135+T168、F209+D204+E253+Q92+S214+S183+T168、F209+D204+E253+Q92+S214+G135+T168+S183和F209+D204+E253+N212。优选地，酯酶包含SEQ ID N°1，其具有选自以下的取代组合：D204C+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V+S183E/D和F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+N212D/M/Q，优选选自D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q+S183E和F209I/W+D204C+E253C+N212D/M，更优选选自D204C+E253C、F209I+D204C+E253C+Q92G和F209I+D204C+E253C+Q92G+S214P+S183E。有利地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，此酯酶表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。在具体实施方案中，与SEQID N°1的酯酶相比，此酯酶在30℃至65℃，优选50℃至65℃，更优选30℃、50℃和/或65℃，甚至更优选50℃和/或65℃的温度下表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。
在一个实施方案中，酯酶包含选自亲本酯酶中的C241、C259、E174、S130、D176、H208、M131、G59、H129、G132、I171和I178的至少一个氨基酸残基，即本发明的酯酶在一个、两个、三个等或所有这些位置未经修饰。
在一个实施方案中，酯酶至少包含形成酯酶的催化位点的氨基酸S130、D176和H208和/或如在亲本酯酶中那样形成二硫键的氨基酸C241和C259。优选地，酯酶包含选自亲本酯酶中的C241+C259、S130+D176+H208和C241+C259+S130+D176+H208的至少一个组合。在一个实施方案中，酯酶包含亲本酯酶中的组合C241+C259+E174+S130+D176+H208+M131。
可替代地或另外地，酯酶包含选自亲本酯酶中的G59、H129、G132、I171和I178的至少一个氨基酸。优选地，酯酶包含选自亲本酯酶中的I171和I178的至少一个氨基酸，更优选地至少包含亲本酯酶中的I171+I178的组合。在一个实施方案中，酯酶包含亲本酯酶中的组合I171+I178+G59+H219+G132。
在一个实施方案中，酯酶包含亲本酯酶中的组合C241+C259+S130+D176+H208+I171+I178。
变体的聚酯降解活性
本发明的一个目的是提供具有酯酶活性的新型酶。在具体实施方案中，本发明的酶表现出角质酶活性。
在具体实施方案中，本发明的酯酶具有聚酯降解活性，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解活性、和/或聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)降解活性、和/或聚己内酯(PCL)降解活性、和/或聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)活性，更优选聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解活性、和/或聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)降解活性。甚至更优选地，本发明的酯酶具有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解活性。
有利地，本发明的酯酶至少在20℃至90℃、优选30℃至90℃、更优选40℃至90℃、更优选50℃至90℃、甚至更优选60℃和90℃的温度范围内表现出聚酯降解活性。特别地，本发明的酯酶在以下温度范围内表现出聚酯降解活性：30℃至90℃之间、30℃至80℃之间、30℃至70℃之间、30℃至65℃之间、35℃至90℃之间、35℃至85℃之间、35℃至80℃之间、35℃至75℃之间、35℃至70℃之间、35℃至65℃之间、35℃至60℃之间、35℃至55℃之间、35℃至50℃，优选30℃至65℃之间。在具体实施方案中，酯酶至少在50℃表现出聚酯降解活性。在具体实施方案中，酯酶至少在60℃表现出聚酯降解活性。在具体实施方案中，酯酶至少在70℃表现出聚酯降解活性。在具体实施方案中，聚酯降解活性在50℃至70℃、50℃至65℃、55℃至70℃之间的温度下仍然是可测量的。如上文所述，温度应视为+/-1℃。
在具体实施方案中，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在给定温度下具有提高的聚酯降解活性，更特别地所述给定温度是在30℃至90℃之间的温度，优选在40℃和90℃，更优选在50℃至90℃之间的温度。特别地，与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在50℃和65℃之间，优选在50℃和/或65℃的温度下具有增加的聚酯降解活性。
在具体实施方案中，酯酶在50℃下的聚酯降解活性比SEQ ID N°1的酯酶的聚酯降解活性高至少5％，优选高至少10％、20％、50％、100％或更高。
在具体实施方案中，酯酶在65℃下的聚酯降解活性比SEQ ID N°1的酯酶的聚酯降解活性高至少5％，优选高至少10％、20％、50％、100％或更高。
在具体实施方案中，本发明的酯酶至少在pH 5至9的范围内，优选在pH 6至9的范围内，更优选在pH 6.5至9的范围内，甚至更优选在pH 6.5至8的范围内表现出可测量的酯酶活性。
核酸、表达盒、载体、宿主细胞
本发明的另一个目的是提供编码上文定义的酯酶的核酸。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。核酸可以是DNA(cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。它可以是单链形式或双链形式或其混合物。它可以是重组、人工和/或合成来源的，并且它可以包含修饰的核苷酸，例如包含修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的糖。本发明的核酸可以是分离或纯化的形式，并通过本领域本身已知的技术制备、分离和/或操作，例如cDNA文库的克隆和表达、扩增、酶促合成或重组技术。核酸也可以通过熟知的化学合成技术在体外合成，如Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440-3444中描述的。
本发明还包括在严格条件下与编码如上文定义的酯酶的核酸杂交的核酸。优选地，此类严格条件包括在约42℃下在2XSSC/0.1％SDS中孵育杂交滤膜约2.5小时，随后在1XSSC/0.1％ SDS中在65℃下洗涤滤膜四次，每次15分钟。所用的方案描述于参考文献例如Sambrook等人(Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in MolecularBiology(1989))中。
本发明还涵盖编码本发明酯酶的核酸，其中所述核酸的序列或至少所述序列的一部分已经采用优化的密码子使用进行了工程化。
或者，根据本发明的核酸可以从根据本发明的酯酶的序列推导出，并且密码子使用可以根据核酸在其中转录的宿主细胞进行调整。这些步骤可以根据本领域技术人员熟知的方法进行，其中一些描述于Sambrook等人的参考手册(Sambrook等人,2001)中。
本发明的核酸还可以包含额外的核苷酸序列，例如调节区，即启动子、增强子、沉默子、终止子、信号肽等，其可以用于引起或调节多肽在所选宿主细胞或系统中的表达。
本发明还涉及表达盒，其包含与指导所述核酸在合适的宿主细胞中表达的一个或多个控制序列可操作地连接的根据本发明的核酸。
本文所用的术语“表达”是指涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达盒”表示包含可操作地连接的编码区(即本发明的核酸)和调节区(即包含一个或多个控制序列)的核酸构建体。
通常，表达盒包含与控制序列如转录启动子和/或转录终止子可操作地连接的本发明核酸或由其组成。控制序列可以包括被宿主细胞或用于表达编码本发明酯酶的核酸的体外表达系统识别的启动子。启动子含有介导酶表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子与编码酯酶的核酸的3'-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。通常，表达盒包含与转录启动子和转录终止子可操作地连接的根据本发明的核酸或由其组成。
本发明还涉及包含如上文定义的核酸或表达盒的载体。
本文所用的术语“载体”或“表达载体”是指包含本发明表达盒的DNA或RNA分子，其用作将重组遗传物质转移到宿主细胞中的载体。载体的主要类型是质粒、噬菌体、病毒、粘粒和人工染色体。载体本身通常是由插入物(异源核酸序列、转基因)和用作载体“骨架”的较大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移到宿主的载体的目的通常是在靶细胞中分离、增殖或表达插入物。称为表达载体(表达构建体)的载体特别适于在靶细胞中表达异源序列，并且通常具有驱动编码多肽的异源序列表达的启动子序列。通常，存在于表达载体中的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选存在的操纵子。优选地，表达载体还包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、可选择的标记、有限数量的有用的限制性酶位点和高拷贝数的可能性。表达载体的实例是克隆载体、修饰的克隆载体、特别设计的质粒和病毒。在不同宿主中提供合适水平的多肽表达的表达载体是本领域熟知的。载体的选择通常取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。优选地，表达载体是线性或环状双链DNA分子。
本发明的另一个目的是提供包含上文描述的核酸、表达盒或载体的宿主细胞。因此，本发明涉及根据本发明的核酸、表达盒或载体用于转化、转染或转导宿主细胞的用途。载体的选择通常取决于载体与将引入载体的宿主细胞的相容性。
根据本发明，宿主细胞可以以瞬时或稳定的方式转化、转染或转导。将本发明的表达盒或载体引入宿主细胞中，使得该表达盒或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”还涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本宿主细胞不同的任何亲本宿主细胞后代。宿主细胞可以是可用于产生本发明变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞。宿主细胞也可以是真核细胞，如酵母、真菌、哺乳动物、昆虫或植物细胞。在具体实施方案中，宿主细胞选自大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌属、木霉属、曲霉属、酵母属、毕赤酵母属、弧菌属或耶氏酵母属。
根据本发明的核酸、表达盒或表达载体可以通过本领域技术人员已知的任何方法引入宿主细胞，例如电穿孔、接合、转导、感受态细胞转化、原生质体转化、原生质体融合、生物射弹“基因枪”转化、PEG介导的转化、脂质辅助的转化或转染、化学介导的转染、乙酸锂介导的转化、脂质体介导的转化。
任选地，可以将多于一个拷贝的本发明的核酸、表达盒或载体插入宿主细胞中以增加变体的产生。
在具体实施方案中，宿主细胞是重组微生物。本发明确实允许对具有改进的降解含聚酯材料能力的微生物进行工程化。例如，本发明的序列可用于补充已知能够降解聚酯的真菌或细菌的野生型菌株，以改善和/或增加菌株能力。
酯酶生产
本发明的另一个目的是提供生产本发明酯酶的方法，所述方法包括表达编码酯酶的核酸和任选地回收酯酶。
具体地，本发明涉及生产本发明酯酶的体外方法，所述方法包括(a)使本发明的核酸、表达盒或载体与体外表达系统接触；和(b)回收产生的酯酶。体外表达系统是本领域技术人员熟知的并且是可商购的。
优选地，生产方法包括：
(a)在适于表达所述核酸的条件下培养包含编码本发明酯酶的核酸的宿主细胞；以及任选地
(b)从细胞培养物回收所述酯酶。
有利地，宿主细胞是重组芽孢杆菌属、重组大肠杆菌、重组曲霉属、重组木霉属、重组链霉菌属、重组酵母属、重组毕赤酵母属、重组弧菌属或重组耶氏酵母属细胞。
使用本领域已知的方法，在适于生产多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基中和在允许酶表达和/或分离的条件下进行的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。培养在合适的营养培养基中进行，所述营养培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。
如果酯酶分泌到营养培养基中，则可以直接从培养上清液中回收酯酶。反之，酯酶可以从细胞裂解物中回收或在透化后回收。可以使用本领域已知的任何方法回收酯酶。例如，可通过常规程序，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收酯酶。任选地，可以通过本领域已知的多种方法部分或完全纯化酯酶，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳法(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取，以便获得基本上纯的多肽。
酯酶可以纯化形式单独或与另外的酶组合原样使用，以催化聚酯和/或含聚酯材料(如含聚酯的塑料产品)的降解和/或再循环中涉及的酶反应。酯酶可以是可溶形式、或是固相形式。特别地，它可以结合到细胞膜或脂质囊泡，或结合到合成支持物如玻璃、塑料、聚合物、过滤器、膜(例如以珠、柱、板等形式)。
组合物
本发明的另一个目的是提供包含酯酶、或本发明的宿主细胞、或其含有酯酶的提取物的组合物。在本发明的上下文中，术语“组合物”涵盖包含本发明的酯酶或宿主细胞、或其含有酯酶的提取物的任何种类的组合物。
基于组合物的总重量，本发明的组合物可包含按重量计0.1％至99.9％、优选0.1％至50％、更优选0.1％至30％、甚至更优选0.1％至5％的酯酶。或者，组合物可包含按重量计5％至10％的本发明酯酶。
组合物可以为液体或干燥形式，例如粉末形式。在一些实施方案中，组合物是冻干物。
组合物还可包含赋形剂和/或试剂等。合适的赋形剂涵盖生物化学中常用的缓冲剂，调节pH的试剂，防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钠或抗坏血酸钠，保守剂(conservative)，保护剂或稳定剂如淀粉，糊精，阿拉伯胶，盐，糖如山梨糖醇、海藻糖或乳糖，甘油，聚乙二醇，聚丙二醇，丙二醇，螯合剂如EDTA，还原剂，氨基酸，载体如溶剂或水溶液等。本发明的组合物可以通过将酯酶与一种或几种赋形剂混合来获得。
在具体实施方案中，基于组合物的总重量，组合物包含按重量计0.1％至99.9％、优选50％至99.9％、更优选70％至99.9％、甚至更优选95％至99.9％的赋形剂。或者，组合物可包含按重量计90％至95％的赋形剂。
在具体实施方案中，组合物可以进一步包含显示酶活性的其他多肽。本发明的酯酶的量将容易地由本领域技术人员根据例如待降解的聚酯的性质和/或组合物中包含的另外的酶/多肽来调整。
在具体实施方案中，本发明的酯酶与一种或几种赋形剂，特别是能够稳定或保护多肽免于降解的赋形剂一起溶解在水性介质中。例如，可以将本发明的酯酶溶解在水中，最后加入另外的组分，如甘油、山梨糖醇、糊精、淀粉、二醇如丙二醇、盐等。然后可以将得到的混合物干燥以获得粉末。干燥这种混合物的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于冻干、冷冻干燥、喷雾干燥、超临界干燥、下吸式蒸发、薄层蒸发、离心蒸发、传送带干燥、流化床干燥、转鼓式干燥或其任意组合。
在具体实施方案中，组合物为粉末形式，并且包含酯酶和稳定/增溶量的甘油、山梨糖醇或糊精如麦芽糖糊精和/或环糊精、淀粉、二醇如丙二醇和/或盐。
在具体实施方案中，本发明的组合物包含表达本发明酯酶或其提取物的至少一种重组细胞。“细胞提取物”是指从细胞获得的任何部分，例如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制剂或通过化学、物理和/或酶处理从细胞获得的任何制剂，其基本上不含活细胞。优选的提取物是酶活性提取物。本发明的组合物可以包含一种或几种本发明的重组细胞或其提取物，和任选的一种或几种另外的细胞。
在一个实施方案中，组合物由表达和分泌本发明酯酶的重组微生物的培养基组成或包含所述培养基。在具体实施方案中，组合物包含冻干的这种培养基。
酯酶的用途
本发明的另一个目的是提供使用本发明的酯酶在需氧或厌氧条件下降解和/或回收聚酯或含聚酯材料的方法。本发明的酯酶特别适用于降解PET和含PET的材料。
因此，本发明的目的是使用本发明的酯酶、或其相应的重组细胞或提取物、或组合物来酶促降解聚酯。
在具体实施方案中，酯酶靶向的聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些材料的共混物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。
在优选的实施方案中，聚酯是PET，并且至少回收单体(例如，单乙二醇或对苯二甲酸)和/或低聚物(例如，对苯二甲酸甲基-2-羟乙基酯(MHET)、对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)、对苯二甲酸1-(2-羟乙基)4-甲酯(HEMT)和对苯二甲酸二甲酯(DMT))。
本发明的另一个目的是使用本发明的酯酶、或其相应的重组细胞或提取物、或组合物来酶促降解含聚酯材料中的至少一种聚酯。
本发明的另一个目的是提供一种降解含聚酯材料中的至少一种聚酯的方法，其中使含聚酯材料与本发明的酯酶或宿主细胞或其提取物或组合物接触，从而降解含聚酯材料中的至少一种聚酯。
有利地，聚酯被解聚成单体和/或低聚物。
特别地，本发明提供了降解含PET材料中的PET的方法，其中使含PET材料与本发明的酯酶或宿主细胞或组合物接触，从而降解PET。
在一个实施方案中，至少一种聚酯降解成可再聚合的单体和/或低聚物，其可以有利地回收以便再利用。回收的单体/低聚物可用于再循环(例如，再聚合聚酯)或甲烷化。在具体实施方案中，至少一种聚酯是PET，并且回收单乙二醇、对苯二甲酸、对苯二甲酸甲基-2-羟乙基酯(MHET)、对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)、对苯二甲酸1-(2-羟乙基)4-甲酯(HEMT)和对苯二甲酸二甲酯(DMT)。
在一个实施方案中，含聚酯材料的聚酯被完全降解。
降解含聚酯材料所需的时间可根据含聚酯材料本身(即含聚酯材料的性质和来源、其组成、形状等)，所用酯酶的类型和量以及多种过程参数(即温度、pH、其他试剂等)而变化。本领域技术人员可以容易地使过程参数适应含聚酯材料和预想的降解时间。
有利地，降解过程在20℃至90℃、优选40℃至90℃、更优选50℃至70℃、甚至更优选50℃至65℃的温度下实施。在具体实施方案中，降解过程在60℃下实施。在另一具体实施方案中，降解过程在65℃下实施。在另一具体实施方案中，降解过程在70℃下实施。更通常地，将温度维持在低于失活温度，所述失活温度对应于酯酶失活的温度(即，与在其最佳温度下的活性相比，酯酶失去超过80％的活性的温度)和/或重组微生物不再合成酯酶。特别地，将温度保持在目标聚酯的玻璃化转变温度(Tg)以下。
有利地，该过程在连续流动过程中实施，在该温度下酯酶可使用数次和/或再循环。
有利地，降解过程在5至9的pH下实施，优选在6至9的pH范围内，更优选在6.5至9的pH范围内，甚至更优选在6.5至8的pH范围内实施。
在具体实施方案中，含聚酯材料可以在与酯酶接触之前进行预处理，以便物理改变其结构，从而增加聚酯和酯酶之间的接触表面。
本发明的另一个目的是提供从含聚酯材料生产单体和/或低聚物的方法，所述方法包括将含聚酯材料暴露于本发明的酯酶、或其相应的重组细胞或提取物、或组合物，和任选地回收单体和/或低聚物。
由解聚产生的单体和/或低聚物可以顺序地或连续地回收。取决于起始的含聚酯材料，可以回收单一类型的单体和/或低聚物或几种不同类型的单体和/或低聚物。
特别地，本发明的方法可用于由PET和/或包含PET的塑料产品生产选自单乙二醇和对苯二甲酸的单体、和/或选自对苯二甲酸甲基-2-羟乙基酯(MHET)、对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)、对苯二甲酸1-(2-羟乙基)4-甲酯(HEMT)和对苯二甲酸二甲酯(DMT)的低聚物。
回收的单体和/或低聚物可使用所有合适的纯化方法进一步纯化并以可再聚合形式调节。
回收的可再聚合单体和/或低聚物可以再用于例如合成聚酯。有利地，将相同性质的聚酯再聚合。然而，可以将回收的单体和/或低聚物与其他单体和/或低聚物混合，以便例如合成新的共聚物。或者，回收的单体可用作化学中间体以产生新的感兴趣的化合物。
本发明还涉及含聚酯材料的表面水解或表面官能化的方法，所述方法包括将含聚酯材料暴露于本发明的酯酶、或其相应的重组细胞或提取物、或组合物。本发明的方法特别适用于增加聚酯材料的亲水性或吸水性。这种增加的亲水性可在纺织品生产、电子和生物医学应用中具有特别的意义。
本发明的另一个目的是提供含聚酯的材料，其中包含本发明的酯酶和/或表达和分泌所述酯酶的重组微生物。例如，在专利申请WO2013/093355、WO2016/198650、WO2016/198652、WO2019/043145和WO2019/043134中公开了制备这种包含本发明酯酶的含聚酯材料的方法。
因此，本发明的目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或提取物和至少PET的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PET和具有PET降解活性的本发明酯酶的塑料产品。
因此，本发明的另一个目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或提取物和至少PBAT的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PBAT和具有PBAT降解活性的本发明酯酶的塑料产品。
因此，本发明的另一个目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或提取物和至少PBS的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PBS和具有PBS降解活性的本发明酯酶的塑料产品。
因此，本发明的另一个目的是提供含有本发明酯酶和/或重组细胞和/或其组合物或提取物和至少PCL的含聚酯材料。根据一个实施方案，本发明提供了包含PCL和具有PCL降解活性的本发明酯酶的塑料产品。
典型地，本发明的酯酶可用于洗涤剂、食物、动物饲料、造纸、织物和药物应用。更具体地，本发明的酯酶可用作洗涤剂组合物的组分。洗涤剂组合物包括但不限于手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，例如适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或用于手洗或机洗餐具洗涤操作的洗涤剂组合物。在具体实施方案中，本发明的酯酶可用作洗涤剂添加剂。因此，本发明提供了包含本发明酯酶的洗涤剂组合物。特别地，本发明的酯酶可用作洗涤剂添加剂以减少织物清洁过程中的起球和变灰效应。
本发明还涉及在动物饲料中使用本发明酯酶的方法、以及包含本发明酯酶的饲料组合物和饲料添加剂。术语“饲料”和“饲料组合物”是指适于或旨在由动物摄取的任何化合物、制剂、混合物或组合物。在另一个具体实施方案中，本发明的酯酶用于水解蛋白质，并产生包含肽的水解产物。这样的水解产物可以用作饲料组合物或饲料添加剂。
本发明的另一个目的是提供在造纸工业中使用本发明酯酶的方法。更具体地，本发明的酯酶可用于从纸浆和造纸机的水管线中除去粘性物。
实施例
实施例1：酯酶的构建、表达和纯化
构建
已经使用质粒构建产生了根据本发明的酯酶。该质粒包括克隆编码SEQ ID N°1的酯酶的基因，其针对pET-26b(+)表达载体(Merck Millipore,Molsheim,France)的NdeI和XhoI限制性位点之间的大肠杆菌表达进行优化。编码PelB前导序列的核苷酸序列已被添加在SEQ ID N°1和NdeI限制性位点之间。表达的融合蛋白被导向细菌周质，其中PelB前导序列被信号肽酶去除，产生与SEQ ID N°1相同但添加了C末端氨基酸延伸的功能蛋白。根据供应商的建议使用两个定点诱变试剂盒，以产生酯酶变体：来自安捷伦(Agilent，SantaClara,California,USA)的QuikChange II定点诱变试剂盒和QuikChange Lightning多位点诱变试剂盒。
酯酶的表达和纯化
StellarTM(Clontech,California,USA)和大肠杆菌BL21(DE3)(New EnglandBiolabs,Evry,France)菌株相继被用于在50mL LB-Miller培养基或ZYM自诱导培养基中进行克隆和重组表达(Studier等人,2005-Prot.Exp.Pur.41,207-234)。LB-Miller培养基中的诱导在16℃下进行，使用0.5mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,Euromedex,Souffelweyersheim,France)。在Avanti J-26XP离心机(Beckman Coulter,Brea,USA)中通过离心(8000rpm，10℃下20分钟)停止培养。细胞已悬浮在20mL的Talon缓冲液(Tris-HCl20mM，NaCl 300mM，pH 8)中。然后用FB 705超声仪(Fisherbrand,Illkirch,France)以30％的振幅超声处理细胞悬浮液2分钟(2秒开和1秒关循环)。然后，实现离心步骤：在Eppendorf离心机中以10000g、10℃离心30分钟。收集可溶性级分并进行亲和色谱。用
金属亲和性树脂(Clontech,CA,USA)完成该纯化步骤。用补充有咪唑的Talon缓冲液进行蛋白质洗脱。将纯化的蛋白质用Talon缓冲液进行透析，然后根据制造商说明(Lifescience Bio-Rad,France)使用Bio-Rad蛋白质测定法进行量化，并储存在+4℃。
实施例2：评估酯酶的降解活性
测定酯酶的降解活性并与SEQ ID N°1的酯酶的活性进行比较。
已使用多种方法评估比活性(specific activity)：
(1)基于PET水解的比活性
(2)基于固体形式的聚酯的降解的活性
(3)基于100mL以上的反应器中PET水解的活性
2.1.基于PET水解的比活性
称取100mg粉末形式的无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)，并将其放入100mL玻璃瓶中。将包含SEQ ID N°1的酯酶(作为参考对照)或本发明的酯酶的1mL酯酶制剂(在Talon缓冲液(Tris-HCl 20mM，NaCl 0.3M，pH 8)中以0.4μM至1.38μM制备)引入玻璃瓶中。最后，加入9mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8)。
在Max Q 4450培养箱(Thermo Fisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)中在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃和150rpm下孵育每个玻璃瓶，开始解聚。
解聚反应的初始速率(以每小时产生的当量TA的mg数计)通过在前24小时期间的不同时间进行取样来测定，并且通过超高效液相色谱(UHPLC)来分析。如果需要，将样品稀释在0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8)中。然后，将150μL甲醇和6.5μL HCl 6N加入到150μL样品或稀释液中。在混合和在0.45μm注射器过滤器上过滤之后，将样品加载到UHPLC上以监测对苯二甲酸(TA)、MHET和BHET的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(ThermoFisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)，包括泵模块、自动进样器、恒温在25℃的柱温箱和240nm的UV检测器。使用的柱是
HS C18HPLC柱(150x 4.6mm，5μm，配备有前置柱，Supelco，Bellefonte，USA)。TA、MHET和BHET使用1mM H2SO4中的MeOH(30％至90％)的1mL/min的梯度分离。注射20μL样品。根据标准曲线测量TA、MHET和BHET，所述标准曲线是在与样品相同的条件下由商业TA和BHET和内部合成的MHET制备的。在反应的水解曲线的线性部分中测定PET水解的比活性(mg当量TA/小时/mg酶)，该曲线通过在前24小时期间在不同时间进行取样来建立。当量TA对应于测量的TA与测量的MHET和BHET中所含的TA之和。所述当量TA的测量也可用于计算给定时间PET解聚测定的产率。
2.2.基于固体形式的聚酯的降解的活性
将20μL酶制剂沉积在含有PET的琼脂平板中产生的孔中。琼脂平板的制备通过将500mg PET溶解在六氟-2-丙醇(HFIP)中并将该培养基倒入250mL水溶液中来实现。在52℃和140毫巴下蒸发HFIP后，将溶液与含有3％琼脂的0.2M磷酸钾缓冲液(pH8)v/v混合。使用约30mL混合物制备各平板并在4℃下储存。
在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2至24小时后，测量并比较由于野生型酯酶和变体降解聚酯而形成的晕圈的直径或表面积。
2.3.基于反应器中PET水解的活性
在500mL Minibio生物反应器(Applikon Biotechnology,Delft,TheNetherlands)中，将在80mL的100mM磷酸钾缓冲液(pH 8)中制备的0.69μmol至2.07μmol纯化酯酶与20g无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)混合。通过水浴浸渍在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃进行温度调节，并且使用单个船用式叶轮(marine impeller)以250rpm维持恒定搅拌。PET解聚测定的pH由6N NaOH调节至pH8，并由my-Control生物控制器系统(Applikon Biotechnology,Delft,TheNetherlands)确认。在测定期间记录碱消耗并且可以用于表征PET解聚测定。
通过测定残留PET重量或通过测定产生的当量TA或通过碱消耗来测定PET解聚测定的最终产率。在反应结束时，通过12至15μm 11级无灰纸过滤器(Dutscher SAS,Brumath,France)过滤反应体积，并在称重前干燥该渗余物，来评估残留PET的重量。使用2.1中描述的UHPLC方法实现产生的当量TA的测定，并且基于给定时间下的摩尔浓度(TA+MHET+BHET)与初始样品中包含的TA的总量的比计算水解百分比。PET解聚产生的酸单体将被碱中和以能够维持反应器中的pH。使用相应的摩尔碱消耗来计算产生的当量TA的测定，并且基于在给定时间下当量TA的摩尔浓度与初始样品中包含的TA的总量的比来计算水解百分比。
本发明的酯酶(变体)在30℃下6天后的PET解聚产率示于下表1中。表1表明，与用作参照的SEQ ID N°1的酯酶的PET解聚产率(视其PET解聚产率等于1)相比，本发明的变体的PET解聚产率提高。
PET解聚产率如实施例2.1中披露的那样测量。
表1：与SEQ ID N°1的酯酶相比，本发明的酯酶在30℃下6天后的PET解聚产率提高。
变体V1-V3具有SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，在表1中分别列出的取代组合除外。
表1显示，所有变体在30℃下的PET解聚产率比SEQ ID N°1的酯酶的PET解聚产率高至少9.8倍。
本发明的酯酶在50℃下48小时后的PET解聚产率示于下表2中。
PET解聚产率如实施例2.1中披露的那样测量。
在50℃，SEQ ID N°1的酯酶的PET解聚产率检测不到，即其PET解聚产率因此低于0.01％。
表2：在50℃下48小时后本发明酯酶的PET解聚产率
变体V1-V3具有SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，在表2中分别列出的取代组合除外。
表2显示本发明的所有变体在50℃下的PET解聚产率为至少3.8％，而SEQ ID N°1的酯酶的PET解聚产率低于0.01％。
本发明的酯酶(变体)的比降解活性(specific degrading activity)示于下表3中。如实施例2.1中披露的在65℃下测量比降解活性。
在65℃，SEQ ID N°1的酯酶的比降解活性检测不到，即其比降解活性因此低于0.01mg TAeq/h/mg酶。
表3：本发明变体的比降解活性
变体V1-V3具有SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，在表3中分别列出的取代组合除外。
表3显示本发明的所有变体在65℃的比降解活性为至少0.4mg TAeq/h/mg酶，而SEQID N°1的酯酶的比降解活性低于0.01mg TAeq/h/mg酶。
实施例3：评估本发明的酯酶的热稳定性
已经测定了本发明的酯酶的热稳定性并与SEQ ID N°1的酯酶的热稳定性进行了比较。
使用不同的方法评价热稳定性：
(1)溶液中蛋白质的圆二色性；
(2)在给定的温度、时间和缓冲液条件下孵育蛋白质后的残余酯酶活性；
(3)在给定的温度、时间和缓冲液条件下蛋白质孵育后的残余聚酯解聚活性；
(4)在给定的温度、时间和缓冲液条件下孵育蛋白质后，降解分散在琼脂平板中的固体聚酯化合物(如PET或PBAT或类似物)的能力；
(5)在给定的温度、缓冲液、蛋白质浓度和聚酯浓度条件下进行多轮聚酯解聚测定的能力；
(6)差示扫描荧光测定法(DSF)；
这些方法的方案细节如下。
3.1圆二色性
使用Jasco 815设备(Easton,USA)进行圆二色性(CD)，以比较SEQ ID N°1的酯酶的熔融温度(Tm)与本发明酯酶的Tm。技术上，在Talon缓冲液中制备0.5mg/mL的400μL蛋白质样品，并用于CD。实现了从280到190nm的第一次扫描，以确定对应于蛋白质正确折叠的两个最大CD强度。然后从25℃到110℃进行第二次扫描，长度上波对应于这种最大强度并提供特定曲线(S形3参数y＝a/(1+e^((x-x0)/b)))，所述曲线由Sigmaplot版本11.0软件分析，Tm是在x＝x0时确定的。获得的Tm反映了给定蛋白质的热稳定性。Tm越高，变体在高温下越稳定。
3.2残余酯酶活性
将1mL的SEQ ID N°1的酯酶或本发明的酯酶的40mg/L溶液(在Talon缓冲液中)在不同温度(40、50、60、65、70、75、80和90℃)下孵育至多10天。定期取样，在0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中稀释1至500倍，然后进行对硝基苯酚-丁酸酯(pNP-B)测定。将20μL样品与175μL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)和5μL 2-甲基-2丁醇(40mM)中的pNP-B溶液混合。酶促反应在30℃在搅拌下进行15分钟，并通过微孔板分光光度计(Versamax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)获得405nm处的吸光度。pNP-B水解活性(初始速度以μmol的pNPB/分钟表示)使用水解曲线线性部分中释放的对硝基苯酚的标准曲线确定。
3.3残余聚酯解聚活性
将10mL的SEQ ID N°1的酯酶和本发明的酯酶的40mg/L溶液(在Talon缓冲液中)分别在不同温度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃)下孵育至多30天。定期取1mL样品，并转移到装有微粉化至250-500μm的100mg无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)和49mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)的瓶子中，并在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下孵育。定期对150μL缓冲液进行取样。需要时，将样品稀释在0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8)中。然后，将150μL甲醇和6.5μL HCl 6N加入到150μL样品或稀释液中。在混合和在0.45μm注射器过滤器上过滤之后，将样品加载到UHPLC上以监测对苯二甲酸(TA)、MHET和BHET的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Inc.Waltham,MA,USA)，包括泵模块、自动进样器、恒温在25℃的柱温箱和240nm的UV检测器。使用的柱是
HS C18HPLC柱(150x 4.6mm，5μm，配备有前置柱，Supelco，Bellefonte，USA)。TA、MHET和BHET使用1mM H2SO4中的MeOH(30％至90％)的1mL/min的梯度分离。注射20μL样品。根据标准曲线测量TA、MHET和BHET，所述标准曲线是在与样品相同的条件下由商业TA和BHET和内部合成的MHET制备的。在水解曲线的线性部分确定PET水解活性(μmol水解的PET/分钟或mg产生的当量TA/小时)，该曲线通过在前24小时期间在不同时间进行取样来建立。当量TA对应于测量的TA与测量的MHET和BHET中所含的TA之和。
3.4基于固体形式的聚酯的降解
将1mL的SEQ ID N°1的酯酶和本发明的酯酶的40mg/L溶液(在Talon缓冲液中)分别在不同温度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃)下孵育至多30天。将20μL酶制剂规律地沉积在含有PET的琼脂平板中产生的孔中。包含PET的琼脂平板的制备通过将500mg PET溶解在六氟-2-丙醇(HFIP)中并将该培养基倒入250mL水溶液中来实现。在52℃和140毫巴下蒸发HFIP后，将溶液与含有3％琼脂的0.2M磷酸钾缓冲液(pH8)v/v混合。使用约30mL混合物制备各托盘(omnitray)并在4℃下储存。
在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2至24小时后，测量并比较由于野生型酯酶和本发明变体降解聚酯而形成的晕圈的直径或表面积。在给定温度下酶的半衰期对应于将晕圈直径减小2倍所需的时间。
3.5多轮聚酯解聚
在酶促反应器中评估了酯酶执行连续几轮聚酯解聚测定的能力。Minibio 500生物反应器(Applikon Biotechnology B.V.,Delft,The Netherlands)从3g无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)和100mL 10mM磷酸钾缓冲液(pH8，其中含有3mg酯酶)开始。使用船用式叶轮，将搅拌设置为250rpm。通过浸入外部水浴将生物反应器恒温在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。通过添加3M的KOH将pH调节为8。得益于BioXpert软件V2.95，监测不同的参数(pH、温度、搅拌、碱添加)。每20h加入1.8g无定形PET(根据WO 2017/198786制备以达到低于20％的结晶度)。定期对500μL反应介质进行取样。
TA、MHET和BHET的量通过HPLC确定，如实施例2.3中描述的。使用Aminex HPX-87K柱(Bio-Rad Laboratories,Inc,Hercules,California,United States)在65℃恒温下测定EG的量。洗脱液为K2HPO4，5mM，0.6mL.min-1。注射20μL。使用折射计监测乙二醇。
基于给定时间下的摩尔浓度(TA+MHET+BHET)与初始样品中包含的TA的总量的比计算水解百分比，或基于给定时间下的摩尔浓度(EG+MHET+2x BHET)与初始样品中包含的EG的总量的比计算水解百分比。降解速率以每小时释放的总TA毫克数或每小时总EG毫克数计算。
酶的半衰期评估为获得50％的降解速率损失所需的孵育时间。
3.6差示扫描荧光测定法(DSF)
使用DSF评估野生型蛋白质(SEQ ID N°1)及其变体的热稳定性，通过确定它们的熔融温度(Tm)，即一半蛋白质群体展开时的温度进行。制备浓度为14μM的蛋白质样品，并储存在由20mM Tris HCl pH 8.0、300mM NaCl组成的缓冲液A中。DMSO中的SYPRO Orange染料5000x储备液首先以250x稀释于水中。将蛋白质样品加载到白色透明96孔PCR板(Bio-Radcat#HSP9601)上，每孔的最终体积为25μl。每个孔中蛋白质和SYPRO Orange染料的最终浓度分别为5μM(0.14mg/ml)和10X。每孔的加载体积如下：15μL缓冲液A、9μL 14μM蛋白质溶液和1μL 250x Sypro Orange稀释溶液。然后用光学质量密封胶带密封PCR板，并在室温下以2000rpm旋转1分钟。然后使用设置为使用450/490激发和560/580发射滤光片的CFX96实时PCR系统进行DSF实验。样品以0.3℃/秒的速率从25℃加热到100℃。每0.03秒进行一次荧光测量。使用Bio-Rad CFX Manager软件从熔融曲线的一阶导数的峰确定熔融温度。
然后基于它们的Tm值对SEQ ID N°1的酯酶和本发明的酯酶进行比较。由于对来自不同产品的相同蛋白质进行的实验之间的高再现性，0.8℃的ΔTm被认为对比较变体具有重要意义。Tm值对应于至少3次测量的平均值。
估算SEQ ID N°1的酯酶的Tm等于38.2℃+/-0.2℃，如实施例3.6中所示。
本发明的酯酶变体的热稳定性示于下表4中，以Tm值表示并根据实施例3.6评估。与SEQ ID N°1的酯酶相比的Tm增益示于括号中。
表4：本发明酯酶的Tm
变体V1-V4具有SEQ ID N°1中所示的确切氨基酸序列，在表4中分别列出的取代组合除外。
Claims (32)
1.一种酯酶，其(i)与SEQ ID N°1中所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和(ii)在对应于选自D204、F209、T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、G205、S207、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251、E253、S14、R73、D85、T86、T89、A179、A206、N215、T217、F239、S245、G249及V252的残基的位置处具有至少一个氨基酸取代，其中所述位置参考SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列编号，以及(iii)具有聚酯降解活性和(iv)与SEQ ID N°1的酯酶相比具有增加的热稳定性和/或增加的降解活性。
2.根据权利要求1所述的酯酶，其中所述酯酶在选自F209、T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251和E253，优选选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253，更优选选自D204、F209和E253的位置处包含至少一个氨基酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的酯酶，其中所述酯酶在选自Q92、S183、D204、F209、N212、S214和E253，优选选自Q92、S183、D204、F209、S214和E253的位置处包含至少一个氨基酸取代。
4.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自T11N/D/E/I/M/Q/S、N12F/H/Y/R/D/E/G/L/N/P/Q/V、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M/V、G62A/D/S、T63N/Q、S65T/N/P/V、S66H、S68A、W69R/D/E/M、L90W/F、Q92G/N/P/Q/T/Y、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q/W、S158Q、K159T、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S180E/D、S183E/D、F188I/Y、D197P、E202M、D204C/K/R、G205K、S207D/L、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、A210T、P211A、N212D/M/Q/E/H/Y、L213F、S214D/P、T216N/P、A219S/E、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、G243Y/P、T246C/E/Y/D、G247Y/D/E/H/S、S250C、D251A/D/E/H/S、E253C、S14D/E、R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、N85A/E/F、T86E/S、T89F/H/Q、A179C、A206D、N215C/D/E、T217Q、F239E、S245C/E、G249T和V252T，优选选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C，更优选选自T61M、S65T、Q92G/P、G135A、T168Q、T177N、S183E、D204C、F209I/W、N212D/M、S214P和E253C，甚至更优选选自D204C、F209I/W和E253C。
5.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C，优选选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、S214D/P和E253C，更优选选自Q92G/P、S183E、D204C、F209I/W、S214P和E253C，甚至更优选选自Q92G、S183E、D204C、F209I、S214P和E253C。
6.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶在位置F209处包含至少一个氨基酸取代，优选所述取代选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M，更优选选自F209I/W。
7.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含在位置D204+E253处的取代组合，优选D204C+E253C的取代组合。
8.根据权利要求7所述的酯酶，其中所述酯酶还在选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、F209、N212和S214的位置，优选在选自Q92、S183、F209和S214的位置包含至少一个额外的取代，优选至少两个取代，更优选至少三个取代。
9.根据权利要求7或8所述的酯酶，其中所述酯酶包含至少一个额外的取代，所述取代选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y和S214D/P，优选选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M和S214D/P，更优选选自Q92G/P、S183E、F209I/W和S214P，甚至更优选选自Q92G、S183E、F209I和S214P。
10.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶在选自以下的位置包含至少两个、优选至少三个、更优选至少四个取代：D204、F209、T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、G205、S207、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251、E253、S14、R73、D85、T86、T89、A179、A206、N215、T217、F239、S245、G249和V252，优选选自F209、T11、N12、R23、N48、T50、A53、Y60、T61、G62、T63、S65、S66、S68、W69、L90、Q92、D94、Y106、M107、S121、A125、M127、G135、P151、L152、T153、T157、D158、K159、T168、T177、S180、S183、F188、D197、E202、D204、G205、S207、A210、P211、N212、L213、S214、T216、A219、K220、Q238、L240、P242、G243、T246、G247、S250、D251和E253，更优选选自T61、S65、Q92、G135、T168、T177、S183、D204、F209、N212、S214和E253，甚至更优选选自Q92、S183、D204、F209、N212、S214和E253。
11.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含在位置F209+D204+E253处的取代组合，优选至少包含选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C、更优选选自F209I/W+D204C/K/R+E253C、甚至更优选选自F209I/W+D204C+E253C的取代组合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含在位置F209+D204+E253+Q92处的取代组合，优选至少包含选自F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y、更优选选自F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、甚至更优选组合F209I+D204C+E253C+Q92G的取代组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含在选自D204+E253、F209+D204+E253、F209+D204+E253+Q92、F209+D204+E253+Q92+S214+S183、F209+D204+E253+Q92+S214+G135+T168、F209+D204+E253+Q92+S214+S183+T168、F209+D204+E253+Q92+S214+G135+T168+S183和F209+D204+E253+N212、优选选自D204+E253、F209+D204+E253+Q92和F209+D204+E253+Q92+S214+S183的位置处的取代组合。
14.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶至少包含选自D204C/K/R+E253C、D204C+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V+S183E/D和F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C/K/R+E253C+N212D/M/Q，优选选自D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q+S183E和F209I/W+D204C+E253C+N212D/M，更优选选自D204C+E253C、F209I+D204C+E253C+Q92G和F209I+D204C+E253C+Q92G+S214P+S183E的取代组合。
15.根据权利要求1所述的酯酶，其中所述酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比具有1至70个选自T11N/D/E/I/M/Q/S、N12F/H/Y/R/D/E/G/L/N/P/Q/V、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M/V、G62A/D/S、T63N/Q、S65T/N/P/V、S66H、S68A、W69R/D/E/M、L90W/F、Q92G/N/P/Q/T/Y、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q/W、S158Q、K159T、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S180E/D、S183E/D、F188I/Y、D197P、E202M、D204C/K/R、G205K、S207D/L、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、A210T、P211A、N212D/M/Q/E/H/Y、L213F、S214D/P、T216N/P、A219S/E、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、G243Y/P、T246C/E/Y/D、G247Y/D/E/H/S、S250C、D251A/D/E/H/S、E253C、S14D/E、R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、N85A/E/F、T86E/S、T89F/H/Q、A179C、A206D、N215C/D/E、T217Q、F239E、S245C/E、G249T和V252T的取代，优选具有1至12个选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C的取代，更优选具有1至7个选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C的取代，甚至更优选具有1至6个选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204C/K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、S214D/P和E253C的取代。
16.根据权利要求1所述的酯酶，其中所述酯酶具有SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列，其与SEQ ID N°1相比具有单个氨基酸取代，所述取代选自T11N/D/E/I/M/Q/S、N12F/H/Y/R/D/E/G/L/N/P/Q/V、R23P、N48T、T50P/E、A53L、Y60F/M、T61M/V、G62A/D/S、T63N/Q、S65T/N/P/V、S66H、S68A、W69R/D/E/M、L90W/F、Q92G/N/P/Q/T/Y、D94S、Y106Q、M107L、S121R/W、A125G、M127G、G135A、P151A、L152Q、T153A、T157E/G/N/Q/W、S158Q、K159T、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S180E/D、S183E/D、F188I/Y、D197P、E202M、D204C/K/R、G205K、S207D/L、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、A210T、P211A、N212D/M/Q/E/H/Y、L213F、S214D/P、T216N/P、A219S/E、K220E、Q238D/T、L240A、P242K、G243Y/P、T246C/E/Y/D、G247Y/D/E/H/S、S250C、D251A/D/E/H/S、E253C、S14D/E、R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V、N85A/E/F、T86E/S、T89F/H/Q、A179C、A206D、N215C/D/E、T217Q、F239E、S245C/E、G249T和V252T，优选选自T61M/V、S65T/N/P/V、Q92G/N/P/Q/T/Y、G135A、T168Q/V、T177H/N/Q/A/E、S183E/D、D204K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y、S214D/P和E253C，更优选选自Q92G/N/P/Q/T/Y、S183E/D、D204K/R、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M、N212D/M/Q/E/H/Y和S214D/P，甚至更优选选自Q92G/P、S183E、F209I/W、N212D和S214P。
17.根据权利要求16所述的酯酶，其中所述单个氨基酸取代选自N212D/M/Q/E/H/Y，优选N212D。
18.根据权利要求14所述的酯酶，其中所述酯酶的氨基酸序列由SEQ ID N°1中所示的氨基酸序列组成，其与SEQ ID N°1相比具有单个取代组合，所述取代组合选自D204C+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+S183E/D+T168Q/V、F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+Q92G/N/P/Q/T/Y+S214P+G135A+T168Q/V+S183E/D和F209A/G/H/I/L/N/R/S/T/W/M+D204C+E253C+N212D/M/Q，优选选自D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+S183E+T168Q、F209I/W+D204C+E253C+Q92G/P+S214P+G135A+T168Q+S183E和F209I/W+D204C+E253C+N212D/M，更优选选自D204C+E253C、F209I+D204C+E253C+Q92G和F209I+D204C+E253C+Q92G+S214P+S183E。
19.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶表现出增加的热稳定性和增加的降解活性。
20.根据权利要求19所述的酯酶，其中与SEQ ID N°1的酯酶相比，所述酯酶在30℃至65℃，优选50℃至60℃，更优选30℃、50℃和/或65℃，甚至更优选50℃和/或65℃的温度下表现出增加的热稳定性和增加的聚酯降解活性。
21.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含选自亲本酯酶中的C241、C259、E174、S130、D176、H208、M131、G59、H129、G132、I171和I178的至少一个氨基酸残基，优选包含选自亲本酯酶中的C241+C259、S130+D176+H208和C241+C259+S130+D176+H208的至少一个组合，更优选至少包含组合C241+C259+E174+S130+D176+H208+M131。
22.根据前述权利要求中任一项所述的酯酶，其中所述酯酶包含选自亲本酯酶中的G59、H129、G132、I171和I178的至少一个氨基酸，优选包含选自亲本酯酶中的I171和I178的至少一个氨基酸，更优选至少包含组合I171+I178，甚至更优选至少包含亲本酯酶中的组合I171+I178+G59+H219+G132。
23.一种核酸，其编码根据权利要求1至22中任一项定义的酯酶。
24.一种表达盒或载体，其包含根据权利要求23所述的核酸。
25.一种宿主细胞，其包含根据权利要求23所述的核酸或根据权利要求24所述的表达盒或载体。
26.一种组合物，其包含根据权利要求1至22中任一项定义的酯酶，或根据权利要求25所述的宿主细胞或其含有所述酯酶的提取物。
27.一种降解聚酯的方法，其包括：
(a)使所述聚酯与根据权利要求1至22中任一项所述的酯酶或根据权利要求25所述的宿主细胞或根据权利要求26所述的组合物接触；以及，任选地
(b)回收单体和/或低聚物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些材料的共混物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中步骤(a)在20℃至90℃、优选40℃至90℃、更优选50℃至70℃、甚至更优选50℃至65℃的温度下实施。
30.根据权利要求27至29所述的方法，其中步骤(a)在5至9之间的pH下、优选在6至9的pH范围内、更优选在6.5至9的pH范围内实施。
31.一种含聚酯材料，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的酯酶或根据权利要求25所述的宿主细胞或根据权利要求26所述的组合物。
32.一种洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的酯酶或根据权利要求23所述的宿主细胞或根据权利要求24所述的组合物。
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