CN110087690A - 葡萄糖敏感性肽激素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及式P‑L‑I的缀合物，其中P是影响体内碳水化合物代谢的肽激素，L是由Lp和Li组成的可水解分子，并且I是能够抑制肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子。在体内条件下，所述缀合物是主要化合物。当体内葡萄糖浓度增加时，影响体内碳水化合物代谢的肽激素的浓度也会增加。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄糖响应性肽缀合物，其包含影响体内碳水化合物代谢的肽激素，以及通过可水解连接子分子缀合的使肽激素活性失活或抑制其的试剂(或促进肽激素活性的失活或抑制的试剂)。
此外，本发明涉及葡萄糖响应性肽缀合物作为药物的用途，特别是用作治疗糖尿病的药物。
根据本发明的缀合物的肽激素部分在缀合物中处于非活性状态，这是由于抑制剂的存在使肽激素的活性失活或抑制肽激素的活性。
缀合物的可水解连接子促进了肽激素、抑制剂和缀合物在体内以动态平衡存在。
本发明还涉及药用或兽医用组合物，其包含根据本发明的缀合物和至少一种药用或兽医赋形剂。
在存在碳水化合物例如葡萄糖的情况下，当与碳水化合物结合时，缀合物的肽激素部分从平衡中除去(尽管结合肽激素的碳水化合物参与肽激素、碳水化合物和肽激素-碳水化合物缀合物之间的新动态平衡)，由此非共轭肽激素部分的库增加，并且激素活性增加，从而使得活性肽激素部分的浓度响应于体内葡萄糖浓度的增加而增加。或者，在存在碳水化合物例如葡萄糖的情况下，葡萄糖促进平衡的转变，从而产生更具活性的P。
背景技术
肽特别是激素经常用作治疗剂以治愈或控制一系列疾病。对碳水化合物代谢具有治疗作用的一系列治疗性肽激素用于控制人类的一系列疾病，例如糖尿病、肥胖症和代谢紊乱。
优选地，需要这些肽的活性以响应于血糖水平升高(即体内葡萄糖浓度升高)，因此影响碳水化合物代谢的一系列治疗性肽在餐后施用，即响应血糖水平升高。
如此施用很繁琐并且需要频繁施用以及持续监测患者。
这些问题可以通过施用作为贮库的肽激素来解决，所述贮库响应于体内升高的葡萄糖浓度而释放和/或活化活性肽激素。
存在几种通过与稳定分子的共价连接从而实现具有增加的稳定性和功效的多肽的技术。此类多肽与根据本发明的葡萄糖响应性肽缀合物的根本区别在于，根据本发明的多肽缀合物在与人体体内条件相似的条件下是可水解的。
作为实例，WO 2009/067636 A2在实施例12中描述了胰岛素多肽缀合物，其包含通过已经原位还原成稳定的肼连接子的肼键与PEG缀合的胰岛素多肽。所得的多肽是稳定的，并且肼键不能在体内水解。因此，根据WO 2009/067636 A2的胰岛素缀合物从根本上不同于根据本发明的葡萄糖响应性肽缀合物。
WO 2009/059278A1描述了由于与Fc分子的连接而具有增加的稳定性的多肽。在该参考文献的权利要求7中，描述了制备这种分子的方法。在执行该方法时，形成包含活化的GLP-1肽和Fc分子的腙中间体，其随后还原成最终稳定的肼产物。
J.Mu等人("FGF21 Analogs of sustained Action Enabled by OrthogonalBiosynthesis Demonstrate Enhanced Antidiabetic Pharmacology in Rodents",Diabetes,Vol.61,no.2,30December 2011)描述了通过肟加合至PEG而稳定的FGF21。因此，根据Mu等人的稳定肽缀合物从根本上不同于根据本发明的葡萄糖响应性肽缀合物。
与上述公开内容相反，本发明涉及影响体内碳水化合物代谢的肽激素，其中肽激素通过可水解连接子分子与失活部分缀合，由此在体内产生失活的肽激素和活性肽激素之间的平衡。因此，例如可以在体内实现葡萄糖依赖性胰岛素活性。
已知几种用于实现胰岛素的葡萄糖依赖性释放的技术。
例如，与苯基硼酸(PBA)缀合的胰岛素可以通过PBA部分与D-葡萄糖结合。Hoeg-Jensen等已经描述了这种葡萄糖感应胰岛素(Hoeg-Jensen等,J.Pept.Sci.2005,11,339-346)。在例如D-葡糖胺聚酰胺聚合物中配制的硼酸盐-胰岛素能够通过置换而在葡萄糖存在下释放胰岛素。此外，Chou等人报道了与血浆蛋白如HSA结合的苯基硼酸-脂化胰岛素，并且在葡萄糖存在下，硼酸-胰岛素HSA复合物将被破坏，从而增加血液中的游离胰岛素分数(Chou et al.PNAS,2014,112(8),2401-2406)。PBA技术面临的挑战是缺乏特异性和对其他二醇(例如果糖)的高亲和力。
ConA(伴刀豆球蛋白A)是结合葡萄糖和麦芽糖的凝集素。如果配制在聚合物中，ConA可在高血糖条件下结合葡萄糖，导致聚合物溶胀或分解并释放胰岛素(Brownlee等,Science,1979,206(4423),1190-1191；Zion TC,2004,PhD thesis MassachusettsInstitute of Technology,"Glucose-responsive materials for self-regulatedinsulin delivery")。该方法的挑战是对非天然ConA分子的免疫应答和ConA天然分子的稳定性。
葡萄糖氧化酶对葡萄糖具有高度特异性，并将葡萄糖转化为氧、过氧化氢和葡萄糖酸。在体内微凝胶或纳米颗粒中配制葡萄糖氧化酶将在高血糖条件下产生酸性微环境，这导致胰岛素释放(Gu等.,ACS Nano,2013,7(8),6758-6766；Luo et al,Biomaterials,2012,33,8733-8742；Qi et al.,Biomaterials,2009,30,2799-2806)。后一种方法的挑战是它具有细胞毒性，因为过氧化氢必须在传感器中猝灭。该技术响应速度慢，易受pH影响。
因此，本领域普遍需要新手段和方法提供肽激素以响应体内葡萄糖浓度升高而获得改变的优选为增加的活性。
因此，本发明的一个目的是提供用于响应于人体或动物体中体内葡萄糖浓度升高而改变，优选增加肽激素活性的手段和方法。
本发明的另一个目的是提供用于响应于人体或动物体中体内葡萄糖浓度下降而改变，优选降低肽激素活性的手段和方法。
本发明的另一个目的是提供用于响应人体或动物体中体内波动的葡萄糖浓度而改变肽激素活性的手段和方法，从而在人体或动物体内，肽激素活性响应于葡萄糖浓度降低而降低，并且响应于葡萄糖浓度的增加而增加。
此外，本发明的目的是提供葡萄糖响应性治疗性肽缀合物。
定义：
根据本发明，肽缀合物是包含第一部分和第二部分的缀合物，所述第一部分包含肽激素，第二部分包含失活手段，即用于使肽激素失活的手段，在本文中也称为“抑制剂”，所述第一和第二部分通过可水解连接子部分缀合。
根据本发明，肽激素是在体内激活或失活某些分子途径的肽，由此改变被施用肽激素的受试者的代谢活性。优选地，根据本发明的肽激素包括胰腺激素例如胰岛素或胰淀素(amylin)，肠激素例如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胃抑制性多肽(GIP，也称为葡萄糖依赖性促胰岛素肽)或胆囊收缩素(CCK)，脂肪细胞衍生激素如脂联素或瘦蛋白，肌细胞因子(myokine)如白细胞介素6(IL-6)或白细胞介素8(IL-8)，肝脏来源的激素如β细胞胰岛营养因子(betatrophin)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)和成纤维细胞生长因子21(FGF21)。此外，根据本发明的肽激素可以是脑来源的蛋白质，例如脑源性神经营养因子(BDNF)和生长激素。
根据本发明，胰岛素类似物是在人体或动物中体内具有胰岛素样功能的肽，即通过促进葡萄糖吸收从血液进入脂肪、肝脏和骨骼肌细胞，而调节碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的功能。
根据本发明，可水解连接子是指将肽激素和抑制剂结合在一起但在体内条件下易于进行一定程度水解的化合物，从而使得在体内条件下(在正常血糖水平下)缀合物的大部分肽激素部分与抑制剂一起存在，即作为本发明的肽缀合物的一部分，以及在体内条件下(在正常血糖水平下)缀合物的少数肽激素部分不含连接子化合物。根据本发明，如果连接子于体外在pH7.4的磷酸盐缓冲液中水解，则连接子在体内可水解，从而使得连接子和已水解的连接子之间的平衡在5小时内存在，使得至少1％且至多50％的连接子被水解。
根据本发明，如果在实施例6中描述的条件下在96小时内，优选在72小时内，更优选在24小时内连接子在葡萄糖和至少部分连接子之间产生缀合物，则缀合部分P-Lp和Li-I中的至少一个在体内与葡萄糖共价结合。
根据本发明，如果在10.000当量葡萄糖存在下，连接子于体外在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中水解，则葡萄糖促进可水解连接子L的水解，从而使得连接子和已水解的连接子之间的平衡在5小时内存在，使得至少2％且至多100％的连接子被水解，并且使得葡萄糖的存在增加了已水解的连接子的量。
根据本发明，失活剂(I)是能够使肽(P)的活性位点失活的分子。这种分子(I)可以是例如能够限制P的活性部位暴露于环境的分子。例如，限制P的活性位点暴露于环境可以是例如通过将P(通过缀合物的可水解连接子和失活剂部分)与大分子物质如PEG、Fc抗体、XTEN、PAS化(PASylation)、血清白蛋白(共价)、碳水化合物聚合物(如葡聚糖、HES、聚唾液酸化)、纳米粒子和水凝胶结合来实现。根据本发明，如果在实施例9的条件下(其中P是胰岛素)PI的活性为50％或更低，则失活剂(I)是能够使肽(P)失活的分子。
根据本发明，作为选择，抑制剂或失活剂(I)可以是能够与人血清中的较大蛋白质结构非共价结合的分子，从而在体内促进根据本发明的多种缀合物的聚集。根据本发明的该方面，抑制剂或失活剂(I)可以是小分子白蛋白结合剂或脂质分子，或能够与血清白蛋白非共价结合的任何分子。
胰岛素的失活剂或抑制剂也可以是在抑制胰岛素活性的位置通过L与胰岛素结合、连接的分子。
根据本发明，能够使肽(P)的活性位点失活的分子是一种分子结构，当存在于缀合物中时，其负责将相关肽激素的活性降低到如下程度，即在如实施例9中所述的体外条件(其中P是胰岛素)中相关肽激素的活性降低至小于肽(P)活性(即，在不存在能够使肽的活性位点失活的分子的情况下P的活性(P))的50％，优选小于40％，甚至更优选小于30％，甚至更优选小于20％，最优选小于10％。可以使用肽“P”的功能性受体测定来测量失活剂或抑制剂的抑制能力。首先，可以测量溶解在pH 7.4的PBS中的P-L-I分子的功能性(EC50)，其次，可以测量P-Lp-Glc或P-L分子(如果在相关的大分子结构存在下相关)。可以通过将1.000当量葡萄糖添加到P-L-1混合物，溶解在pH 7.4的PBS中，并使其反应72小时来形成P-Lp-Glc。如果抑制剂“I”是能够与人血清中较大蛋白质结构非共价结合的分子，例如能够结合血浆蛋白质的分子，则相关结构或蛋白质应包括在实验中。与P-Lp-Glc相比，P-L-I的功能性(EC50)决定了抑制剂“I”降低肽“P”活性的能力。
发明内容
根据本发明的肽缀合物通过建立动态平衡响应于体内葡萄糖浓度升高而释放活性肽激素，处理并解决了响应于体内波动的碳水化合物浓度而改变肽激素的激素活性的问题。响应于体内葡萄糖浓度下降，由于从缀合肽库(pool of conjugated peptide)中释放较少以及肽激素本身的半衰期相对较短，活性肽激素库(pool of active peptidehormone)降低。
因此，本发明提供了用于提供葡萄糖响应疗法的新方法和手段。根据本发明的治疗性肽缀合物通过由与包含失活手段的第二部分偶联的包含活性肽激素的第一部分组成，而是葡萄糖响应性的。所述失活手段可以通过例如促进贮库形成、促进与大分子如血清白蛋白的结合，或通过直接抑制肽激素的活性位点来使肽激素失活。由偶联至包含使肽激素失活的手段的第二部分的包含肽激素的第一部分所组成的缀合物是本领域已知的，即作为胰岛素贮库，其中胰岛素与较大分子如血清白蛋白共价或非共价偶联。这些胰岛素贮库缓慢且持续地在体内将胰岛素递送至身体。
本发明在于例如使用可水解连接子将肽激素与失活手段结合，其中可水解连接子(或其部分)在水解后能够结合碳水化合物，优选葡萄糖。通过碳水化合物优选葡萄糖的存在来防止水解后的再结合。在另一个实施方式中，碳水化合物优选葡萄糖的存在防止了在L水解后通过另一种机制重新形成连接子(L)。在另一个实施方式中，碳水化合物优选葡萄糖的存在促进了L的水解。
本发明缀合物的第一和第二部分通过可水解连接子连接。至少一部分可水解连接子在水解后结合葡萄糖，或者，葡萄糖促进可水解连接子的水解。
在溶液中，例如在体内，根据本发明的缀合物将以动态平衡存在，所述动态平衡包括非活性肽缀合物(其中连接子是未水解的)以及其分离的两部分，即分离的其中连接子被水解的活性肽激素和失活手段。
当存在葡萄糖时，葡萄糖将与可水解连接子的至少一部分结合，由此结合葡萄糖的部分，即结合葡萄糖的活性肽激素和/或结合葡萄糖的失活手段将不再参与PLI、PLP和LII之间的动态平衡。
动态平衡将替代被去除的部分，从而在葡萄糖浓度增加时递送新的活性肽激素。
在另一个实施方式中，当存在葡萄糖时，葡萄糖促进可水解连接子的水解，由此改变动态平衡，从而使得在动态平衡中形成增加量的活性肽激素。
具体实施方式
本发明基于如下创造性的发现，即通过经由可水解连接子将肽激素偶联至失活手段，可以使肽激素及其活性响应体内葡萄糖浓度，所述可水解连接子在水解时结合葡萄糖，或其水解受葡萄糖促进。
因此，在活性肽激素和非活性肽缀合物之间存在体内动态平衡。
在不存在葡萄糖(Glc)的情况下，或在非常低浓度的葡萄糖存在下，大多数肽激素将是根据本发明的肽缀合物的形式，即由于动态平衡有利于非活性缀合物，它们将处于失活形式。
然而，在葡萄糖存在下，葡萄糖与活性肽激素和/或失活剂结合，从而阻碍了由与葡萄糖结合的肽激素形成非活性的肽缀合物。在这种情况下，对于每个与葡萄糖相结合的肽激素，动态平衡将从非活性肽缀合物的储库产生一个活性肽激素。换言之，葡萄糖的存在将启动从作为非活性肽缀合物的一部分存在的肽激素的储库中释放活性肽激素。葡萄糖浓度降低将启动活性肽激素水平降低。作为另一种选择，通过碳水化合物优选葡萄糖的存在可以实现相同的效果，在L通过任何其他机制水解后防止重新形成连接子(L)。
作为选择，通过受葡萄糖促进的可水解连接子的水解可以实现相同的效果。
这一发现例如为建立葡萄糖响应性肽激素贮库，例如葡萄糖响应性胰岛素贮库铺平了道路。
因此，在其最广泛的方面，本发明涉及式P-L-I的缀合物，其中P是影响体内碳水化合物代谢的肽激素，L是由Lp和Li组成的连接子分子，并且I是能够失活或抑制肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子，其特征在于
a.所述连接子分子L在体内可水解，使得缀合物P-L-I和水解的缀合物部分P-Lp和Li-I在体内以动态平衡存在，其中缀合物P-L-I以相对于缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一种摩尔过量而存在，并且其特征还在于
b.缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一个与葡萄糖共价结合，由此当体内葡萄糖浓度增加时，未与I缀合的P浓度在体内增加，或者，其特征还在于葡萄糖促进所述可水解连接子L的水解。
P：
P是影响体内碳水化合物代谢的肽激素。
在本发明的一个方面，所述肽激素P是胰腺激素，例如胰岛素或胰淀素。在本发明的另一方面，所述肽激素是肠激素例如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，胃抑制性多肽(GIP，也称为葡萄糖依赖性促胰岛素肽)或胆囊收缩素(CCK)，或其类似物。在本发明的另一个方面，所述肽激素是脂肪细胞衍生的激素，例如脂联素或瘦蛋白。在本发明的另一个方面，所述肽激素是肌细胞因子，例如白细胞介素6(IL-6)或白细胞介素8(IL-8)或其类似物。在本发明的另一方面，所述肽激素是肝脏来源的激素，例如β细胞胰岛营养因子、成纤维细胞生长因子19(FGF19)或成纤维细胞生长因子21(FGF21)或其类似物。在本发明的另一个方面，所述肽激素是脑来源的蛋白质，例如脑源性神经营养因子(BDNF)或其类似物。在本发明的另一个方面，肽激素是生长激素或其类似物。
在本发明的一个高度优选的方面，所述肽激素是胰岛素或其类似物，或能够激活胰岛素受体(INR)的分子。
根据本发明，结合了葡萄糖的肽激素也包括在P的定义中。
I:
I是能够失活或抑制肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子或物质，例如，通过在体内形成非活性复合物或通过直接抑制肽激素的活性位点来促进肽激素活性的失活或抑制。
能够失活或抑制肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子和机制在本领域中是众所周知的。通常，可以通过限制P的活性位点暴露于环境来实现体内失活或抑制肽激素。例如，限制P的活性位点暴露于环境可以是例如通过如下来实现，即将P(通过缀合物的可水解连接子和失活剂部分)与大分子物质如PEG、Fc抗体、XTEN、PAS化、血清白蛋白(共价)、碳水化合物聚合物(如葡聚糖、HES、聚唾液酸化)、纳米颗粒和水凝胶结合。或者，I可以是小分子白蛋白结合剂或能够与血清白蛋白非共价结合的脂质。胰岛素的失活剂或抑制剂也可以是在抑制胰岛素活性的位置通过L与胰岛素结合、连接的分子。
当存在于缀合物中时，根据本发明的失活剂或抑制剂应当负责将相关肽激素的活性降低至以下程度，即相关肽激素的活性降低至低于在体外条件下不存在附着的失活剂或抑制剂时的活性的50％，优选低于40％，甚至更优选低于30％，甚至更优选低于20％，最优选低于10％。可以使用肽“P”的功能性受体测定来测量失活剂或抑制剂的抑制能力。首先，可以测量溶解在pH7.4的PBS中的P-L-I分子的功能性(EC50)，其次，可以测量P-Lp-Glc分子(如果在相关的大分子结构存在下相关)。可以通过将1.000当量葡萄糖加入P-L-I混合物，溶解在pH 7.4的PBS中，并使其反应72小时来形成P-Lp-Glc。如果抑制剂“I”是能够结合血浆蛋白的分子，则该蛋白应该包括在实验中。与P-Lp-Glc相比，P-L-I的功能性(EC50)决定了抑制剂“I”降低肽“P”活性的能力。
L:
L是可水解连接子分子，由Lp和Li组成。当L水解时，将一分子水加入L中，这导致L裂解成Lp和Li。
L必须在体外和体内可水解，但优选L仅以低频率水解，使得L、Lp和Li在体外和体内条件下在水中以动态平衡存在，其中L(缀合物)是主要的化合物而Li、Lp(缀合部分)是次要化合物。换言之，L在体外条件下以相对于的Lp和Li摩尔过量存在，这意味着在体外条件下P-L-I以相对于P-Lp和Li-I摩尔过量存在。如果连接子在实施例6中描述的体外条件下导致存在动态平衡，则称其为根据本发明是可水解的，其中相对于缀合物部分P-Lp和/或Lp-I的存在而言，P-L-I以至少2:1，优选至少3:1，更优选至少4:1，甚至更优选至少5:1，甚至更优选至少10:1，甚至更优选至少50:1，最优选至少100:1的摩尔过量存在。可以通过将P-L-I分子溶解在pH7.4的PBS中，并在24小时后使用UPLC-MS研究P-Lp或Li-I与P-L-I之间的比率从而来测量P-L-I分子的体外水解性。
在本发明的一个优选实施方式中，Lp或Li(或Lp和Li二者)必须能够与碳水化合物共价结合，例如优选葡萄糖。在与葡萄糖结合后，与葡萄糖结合的各个片段(P-Lp-Glc和/或Glc-Li-I)不再能够参与缀合物P-L-I的形成。如果在使化合物与摩尔过量的葡萄糖接触72小时内化合物能够形成葡萄糖-缀合的结构，则称该化合物能够与葡萄糖共价结合。可以如实施例2中所示测量在体外连接子的葡萄糖结合能力。将连接子“L”与1000当量的葡萄糖一起溶解在pH7.4的PBS中，在24、48和72小时后通过LC-MS测量产生的Lp-Glc。
在一个替代实施方式中，葡萄糖可以通过另一种机制阻止Lp和Li的重新结合，而不是结合Lp和Li中的一个或两个。
在另一个备选实施方式中，葡萄糖促进、助于或增强L的水解。
在本发明的一个优选方面，L是腙、O,O-缩醛、N,O-缩醛、N,N-缩醛、包括噻唑烷和噻唑啉的S,N-缩醛，或包括二硫戊环的S,S-缩醛，以及它们的衍生物。
腙是特别优选的，因为它们具有良好描述的化学性质，易于形成，并且可以直接调节键趋于水解和其他反应的稳定性和不稳定性。
虽然预期缩醛(包括O、N、S)的交换速度比腙慢，但缩醛也是特别优选的，因为有可能调节键趋于水解和其他反应的稳定性和不稳定性，以及易于生物降解的裂解产物的形成。
在本发明的一个高度优选的方面，L是通式1的腙：
其中，R1优选为在芳环和腙之间具有1-10个碳间隔子烷基链的芳环，以及
R2优选为苯甲酰基。
优选地，R1是通过烷基连接子与腙相连的具有弱至中等活化(给电子)或失活(吸电子)取代基的芳环。
最优选地，R2是具有中等至强给电子取代基例如-酰胺、-OMe、-N(CH3)2或-OH的苯甲酰基。
特别地，L可以是通式2的缀合物：
其中，
R1优选为在芳环和腙之间具有1-10碳间隔子烷基链的芳环，以及
R3是给电子基团，和
R4包含P或I。
最优选地，R1是通过烷基连接子与腙相连的具有弱至中等活化或失活的取代基的芳环。
在本发明的一个优选实施方式中，L是以下通式的缀合物
其中R1选自：
其中a为1-10；n为0-4；R5是氢、甲基或乙基；R6是氢、甲基、乙基、烷烃、肽(P)和/或抑制剂(I)；R7是氢、O-苄基、O-甲基、O-烷烃、酰胺、胺、卤素、NO2、肽(P)和/或抑制剂(I)；W是碳(CH2、CH或C)、氮(NH)、NCH3、硫(S)和/或氧(O)，
以及其中R2选自：
其中b为1-10；n为0-4，R8是氢、苄基、甲基、烷烃、肽(P)和/或抑制剂(I)；R9是氢、甲基、烷烃、肽(P)和/或抑制剂(I)；R10是卤素(Cl、Br、I或F)、酯、羧酸和/或抑制剂I；R11是氢、O-苄基、O-甲基、O-烷烃、酰胺、胺、卤素、肽(P)和/或抑制剂(I)，W是碳(CH2、CH或C)、氮(N或NH)、硫(S)和/或氧(O)。
P-L-I：
根据本发明的式P-L-I的缀合物是包含上述组分P、L和I的缀合物。
由于L的可水解性质，缀合物P-L-I在体内以动态平衡存在
其中P-L-I相对于P-Lp和Li-I中的一个或两个摩尔过量。
由于P和I的结合，缀合物P-L-I在体内是非活性的(或具有降低的功效)，而肽激素P-Lp以及肽激素P-Lp-Glc在体内是活性肽激素。
在本发明的一个高度优选的方面，P-Lp与葡萄糖(Glc)共价结合。
因此，阻止已活化的P(不再与I结合的P)与抑制剂进一步结合。例如，如果L是腙，则P-Lp是酰肼。酰肼可与葡萄糖反应形成新的腙P-Lp-Glc。因此，通过与葡萄糖结合，阻止活性肽激素的酰肼与抑制剂进一步反应。理论上，P-Lp-Glc分子与P-Lp和葡萄糖处于新的平衡状态，但由于葡萄糖浓度比体内P-Lp部分高10,000当量以上，因此预计当葡萄糖与P-Lp结合形成P-Lp-Glc时，解离非常缓慢，因此，P-Lp-Glc可以被认为是稳定的分子。相反，Li-I部分现在是醛，其可以与其他组分反应。
在本发明的另一个实施方式中，可水解连接子L的水解受葡萄糖促进，由此动态平衡在葡萄糖存在下发生改变。
在本发明的高度优选的方面，P是胰岛素或胰岛素类似物或能够激活胰岛素受体(INR)的分子。优选地，P能够激活μM浓度以下，例如浓度小于1μM的胰岛素受体。
另一方面，本发明涉及式P-L-I的缀合物用于治疗人类疾病的用途，其中P是影响体内碳水化合物代谢的肽激素，L是由Lp和Li组成的连接子分子，并且I是能够抑制肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子，其特征在于
a.所述连接子分子L在体内可水解，使得缀合物P-L-I和水集的缀合物P-Lp+Li-I在体内以动态平衡存在，其中缀合物P-L-I以相对于缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一种摩尔过量而存在，并且其特征还在于
b.缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一个与葡萄糖共价结合，由此当体内葡萄糖浓度增加时，未与I结合的P浓度在体内增加，或者，其特征还在于葡萄糖促进所述可水解连接子L的水解。
在另一方面，本发明涉及治疗受试者疾病的方法，该方法包括对受试者施用式P-L-I的缀合物，其中P是影响体内碳水化合物(优选葡萄糖)代谢的肽激素，L是由Lp和Li组成的连接子分子，并且I是能够抑制肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子，其特征在于
a.所述连接子分子L可在体内水解，使得缀合物P-L-I和水解的缀合物P-Lp+Li-I在体内以动态平衡存在，其中缀合物P-L-I以相对于缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一种摩尔过量而存在，并且其特征还在于
b.缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一个与葡萄糖共价结合，由此当体内葡萄糖浓度增加时，未与I结合的P--Lp的浓度在体内增加，或者，其特征还在于葡萄糖促进所述可水解连接子L的水解。
在本发明的高度优选的方面，P是胰岛素或胰岛素类似物。
在本发明的一个高度优选的方面，I是能够通过促进贮库形成，例如，通过促进与大分子(例如血清白蛋白)的结合来失活或抑制P的试剂。
在本发明的另一个高度优选的方面，I是能够抑制P的活性位点的试剂，例如，在抑制肽激素活性的位置与肽激素(例如胰岛素)结合的抑制剂。
在本发明的另一个高度优选的方面，I是能够通过促进贮库形成，例如，通过促进P与大分子(例如血清白蛋白)的结合来失活或抑制P的试剂。或者，I可以是能够在结构中聚集多个组分的试剂，例如水凝胶或纳米颗粒。
在本发明的另一个方面，I是大分子，例如血清白蛋白。
在本发明的另一个方面，I是水凝胶。水凝胶是由聚合物链网络组成的亲水性凝胶，其中水是分散介质。在本发明的这个方面，水凝胶是抑制剂(I)，并且水凝胶上的化学手柄允许肽激素(P)通过连接子(L)共价连接。
在本发明的一个方面，I是纳米颗粒。纳米颗粒(可以视为一种类型的胶体药物递送系统)包含直径为2-1000nm的颗粒。在本发明的这个方面，纳米颗粒可以用聚合物包被，允许肽激素(P)通过连接子(L)共价连接。
然而，在高度优选的方面，I是能够与血清白蛋白非共价结合的试剂，例如脂肪酸或小分子白蛋白结合物，或其他血浆蛋白。
在本发明的一个高度优选的方面，I是能够通过促进贮库形成，例如，通过促进P与大分子(例如血清白蛋白)的结合来失活或抑制P的试剂。优选地，这种试剂是脂肪酸，其包含结构A，其中A选自；
以及c至少为10。
其他优选的抑制剂(I)：
在另一个高度优选的方面，I是防止缀合的肽在肾脏中被清除的大分子。此类分子可以是重组白蛋白、Fc抗体、PEG或碳水化合物聚合物，例如葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)或唾液酸聚合物(聚唾液酸化)。
除了抑制缀合物中激素P的活性外，重组白蛋白能够通过连接子(L)加载肽(P)，导致肽激素P的低肾排泄，从而提供在体内持续时间更长的系统。类似地，通过连接子(L)将肽(P)缀合至IgG抗体的Fc部分使得能够通过Fc受体再循环缀合物，导致低的肾清除率。以相同的方式，使用PEG20至PEG80，肽(P)经由连接子(L)与聚乙二醇(PEG)的化学缀合通过增加肽的流体动力学体积来防止肾排泄。因此，在本发明的一个高度优选的方面，I是重组白蛋白、Fc抗体或PEG。
以相同的方式，碳水化合物聚合物，例如葡聚糖、羟乙基淀粉(HES)或其聚唾液酸化的缀合物，可以防止缀合的肽在肾中被清除。葡聚糖聚合物可以从细菌如肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)获得，并且是通过α(1-6)糖苷键和少量α(1-3)键(在肠膜明串珠菌的情况下为约95％α(1-6)和5％α(1-3))连接的D-葡萄糖聚合物。除未修饰的葡聚糖外，还有各种合成葡聚糖衍生物，如羧甲基-葡聚糖(CMD)、二乙氨基乙基葡聚糖(DEAED)、CMD的糖基化形式如半乳糖-CMD(Gal-CMD)和甘露糖-CMD(Man-CMD)、羧甲基苄基酰胺葡聚糖(DCMB)、羧甲基硫酸盐葡聚糖(DCMSu)和羧甲基苄基酰胺硫酸盐葡聚糖(DCMBSu)可用于通过连接子(L)化学修饰肽(P)。葡聚糖如同PEG一样增加肽的流体动力学体积，导致肾过滤减少。羟乙基淀粉(HES)是通过植物多糖支链淀粉的受控羟乙基化获得的改性天然聚合物。支链淀粉是D-葡萄糖的聚合物，其主要含有α-1,4糖苷键，但也具有较低丰度的α-1,6键，产生天然支化的碳水化合物。淀粉前体的羟乙基化有两个目的：第一，通过增加水结合能力和降低粘度来增加水溶性；第二，防止被血浆α-淀粉酶立即降解和随后的肾排泄。HES可以在还原端进行化学修饰，从而允许P-L部分的连接。'唾液酸'不是指单一的化学实体，而是指整组的九碳单糖，最重要的例子是5-N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、5-N-乙醇酰基神经氨酸(glycolylneuraminic acid)(Neu5Gc)、和2-酮-3-脱氧不饱和酮酸(Kdn)。然而，人体中唯一观察到的聚唾液酸(PSA)变体是多聚唾液酸(colominic acid(CA))，即线性α-2,8-连接的Neu5Ac均聚物。聚唾液酸与肽或蛋白质的缀合称为聚唾液酸化。类似于PEG和PEG模拟物葡聚糖和HES，聚唾液酸化缀合物的长药代动力学特征背后的驱动力被认为是流体动力学半径的增加，导致肾清除率降低以及屏蔽酶促降解和抗体识别。
优选的可水解连接子：
在本发明的一个优选方面，L选自腙、O,O-缩醛、N,O-缩醛、N,N-缩醛、包括噻唑烷和噻唑啉的S,N-缩醛，或包括二硫戊环的S,S-缩醛，以及它们的衍生物。
在本发明的一个高度优选的方面，L是腙或缩醛或其衍生物。
在本发明的一个高度优选的方面，L是腙或腙衍生物。特别地，L可以是以下通式的化合物
其中，
R1包括I或P，优选与芳族部分连接，和
R2包括P或I。
特别地，L可以是以下通式的化合物
其中，
R1包括与I或P连接的芳族部分，以及
R3是给电子基团，以及
R4包括P或I。
R3可能不是芳族部分的唯一给电子基团。
P或I也可以通过芳族部分的给电子基团与L连接。
在本发明的一个高度优选的方面，R1包括由包含至少3个碳原子的碳链组成的间隔区。
根据本发明的缀合物可用于人或动物受试者的治疗或预防性治疗。
特别地，根据本发明的缀合物可用于治疗人或动物受试者中的糖尿病。甚至更特别地，根据本发明的缀合物可以用于治疗人或动物受试者中的糖尿病，该治疗包括以每天2次或更少次施用的频率施用缀合物。甚至更特别地，根据本发明的缀合物可以用于治疗人或动物受试者中的糖尿病，该治疗包括以每天1次或更少次给药的频率施用缀合物。
因此，本发明还涉及治疗糖尿病的方法，所述方法包括将根据本发明的缀合物施用给有需要的人。
另一方面，本发明涉及药物组合物，其包括根据本发明的缀合物和至少一种药物赋形剂。
另一方面，本发明涉及兽医用组合物，其包括根据本发明的缀合物和至少一种兽医用赋形剂。
在一个高度优选的实施方式中，本发明涉及式P-L-I的缀合物在治疗人体或动物体中的用途，其中P是影响体内碳水化合物代谢的肽激素，L是由Lp和Li组成的可水解连接子分子，并且I是能够失活或抑制肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子，其特征在于
a.所述连接子分子L可在体内水解，使得缀合物P-L-I和缀合物部分P-Lp和Li-I在体内以动态平衡存在，其中缀合物P-L-I以相对于缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一种摩尔过量而存在，并且其特征还在于
b.缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一个与葡萄糖共价结合，由此当体内葡萄糖浓度增加时，未与I结合的P浓度在体内增加，或者，其特征还在于葡萄糖促进所述可水解连接子L的水解。
在另一个高度优选的实施方式中，本发明涉及式P-L-1的缀合物，其中
P是胰岛素或胰岛素类似物，
L选自腙、O,O-缩醛、N,O-缩醛、N,N-缩醛、包括噻唑烷和噻唑啉的S,N-缩醛，或包括二硫戊环的S,S-缩醛，以及它们的衍生物，以及
I是能够与血清白蛋白非共价结合的分子，或者I是血清白蛋白。
式P-L-1的缀合物(其中I是血清白蛋白)可以在施用P-L后在人体或动物体内体内形成。
在一个高度优选的实施方式中，本发明涉及其在治疗人类受试者中的用途。在一个高度优选的实施方式中，本发明涉及其在治疗人类受试者糖尿病中的用途。在一个高度优选的实施方式中，本发明涉及其在制备用于治疗人受试者糖尿病的药物中的用途。
在另一个高度优选的实施方式中，本发明涉及式P-L-1的缀合物，其中
P是胰岛素或胰岛素类似物，
L选自腙、O,O-缩醛、N,O-缩醛、N,N-缩醛、包括噻唑烷和噻唑啉的S,N-缩醛，或包括二硫戊环的S,S-缩醛，以及它们的衍生物，以及
I是能够与血清白蛋白非共价结合的分子，或者I是血清白蛋白，其特征在于
a.所述连接子分子L可在体内水解，使得缀合物P-L-I和缀合物部分P-Lp和Li-I在体内以动态平衡存在，其中缀合物P-L-I以相对于缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一种摩尔过量而存在，并且其特征还在于
b.缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一个与葡萄糖共价结合，由此当体内葡萄糖浓度增加时，未与I结合的P浓度在体内增加，或者，其特征还在于葡萄糖促进所述可水解连接子L的水解。
在一个高度优选的实施方式中，本发明涉及其在治疗人类受试者中的用途。在一个高度优选的实施方式中，本发明涉及其在治疗人类受试者糖尿病中的用途。在一个高度优选的实施方式中，本发明涉及其在制备用于治疗人受试者糖尿病的药物中的用途。
实施例
实施例1举例说明了示例性可水解连接子(L)分子的合成。
实施例2举例说明了形成连接子(L)的方法，所述连接子(L)具有准备用于接枝肽(P)和抑制剂(I)的手柄。
实施例3举例说明了与抑制剂(I)连接的连接子的合成。在该实施例中，抑制剂或失活剂复合物(I)是C18脂肪酸，其本身不抑制肽的活性(参见实施例4)，但已知其在体内与白蛋白结合。因此，最终通过抑制剂结合并将缀合物聚集到白蛋白实现体内失活。
实施例4举例说明了与失活剂(I)缀合而没有可水解连接子的参比肽激素的合成。显示的实例是LysB29Nε-十八烷酰基人胰岛素。
实施例5举例说明了根据本发明的胰岛素缀合物的合成。
实施例6分析了实施例1的示例性可水解连接子(L)分子1-19在体外水解并随后结合葡萄糖的能力。
实施例7评估了三种不同连接子(连接子1、14和15)在各种葡萄糖浓度下的反应速率，即它们水解和与葡萄糖反应形成连接子葡萄糖化合物的能力。
实施例8评估在葡萄糖存在下与胰岛素连接的连接子(实施例5的缀合物2)的水解性。
实施例9评估人胰岛素的胰岛素B受体，实施例5的胰岛素缀合物1和2(不具有抑制剂(I)的缀合物1，具有抑制剂(I)的缀合物2)和来自实施例4的与抑制剂(I)缀合而没有连接子的参考胰岛素的体外效力。
实施例10评估与实施例4的C18脂肪酸缀合的人胰岛素及其与白蛋白相互作用并降低胰岛素活性的能力，其通过在瘦大鼠中scITT测量。
实施例1：可水解连接子分子-腙的合成
一般程序：
将酰肼(1当量)溶解在甲醇中，向其中加入醛(1当量)和催化量的乙酸。将混合物加热至回流。通过TLC(薄层色谱)跟踪反应。真空除去溶剂，得到粗产物，为油状物或固体。适于每种分子的个体纯化条件如下。
连接子1.((E)-N'-(3-(苄氧基)亚丙基(propylidene))-4-甲氧基苯甲酰肼)
酰肼：4-甲氧基苯甲酰肼(CAS号：3290-99-1)
醛：3-苄氧基丙醛(CAS号：19790-60-4)
纯化方法：
通过柱色谱，0-3％甲醇/二氯甲烷进行纯化。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.35(s,1H,NH),7.84(d,J＝8.8Hz,2H,C2'H,C6'H),7.78(m,1H,CHN),7.37-7.25(m,5H,Ph),7.02(d,J＝8.8Hz,2H,C3'H,C5'H),4.50(s,2H,PhCH2O),3.82(s,3H,OCH3),3.65(t,J＝6.3Hz,2H,OCH2),2.55(q,J＝6.0Hz,2H,CH2CHN)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ162.2(C4'OCH3),161.82(CO),149.27(CHN),138.34(C1),129.37(C2',C6'),128.22(C3,C5),127.9(C2,C6),127.39(C4),125.49(C1'),113.57(C3',C5'),71.85(Ar-CH2O),66.97(OCH2),55.34(OCH3),32.67(CH2CHN)。
HRMS(ESI)：m/z：C18H21N2O3计算值313.1552[M+H]+；测量值313.1548。
连接子2.((E)-N'-(3-(苄氧基)亚丙基)苯甲酰肼)
酰肼：苯甲酰肼(CAS号：613-94-5)
醛：3-苄氧基丙醛(CAS号：19790-60-4)
纯化方法：
通过柱色谱，0.5-1％甲醇/二氯甲烷进行纯化。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.49(s,1H,NH),7.85(d,J＝7.1Hz,2H,C2'H,C6'H)7.80(t,J＝5.9Hz,1H,CHN),7.56(d,J＝7.1Hz,2H,C3'H,C5'H),7.5(m,1H,C4'H),7.37-7.25(m,5H,C2-6H),4.50(s,2H,Ar-CH2O),3.66(t,J＝6.1Hz,2H,OCH2),2.55(m,2H,CH2CHN)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ162.75(CO),150.0(CHN),138.33(C1),133.51(C4'),128.35(C3,C5),128.22(C3',C5'),127.47(C2,C6,C2',C6'),127.40(C4),126.36(C1'),71.84(Ar-CH2O),66.91(OCH2),32.69(CH2CHN)。HRMS(ESI)：m/z：C17H19N2O2计算值283.1447[M+H]+；测量值283.1439。
连接子3.((E)-N'-(3-(苄氧基)亚丙基)-1-羟基-2-萘酰肼)
酰肼：1-羟基-2-萘酰肼(CAS号：7732-44-7)
醛：3-苄氧基丙醛(CAS号：19790-60-4)
纯化方法：
通过柱色谱，0-5％甲醇/二氯甲烷进行纯化。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ14.20(Cl'-OH),11.79(s,1H,NH),8.30(m,1H,C5'H)7.98-7.87(m,3H,C8'H,C4'H,CHN),7.71-7.54(m,2H,C6'H,C7'H),7.48-7.18(m,6H,C3'H,C2-6H),4.53(s,2H,Ar-CH2O),3.70(t,J＝6.3Hz,2H,OCH2),2.67-2.58(m,2H,CH2CHN)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ166.86(CO),160.20(Cl'-OH),153.1(CHN),138.32(C1),135.85(C9'),129.09(C7'),128.22(C3,C5),127.96(C8'),127.49(C2,C6),127.41(C4),126.56(C1O'),126.36(C6'),125.9(C2'),124.61(C5'),122.94(C4'),117.68(C3'),71.90(Ar-CH2O),66.79(OCH2),32.79(CH2CHN)。ESI:m/z：C21H21N2O3计算值349.1552[M+H]+；测量值349.0。
连接子4.((E)-N'-(2,4,6-三羟基亚苄基)苯甲酰肼)
酰肼：苯甲酰肼(CAS号：613-94-5)
醛：2,4,6-三羟基苯甲醛(CAS号：487-70-7)
纯化方法：
除去溶剂后，将生成的固体用冷甲醇洗涤，得到棕色至橙色粉末状产物。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.93(s,1H,NH),11.14(s,2H,C2-OH,C6-OH),9.85(s,1H,C4-OH),8.87(s,1H,CHN),8.05-7.95(m,2H,C2'H,C6'H),7.70-7.50(m,3H,C3'H,C4'H,C5'H),5.91(s,2H,C3H,C5H)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ162.09(C4),161.52(CO),159.67(C2,C6),146.80(CHN),132.87(C4'),131.70(C1'),128.45(C3',C5'),127.45(C2',C6'),99.03(C1),94.34(C3,C5)。HRMS(ESI):m/z：C14H13N2O4计算值:272.0875[M+H]+；测量值273.0867。
连接子5.((E)-N'-(2-羟基亚苄基)-4-硝基苯甲酰肼)
酰肼：4-硝基苯甲酰肼(CAS号：636-97-5)
醛：水杨醛(CAS号：90-02-8)
纯化方法：
在回流期间形成白色沉淀，过滤粗沉淀物并用冷甲醇洗涤，得到产物，为浅黄色粉末。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.35(s,1H,NH),11.10(s,1H,C2-OH),8.69(s,1H,CHN),8.40(dt,2H,J＝8.9,2.0Hz,2H,C3H,C5H),8.18(dt,2H,J＝8.9,2.7Hz,C2H,C6H),7.60(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H,C6H),7.32(ddd,J＝7.5,1.8Hz,1H,C4H),6.95(d,J＝7.7Hz,1H,C3H),6.94-6.90(m,1H,C5H)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ161.18(CO),157.46(C2-OH),149.36(C4'-NO2),148.93(CHN),138.53(C1'),131.68(C4),129.23(C2',C6'),129.16(C6),123.67(C3',C5'),119.39(C5),118.66(C1),116.41(C3)。HRMS(ESI)：m/z：C14H11N3O4Na计算值308.0647[M+Na]+；测量值308.0639。
连接子6.((E)-4-甲氧基-N'-(2-硝基亚苄基)苯甲酰肼)
酰肼：4-甲氧基苯甲酰肼(CAS号：3290-99-1)
醛：2-硝基苯甲醛(CAS号：552-89-6)
纯化方法：
将反应混合物冷却至室温后，沉淀出淡黄色针状物。过滤沉淀物并用冷甲醇洗涤，得到所需产物。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.07(s,1H,NH),8.86(s,1H,CHN),8.13(d,J＝7.4Hz,C6H),8.08(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H,C3H),7.94(d,J＝8.9Hz,2H,C2'H,C6'H),7.82(t,J＝7.4Hz,1H,C5H),7.72-7.62(m,1H,C4H),7.08(d,J＝8.9Hz,2H,C3'H,C5'H),3.85(s,3H,CH3)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ162.56(CO),161.71(C4'-OCH3)148.19(C2-N02),142.04(CHN),133.64(C5),130.49(C4),129.71(C2',C6'),128.79(C1),127.83(C6),124.98(C1'),124.59(C3),113.71(C3',C5'),55.43(CH3)。HRMS(ESI):m/z：C15H14N3O4计算值300.0984[M+H]+；测量值300.0975。
连接子7.((E)-2,4-二羟基-N'-(2-硝基亚苄基)苯甲酰肼)
酰肼：2,4-二羟基苯甲酰肼(CAS号：13221-86-8)
醛：2-硝基苯甲醛(CAS号：552-89-6)
纯化方法：
回流过程中形成黄色沉淀。过滤反应混合物并用冷甲醇洗涤，得到产物，为浅黄色粉末。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.25(s,1H,NH),12.01(s,1H,C6'-OH),10.27(s,1H,C4'-OH),8.84(s,1H,CHN),8.13(d,J＝7.5Hz,C5H),8.09(dd,J＝8.3,1.1Hz,1H,C3H),7.87-7.78(m,2H,C4H,C2'H),7.69(ddd,J＝7.2,1,5Hz,1H,C4H),6.38(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),6.33(d,J＝2.4Hz,1H)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ165.89(CO),162.94(C4'-OH),162.47(C6'-OH),148.23(C2-NO2),142.89(CHN),133.69(C5),130.68(C2'),128.59(C6),127.96(C1),124.63(C3),108.68(C1'),107.48(C3'),102.84(C5')。HRMS(ESI)：m/z：C14H12N3O5计算值：302.0777[M+H]+；测量值302.0767。
连接子8.((E)-N'-(3-(苄氧基)-2-甲基亚丙基)-4-甲氧基苯甲酰肼)
酰肼：4-甲氧基苯甲酰肼(CAS号：3290-99-1)
醛：(R，S)-3-苄氧基-2-甲基丙醛(CAS号：73814-73-0)
纯化方法：
真空除去溶剂后，形成透明油状物。将产物缓慢(过夜)以白色针状物从油中沉淀出来，用庚烷洗涤，得到所需产物。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.33(s,1H,NH),7.85(d,2H,J＝8.9Hz,C2'H,C6'H),7.75(d,1H,J＝4.9Hz,CHN),7.37-7.28(m,5H,Ph),7.02(d,2H,J＝8.8Hz,C3'H,C5'H),4.5(s,2H,CH2O),3.52,3.49(dd,2H,J＝9.1Hz,OCH2CH),2.77-2.68(m,1H,CH2CHCH3),1.09(d,J＝6.9Hz,CH3)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ161.78(CO,C4'),153.25(CHN),138.37(C1),129.35(C2',C6'),128.22(C3,C5),127.41(C2,C6),127.38(C4),125.56(C1'),113.57(C3',C5'),72.60(OCH2CH),72.05(PhCH2O),55.34(OCH3),36.82(CH2CHCH3),14.51(CH3)。HRMS(ESI)：m/z：C19H23N2O3计算值327.1709[M+H]+；测量值327.1705。
连接子9.((E)-N'-(3-(苄氧基)-2-甲基亚丙基)-2,4-二羟基苯甲酰肼)
酰肼：2,4-二羟基苯甲酰肼(CAS号：13221-86-8)
醛：(R，S)-3-苄氧基-2-甲基丙醛(CAS号：73814-73-0)
纯化方法：
柱层析，40-60％乙酸乙酯/庚烷。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H,NH),11.3(s,1H,C2-OH),10.2(s,1H,C4-OH),7.76-7.70(m,2H,CHN,C6H),7.38-7.25(m,5H,Ph'),6.32(dd,1H,J＝8.7Hz,J＝2.4Hz,C5H)6.27(d,1H,J＝2.4Hz,C3H),4.51(s,2H Ar'CH2),3.5(dd,2H,J＝9.3Hz,OCH2CH),2.78-2.68(m,1H,CH2CHCH3),1.09(d,3H,J＝6.9Hz,CH3)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ162.52(CO),162.5(C4'-OH,C2'-OH),154.38(CHN),138.34(C1),129.31(C6'),128.22(C2,C6),127.43(C3,C5),129.39(C4),107.16(C5'),105.81(C1'),102.79(C3'),72.49(OCH2),72.06(PhCH2O),36.85(CH2CHCH3),14.40(CH3)。HRMS(ESI)：m/z：C18H20N2O4计算值329.1501[M+H]+；测量值329.14988。
连接子10.((E)-N'-(3-(苄氧基)亚丙基)-2,4-二羟基苯甲酰肼)
酰肼：2,4-二羟基苯甲酰肼(CAS号：13221-86-8)
醛：3-苄氧基丙醛(CAS号：19790-60-4)
纯化方法：
柱层析，1-3％甲醇/二氯甲烷。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.42(s,1H,C2-OH),11.4(s,1H,NH),10.17(s,1H,C4-OH),7.78-7.70(m,2H,CHN,C6H),7.40-7.20(m,5H,Ph'),6.32(dd,1H,J＝9Hz,J＝3Hz,C5H),6.28(d,1H,J＝3Hz,C3H),4.50(s,2H Ar'CH2O),3.66(t,2H,J＝6Hz,OCH2CH),2.51(m,1H,CH2CHCHN)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ165.3(CO),162.5(C4'-OH,C2'-OH),150.6(CHN),138.3(C1),128.17(C4),128.22(C2,C6),128.0(C6'),127.5(C3,C5),107.16(C5'),105.8(C1'),102.80(C3'),71.9(PhCH2O),66.8(OCH2),32.9(CH2CHCHN)。
连接子11.((E)-N'-(3-(苄氧基)亚丙基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰肼)
酰肼：4-(二甲氨基)苯甲酰肼(CAS号：19353-92-5)
醛：3-苄氧基丙醛(CAS号：19790-60-4)
纯化方法：
柱层析，1-3％甲醇/二氯甲烷。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H,NH),7.76(d,2H,J＝9Hz,C2H,C6H),7.75(t,J＝5.5Hz,1H,CHN),7.36-7.27(m,5H,Ph'),6.72(d,2H,J＝9Hz,C3H,C5H),4.51(s,2HAr'CH2O),3.65(t,2H,J＝6Hz,OCH2CH),2.98(s,6H,N(CH3)2),2.55(q,2H,J＝5.5Hz,CH2CHCHN)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ162.6(CO),152.3(C4'N(CH3)2),148.0(CHN),138.4(C1),128.9(C4),128.2(C2,C6,C2',C6'),127.5(C3,C5),119.6(C1'),110.7(C3',C5'),71.9(PhCH2O),67.1(OCH2),42.1(N(CH3)2),32.7(CH2CHCH3)。HRMS(ESI)：m/z：C19H24N3O2计算值326.18685[M+H]+；测量值326.1867。
连接子12.((E)-N'-(2-(苄氧基)亚乙基(ethylidene))-2,4-二羟基苯甲酰肼)
酰肼：2,4-二羟基苯甲酰肼(CAS号：13221-86-8)
醛：苄氧基乙醛(CAS号：60656-87-3)
纯化方法：
柱层析，30-80％乙酸乙酯/庚烷
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.25(s,1H,C2-OH),11.5(s,1H,NH),10.2(s,1H,C4-OH),7.81(t,1H,J＝5Hz,CHN),7.74(d,1H,J＝8.7Hz,C6H),7.39-7.27(m,5H,Ph),6.35(dd,1H,J＝8.7Hz,J＝2.4Hz,C5H)6.30(d,1H,J＝2.4Hz,C3H),4.55(s,2H Ar'CH2O),4.18(d,2H,J＝5Hz,OCH2CHN)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ165.8(CO),162.7(C2'-OH),162.3(C4'-OH),148.4(CHN),137.9(C1),129.6(C4),128.3(C6'),128.1(C3,C5),127.7(C2,C6),107.3(C5'),105.9(C1'),102.8(C3'),71.8(PhCH2O),69.1(OCH2CHN)。HRMS(ESI)：m/z：C16H16N2O4Na计算值323.10078[M+Na]+；测量值323.10075。
连接子13.((E)-N'-(2-(苄氧基)亚乙基)-4-(二甲基氨基)苯甲酰肼)
酰肼：4-(二甲氨基)苯甲酰肼(CAS号：19353-92-5)
醛：苄氧基乙醛(CAS号：60656-87-3)
纯化方法：
在冷却反应混合物期间，所需产物以白色粉末沉淀。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.3(s,1H,NH),7.76(d,1H,J＝9Hz,C2H,C6H),7.75(m,1H,CHN),7.38-7.27(m,5H,Ph),6.72(d,1H,J＝9Hz,C3H,C5H),4.54(s,2H Ar'CH2O),4.16(d,2H,J＝5Hz,OCH2CHN),2.98(s,6H,N(CH3)2)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ164.7(CO),152.4(C4'-N(CH3)2),148.4(CHN),138.0(C1),129.2(C4),128.3(C6),128.1(C3,C5),127.6(C2,C6),127.5(C2',C6'),119.3(C1'),110.8(C3',C5'),71.7(PhCH2O),69.2(OCH2CHN),39.6(N(CH3)2)。HRMS(ESI)：m/z：C18H22N3O2计算值312.1712[M+H]+；测量值312.1798。
连接子14.((E)-N'-(2-(苄氧基)亚乙基)-4-甲氧基苯甲酰肼)
酰肼：4-甲氧基苯甲酰肼(CAS号：3290-99-1)
醛：苄氧基乙醛(CAS号：60656-87-3)
纯化方法：
通过柱色谱，0-2％甲醇/二氯甲烷进行纯化。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H,NH),7.86(d,J＝8.7Hz,2H,C2'H,C6'H),7.81(m,1H,CHN),7.39-7.25(m,5H,Ph),7.04(d,J＝8.7Hz,2H,C3'H,C5'H),4.54(s,2H,PhCH2O),4.17(d,2H,J＝5.1Hz,OCH3CHN),3.84(s,3H,OCH3)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ168.1(C4'OCH3),161.9(CO),147.6(CHN),138.0(C1),129.5(C4),128.3(C2',C6'),128.2(C3,C5),127.6(C2,C6),120.7(C1'),115.6,113.6(C3',C5'),71.7(PhCH2O),66.1(OCH2CHN),55.4(OCH3)。HRMS(ESI)：m/z：C17H19N2O3计算值299.1396[M+H]+；测量值299.1404。
连接子15.((E)-N'-(2-(苄氧基)亚乙基)-2-羟基-4-甲氧基苯甲酰肼)
酰肼：2-羟基-4-甲氧基苯甲酰肼(CAS号：41697-08-9)
醛：苄氧基乙醛(CAS号：60656-87-3)
纯化方法：
通过柱色谱，0-0.2％甲醇/二氯甲烷进行纯化。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.39(s,1H,C2-OH),11.6(s,1H,NH),7.83(d,1H,J＝9Hz,C6'H),7.83(m,1H,CHN),7.38-7.27(m,5H,Ph),6.53(dd,1H,J＝9Hz,J＝2.4Hz,C5'H)6.48(d,1H,J＝2.4Hz,C3'H),4.55(s,2H Ph'CH2O),4.19(d,2H,J＝5.1,OCH2CHN),3.77(s,3H,OCH3)。
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ165.5(CO),163.9(C4'-OCH3),162.3(C2'-OH),148.7(CHN),137.9(C1),129.4(C6'),128.3(C6'),127.7(C2,C6),127.6(C3,C5),107.1(C1'),106.3(C3'),101.3(C5'),71.8(PhCH2O),69.0(OCH2CHN),55.4(OCH3)。HRMS(ESI)：m/z：C17H18N2O4计算值315.1345[M+H]+；测量值315.1346。
连接子16.((E)-4-甲氧基-N'-(亚苄基)苯甲酰肼)
酰肼：4-甲氧基苯甲酰肼(CAS号：3290-99-1)
醛：苯甲醛(CAS号：100-52-7)
根据Taha等，Molecules,2014,19(1),1286-1301进行合成。
连接子17.((E)-2,4-二羟基-N'-(亚苄基)苯甲酰肼)
酰肼：2,4-二羟基苯甲酰肼(CAS号：13221-86-8)
醛：苯甲醛(CAS号：100-52-7)
根据B.Camber和D.D.Dziewiatkowski，JACS,1951,73(8),4021-4021进行合成。
连接子18.((E)-4-氨基-N'-(亚苄基)苯甲酰肼)
酰肼：4-氨基苯甲酰肼(CAS号：5351-17-7)
醛：苯甲醛(CAS号：100-52-7)
根据Adeniyi等人，Pakistan J.Sci.Industrial Res.,2006,49(4),246-250进行合成。
连接子19.((E)-4-二甲氨基-N'-(亚苄基)苯甲酰肼)
酰肼：4-(二甲氨基)苯甲酰肼(CAS号：19353-92-5)
醛：苯甲醛(CAS号：100-52-7)
根据Wen等人，Chem.Commun.,2006,106-108进行合成。
实施例2：连接子(L)20的合成方法，其具有制备用于接枝肽(P)和抑制剂(I)的手
柄
中间体化合物22的合成
将3-羟基-4-甲氧基苯甲酸甲酯(21)(0.956g，5.19mmol)溶解在二甲基甲酰胺(10mL)中。加入K2CO3(碳酸钾)(1.44g，10.4mmol)和溴乙酸甲酯(1.45mL，5.71mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌24小时。将残余物过滤并浓缩，重新溶解在乙酸乙酯中，用1M NaOH(氢氧化钠)、盐水洗涤，并用MgSO4(硫酸镁)干燥。通过硅胶色谱(己烷:乙酸乙酯3:1)进行纯化，得到化合物22(1.61g，4.88mmol，94％)。MS(ESI)：m/z C18H18O6[M+H]+计算值331.11；测量值331.57。
中间体化合物23的合成
将化合物22(0.983g，2.98mmol)溶于四氢呋喃/甲醇/水1:1:1(9mL)中。加入2MNaOH(1.5mL)并将反应在室温下搅拌30分钟。通过加入1M HCl(氯化氢)使反应呈酸性，浓缩并重新溶解在乙酸乙酯中。将有机相用水、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。产物化合物23(0.914g，2.89mmol，97％)无需进一步纯化即可用于下一反应。MS(ESI)：m/z C11H12O6[M+Na]+计算值339.06；测量值339.36.
中间体化合物24的合成
将化合物23(60mg，0.189mmol)溶解在二氯甲烷中并冷却至0℃。加入草酰氯(51μL，0.378mmol)，将反应在0℃下搅拌1小时并在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂，将残余物重新溶解在二氯甲烷中。加入肼基甲酸叔丁酯(NH2NHBoc)(50mg，0.378mmol)和Et3N(三乙胺)(53μL，0.378mmol)，并将反应在室温下搅拌4小时。蒸发并通过硅胶色谱(己烷/乙酸乙酯1:1)纯化，得到化合物24(50mg，0.116mmol，61％)。
中间体化合物25的合成
将化合物24(25mg，0.058mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中。加入TFA(三氟乙酸)(200μL)，并将反应在室温下搅拌2小时。蒸发得到化合物25，将其不经进一步纯化用于下一步反应。
中间体化合物27的合成
将2-[4-(羟甲基)苯氧基]乙基氨基甲酸苄酯(化合物26，根据ChemBioChem,2005,6,2271-2280中描述的方法合成)溶解在二甲基甲酰胺中，滴加到0℃配备有N2-气氛的NaH(氢化钠)的二甲基甲酰胺溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌，然后滴加2-(2-溴乙基)-1,3-二氧戊环并在室温下再搅拌4小时。加入水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取。将有机相用Na2SO4(硫酸钠)干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱(0-100％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化，得到化合物27。
化合物20的合成
将化合物25和化合物27溶解在甲醇中。加入乙酸，并将反应在室温下搅拌24小时。通过MS(ESI)检测产物20：m/z C37H39N3O9[M+H]+计算值670.27；测量值671.32。
实施例3：连接子和失活剂复合物的合成
中间体化合物29的合成
将3-羟基-4-甲氧基苯甲酸苄酯(28)(0.70g，2.71mmol)溶解在二甲基甲酰胺(10mL)中。加入K2CO3(0.75g，5.42mmol)和溴乙酸甲酯(0.26mL，2.71mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌24小时。将残留物过滤并浓缩，重新溶解在乙酸乙酯中并用1M NaOH、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱(己烷/乙酸乙酯3:1)纯化，得到化合物29(0.72g，2.18mmol，80％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.77(dd,1H,ArH),7.52(d,1H,ARH),7.33-7.44(m,5H,ArH),6.92(d,1H,ArH),5.33(s,2H,OCH2Ar),4.73(s,2H,OCH2C＝O),3.94(s,3H,OCH3),3.79(s,3H,O＝C-OCH3)；MS(ESI)：m/z C18H18O6[M+H]+计算值331.11；测量值331.46；
中间体化合物30的合成
将化合物29(121mg，0.366mmol)溶解在甲醇(5mL)中并用N2-气体冲洗。加入10％Pd/C(10％wt，4mg，0.037mmol)，然后分批加入NaBH4(硼氢化钠)(21mg，0.549mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并通过硅藻土过滤。通过加入1M HCl使滤液呈酸性，浓缩并重新溶解在乙酸乙酯中。将有机相用水、盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并蒸发。产物化合物30(85mg，0.354mmol，97％)无需进一步纯化即可用于下一反应。MS(ESI)：m/z C11H13O6[M+H]+计算值241.06；测量值241.42。
中间体化合物31的合成
将化合物30(106mg，0.442mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中并冷却至0℃。加入草酰氯(118μL，1.33mmol)，将反应在0℃下搅拌1小时并在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂，将残留物重新溶解在二氯甲烷(5mL)中。加入NH2NHBoc(117mg，0.884mmol)和Et3N(123μL，0.884mmol)，并将反应在室温下搅拌4小时。蒸发溶剂并通过硅胶色谱(己烷/乙酸乙酯1:1)进行纯化，得到化合物31(101mg，0.286mmol，65％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.43(dd,1H,ArH),7.33(d,1H,ArH),6.83(d,1H,ArH),4.71(s,2H,CH2C＝O),3.91(s,3H,OCH3),3.80(s,3H,CH3OC＝O),1.49(s,9H,CH3C)；MS(ESI)：m/z C16H23N2O7[M+H]+计算值355.14；测量值355.46.
中间体化合物32的合成
将化合物31(170mg，0.480mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中。加入TFA(200μL)，并将反应在室温下搅拌2小时。蒸发溶剂，得到化合物32(112mg，0.439mmol，91％)。粗品化合物无需进一步纯化即可用于下一反应。MS(ESI)：m/z C11H15N2O5[M+H]+计算值255.09；测量值255.49。
中间体化合物33的合成
将2-溴-乙醇胺·HBr(944mg，4.6mmol)和二氯甲烷(5mL)混合，加入Et3N(0.5mL，6.9mmol)，得到浆液混合物。将1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基氧基]吡咯烷-2,5-二酮(1g，3.9mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中并加入到混合物中，其立即溶解沉淀物。将反应在室温下搅拌5小时，然后用水淬灭并用二氯甲烷(×3)萃取。将有机相用Na2SO4干燥，过滤并真空除去溶剂。通过硅胶色谱(0-50％乙酸乙酯的己烷溶液)进行纯化，得到化合物33(849mg，0.317mmol，82％)。
1H-NMR(300MHz,CDC):δ5.03(bs,1H,NH),4.13(t,2H,CH2O),3.53(t,2H,NHCH2),3.42(t,2H,CH2Br),0.96(t,2H,(CH3)3SiCH2),0.0(s,9H,(CH3)3Si))。
中间体化合物34的合成
将4-羟基苄醇(248mg，2mmol)溶解在无水二甲基甲酰胺(9.5mL)中，并加入Cs2CO3(碳酸铯)(651mg，2mmol)。将混合物加热至75℃并搅拌3小时。将化合物33(536mg，2mmol)溶解在无水二甲基甲酰胺(0.5mL)中，滴加到红/棕色悬浮液中。4小时后，将混合物冷却至室温并搅拌过夜。随后，将反应用水淬灭并用乙酸乙酯(×3)萃取。将合并的有机相用饱和NaHCO3(碳酸氢钠)溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱(0-100％乙酸乙酯的己烷溶液)进行纯化，得到化合物34(285mg，0.917mmol，46％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ7.25(d,2H,J＝9Hz,C2H,C6H),6.83(d,2H,J＝9Hz,C3H,C5H),5.1(bs,1H,NH),4.58(s,2H,PhCH2O),4.13(t,2H,J＝8.5Hz,CH2OCO),3.99(t,2H,J＝5.2Hz,CH2O),3.53(q,2H,J＝5.2Hz,NHCH2),1.88(bs,1H,OH),0.95(t,2H,J＝8.5Hz,SiCH2),0.0(s,9H,(CH3)3Si)。
13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ158.2(CO),157.0(C1),138.8(C4),128.8(C2,C6),114.6(C3,C5),67.2(CH2O),65.0(CH2O),63.3(CH2O),40.5(NHCH2),17.9(SiCH2),-1.4((CH3)3Si)。
中间体化合物35的合成
将NaH(140mg，5.8mmol)加入冷无水四氢呋喃(20mL，在N2下，0℃)。将化合物34(908mg，2.9mmol)溶于无水四氢呋喃(0.5mL)中，并经15分钟逐滴加入。将混合物在室温下搅拌45分钟。然后，经10分钟逐滴加入3-溴丙醛乙烯缩醛。将混合物在室温下搅拌48小时，然后过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱(0-60％乙酸乙酯的己烷溶液)进行纯化，得到化合物35(188mg，0.457mmol，16％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ7.21(d,2H,J＝8.7Hz,C3H,C5H),6.83(d,2H,J＝8.7Hz,C2H,C6H),5.03(bs,1H,NH),4.94(dq,1H,CH),4.41(s,2H,PhCH2O),4.11(t,2H,J＝8.4Hz,CH2OCO),3.97(t,2H,J＝5.1Hz,CH2O),3.95-3.79(m,4H,OCH2CH2O),3.56(t,2H,J＝6.6Hz,OCH2CH2CH),3.59-3.53(m,2H,NHCH2),1.94(dq,2H,CH2CH2CH),0.95(t,2H,J＝8.2Hz,SiCH2),0.0(s,9H,(CH3)3Si)。
13C-NMR(75MHz,CDCl3):δ191.7,172.7,133.5,130.7,116.2,115.5,104.0,102.2,74.2,68.8,68.6,67.2,66.1,61.9,42.9,35.8,24.1,22.5,19.3,15.7,0.0((CH3)3Si)。
中间体化合物36的合成
将化合物35(200mg，0.48mmol)溶解在甲醇(1.5mL)中，并加入乙酸(50μL)。将反应混合物在50℃下搅拌1小时30分钟。将化合物32溶解在甲醇(1mL)中并加入混合物中。溶液立即变黄，30分钟后形成沉淀。过滤悬浮液，用甲醇(0.5mL)洗涤白色粉末，得到化合物36(230mg，0.381mmol，80％)。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ11.52(s,1H,NNHCO),8.39(s,1H,CHN),7.65(d,2H,J＝8.5Hz,C2H,C6H),7.60(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.5Hz,C4'H),7.35(d,1H,J＝2.0Hz,C6'H),7.21(bt,1H,NH),7.12(d,1H,J＝8.5Hz,C3'H),7.0(d,2H J＝8.5Hz,C3H,C5H),4.85(s,2H,PhCH2O),4.08-4.01(m,6H,CH2CH2OCO,CH2OPh,OCH2CH2),3.86(s,3H,PhOCH3,OCH2COO)3.8(m,2H,CH2CH2CHN),3.69(s,3H,COOCH3),3.36(q,2H,J＝5.7Hz,NHCH2CH2O),0.92(m,2H,SiCH2),0.0(s,9H,(CH3)3Si)。
13C-NMR(75MHz,DMSO-d6):δ168.9(CO),163.0(CO)159.9,156.4,154.5,151.9,147.2(CHN),146.5,128.6(C2,C6),127.0,125.5,121.9(C4'),114.8(C3,C5),112.7(C6'),111.5(C3'),66.5(CH2OPh),66.3(CH2O),65.4(PhCH2O),61.6(CH2O),57.8,55.8(OCH3),54.8(OCH2CO),51.8(COOCH3),39.5(NHCH2),17.3(SiCH2),-1.8((CH3)3Si)。
中间体化合物37的合成
将化合物36(100mg，0.05mmol)溶解在四氢呋喃中，加入TBAF(四丁基氟化铵)(0.2mL，1M的四氢呋喃溶液，0.2mmol)。将混合物加热至60℃，保持20小时，然后冷却至室温。将硬脂酸(20mg，0.07mmol)溶于四氢呋喃(1mL)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(15μL，0.086mmol)中。加入TSTU(O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基铀四氟硼酸盐)(28mg，0.09mmol)并将混合物在室温下搅拌30分钟。将活化的脂肪酸加入到反应混合物中并在室温下搅拌48小时。通过用己烷萃取除去过量的活化脂肪酸，并将残留物真空浓缩。MS(ESI)：m/z C41H63N3O8[M+H]+计算值725.46；测量值725.84。
中间体化合物38的合成
根据Pham等人，J.Med.Chem,2007,50(15),3561-3572合成了4-乙酰氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯。
将4-乙酰氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(0.201g，0.90mmol)和一水合肼(0.440mL，9.0mmol)溶解在乙醇中并回流26小时。将反应混合物冷却至室温，过滤沉淀物，并干燥，得到化合物38(0.157g，0.70mmol，78％)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.14(s,1H),9.08(s,1H),7.71(d,1H,J＝8.5Hz),7.48(d,1H,J＝1.3Hz),7.18(dd,1H,J＝1.8Hz,J＝8.5Hz),3.84(s,3H),2.06(s,3H)。
中间体化合物39的合成
根据Karlsson等人，Org.Process.Res.Dev.2012,16,586-594合成了2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸甲酯。
将甲醇(10mL)加入到化合物38(82mg，0.367mmol)中，温和地加热混合物直至化合物完全溶解。加入2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸甲酯(65mg，0.334mmol)，将反应混合物回流1小时。冷却反应混合物后，将形成的沉淀物过滤并干燥，得到化合物39，为白色固体(130mg，0.325mmol，89％)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ11.17(s,1H),10.21(s,1H),8.31(s,1H),7.66(t,3H),7.53(d,1H,J＝1.4Hz),7.22(dd,1H,J＝8.5Hz,J＝1.6Hz),7.01(d,2H),4.86(s,2H),3.88(s,3H),3.71(s,3H),2.07(2,3H)。MS(ESI):m/z C20H21N3O6计算值400.14[M+H]+；测量值400.04.
中间体化合物40的合成
将化合物39(50mg，0.124mmol)溶于四氢呋喃/甲醇/水2/1/1(8mL)中。加入NaOH(5M，100μL)并将反应在室温下搅拌30分钟。蒸发溶剂并加入四氢呋喃(10mL)。通过离心来分离所形成的沉淀物并干燥，得到化合物40(45mg，0.110mmol，88％)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.13(s,1H),7.52(d,2H,1H,J＝8.9Hz),7.22(d,1H,J＝8.8Hz),7.13(s,1H),6.82(d,1H,J＝8.5Hz),6.77(d,2H,J＝8.8Hz),4.12(s,2H),3.61(s,3H),1.85(s,3H).MS(ESI)：m/z C19H19N3O6计算值386.15[M+H]+；测量值386.12。
中间体化合物41的合成
将草酰氯(0.9mL，10.5mmol)加入到硬脂酸(1.0g，3.52mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中。在室温下搅拌悬浮液1小时后，将原料溶解并完成反应。蒸发溶剂，将活化的酸重新溶解在二氯甲烷(10mL)中，然后加入4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(0.76g，4.22mmol)。在室温下搅拌反应过夜。蒸发后，通过硅胶色谱(二氯甲烷/甲醇25:1)纯化粗产物，得到化合物41(1.33g，2.97mmol，84％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.80(d,J＝8.5Hz,1H),7.70(s,1H),6.78(dd,J＝8.5Hz,J＝2.0Hz,1H),3.91(s,3H),3.86(s,3H),2.37(m,2H),1.72(m,2H),1.25(m,28H),0.88(m,3H)。
中间体化合物42的合成
将一水合肼(0.16mL，3.35mmol)加入到化合物41(0.15g，0.335mmol)的乙醇(10mL)溶液中。将反应混合物回流过夜，然后冷却至室温。沉淀产物，过滤分离并干燥，得到化合物42(0.122g，0.273mmol，81％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.89(s,1H),8.12(d,J＝8.5Hz,1H),7.91(s,1H),7.42(s,1H),6.74(dd,J＝8.5Hz,J＝1.8Hz,1H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),1.77-1.67(m,2H),1.24(s,28H),0.87(t,J＝6.4Hz,3H)。
中间体化合物43的合成
通过将混合物加热至60℃，将化合物42(35mg，0.078mmol)溶解在乙酸乙酯(10mL)中。加入2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸甲酯(14mg，0.071mmol)，然后加入乙酸(3滴)，并将反应物回流30分钟。蒸发溶剂并通过硅胶色谱(二氯甲烷/甲醇，梯度为50:1至25:1)纯化残留物，得到化合物43(31mg，0.050mmol，64％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ11.15(s,1H),10.13(s,1H),8.32(s,1H),7.70-7.58(m,4H),7.22(dd,J＝8.5Hz,J＝1.6Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,2H),4.86(s,2H),3.88(s,3H),3.71(s,3H),2.33(t,J＝7.2Hz,2H),1.60-1.56(m,2H),1.23(s,28H),0.85(t,J＝6.5Hz,3H)。
将化合物43(10.5mg，0.017mmol)溶解在四氢呋喃(1mL)中。加入甲醇(1mL)，接着加入水(1mL)，溶液变为乳状。加入NaOH(5M，100μL)并将反应搅拌30分钟。将形成的沉淀物过滤并干燥，得到化合物44(9.0mg，0.0148mmol，89％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ11.07,(s,1H),10.12(s,1H),8.29(m,2H),7.69(d,J＝8.4Ηz,1Η),7.56(m,3H),7.21(dd,J＝8.4Hz,J＝1.7Hz,1H),6.83(d,J＝8.9Hz,1H),4.09(s,2H),3.89(s,3H),2.32(t,J＝7.3Hz,2H),1.66-1.55(m,2H),1.24(s,28H),0.85(t,J＝6.4Hz,3H)。
实施例4：LysB29Nε-十八烷酰基人胰岛素(通过不可水解的结合与失活剂偶联的参
比胰岛素)的合成
将DIPEA(41μL，0.23mmol)和TSTU(30.5mg，0.10mmol)加入到搅拌的十八烷酸(22mg，0.078mmol)的THF(6mL)溶液中。通过TLC监测反应，并在3小时后观察到完全转化为活性酯。将人胰岛素(100mg，0.0178mmol)溶于3mL 0.1M Na2CO3中，并用0.1M NaOH将pH调节至10.5。在温和搅拌下逐滴加入活性酯，并在加入期间将pH调节至10.5。通过LC-MS跟踪反应，15分钟后观察到产物转化率为58％。将pH降至4-5，加入水并将混合物冻干。通过反相HPLC(C4柱，水/乙腈/0.1％TFA)纯化粗品白色粉末，并通过UPLC-MS(C18柱，乙腈/水/甲酸)定量。
MS(ESI)C275H417N65O78S6计算值6074.10[M+H]+,2025.71[M+3H]3+,1519.53[M+4H]4+,1215.83[M+5H]5+,1013.36[M+6H]5+；测量值2025.79,1519.54,1216.00,1013.51。
实施例5：根据本发明的胰岛素缀合物(缀合物2)的合成
一般程序：
将二甲基甲酰胺(0.5mL)和15-冠(crown)-5(10当量)加入到化合物40或44(1mg)中并搅拌1小时直至原料溶解。加入TSTU(1.3当量)的二甲基甲酰胺(0.1mL)溶液，在室温下搅拌反应10分钟，然后滴加到温和搅拌的含有Et3N(100当量)的人胰岛素(2当量)的DMSO溶液中。10分钟后，通过LC-MS分析反应混合物，证实胰岛素缀合物的形成。加入乙腈(0.5mL)和水(0.5mL)并通过加入乙酸将pH调节至7.5。通过RP-Flash色谱(Isolera OneTM，Biotage)在10g C4柱上，使用水、0.1％甲酸至乙腈0.1％甲酸的梯度进行纯化。使用NH3水溶液将各级分的pH调节至约7.5。合并纯的级分，蒸发乙腈并通过NH3水溶液将pH调节至8，然后冷冻干燥，得到胰岛素缀合物，其为白色粉末。
胰岛素缀合物1
MS(ESI):m/z C276H400N68O82S6计算值6175.99[M+H]+,1544.76[M+4H]4+,1236.01[M+5H]5+,1030.17[M+6H]5+；测量值1544.92,1235.86,1030.11。
胰岛素缀合物2
MS(ESI):m/z C292H432N68O82S6计算值6399.42[M+H]+,1600.86[M+4H]4+,1280.89[M+5H]5+,1067.58[M+6H]5+；测量值1601.03,1281.10,1067.67。
实施例6：体外葡萄糖感测评估(LC-MS)
该实施例的目的是评估每个连接子对葡萄糖的反应性。
一般方案：
将1-1.5mg连接子溶解在100μL DMSO中。在溶剂化后立即将5μL加入到含有1000当量葡萄糖的995μL磷酸盐缓冲液(pH 7)中。将混合物加热至37℃并通过LC-MS持续分析。
| 连接子 | 观察到连接子-葡萄糖(h) |
| 1 | 8.5 |
| 2 | 96小时后ND |
| 4 | 96小时后ND |
| 5 | 96小时后ND |
| 6 | 96小时后ND |
| 7 | 96小时后ND |
| 8 | 72 |
| 9 | 24 |
| 10 | 20 |
| 11 | 20 |
| 12 | 15 |
| 13 | 15 |
| 14 | 17 |
| 15 | 5 |
| 16 | 48 |
| 17 | 48 |
| 18 | 96小时后ND |
| 19 | 48 |
结果和讨论：
从实施例2可以看出，连接子分子的以下结构-葡萄糖反应关系似乎是合理的：
由以下通式开始
R1组分是柔性的，但是与腙相间隔烷烃链的芳环似乎对连接子-葡萄糖结合的速率是重要的。烷基链也可以是烷烃醚。R2组分应优选为芳环，在邻位和/或对位具有供体基团。
在实施例6中具有最高葡萄糖结合速率的连接子是连接子15，其在5小时内形成连接子-葡萄糖。
实施例7：在不同葡萄糖浓度下的体外葡萄糖感测
该实施例的目的是评估三种不同连接子在不同葡萄糖浓度下的反应速率，即它们水解葡萄糖并与葡萄糖反应形成连接子葡萄糖缀合物的能力。
程序1：
将1.4mg连接子1((E)-N'-(3-(苄氧基)亚丙基)-4-甲氧基苯甲酰肼)溶于100μLDMSO中。将10μL DMSO储备溶液加入到含有1000或5000当量葡萄糖的990μL 1xPBS缓冲液(pH 7.4)中，得到终浓度为0.42mM的连接子1。将溶液加热至37℃并通过UPLC-MS(C18柱，乙腈/水/甲酸)在0至48小时的不同时间点进行分析。分析连接子-葡萄糖化合物的反应完全转化的百分比。
表1：连接子1(％连接子-葡萄糖)
| 时间(h) | 1000当量葡萄糖 | 5000当量葡萄糖 |
| 0 | 0 | 0 |
| 0.75 | n.d. | 3 |
| 1 | n.d. | 6 |
| 1.25 | n.d. | 7 |
| 1.5 | 3 | 10 |
| 1.75 | n.d. | 10 |
| 2 | 3 | 14 |
| 2.5 | n.d. | 18 |
| 3 | 5 | n.d. |
| 3.17 | 4 | n.d. |
| 3.5 | 4 | n.d. |
| 3.75 | 4 | n.d. |
| 4 | 5 | n.d. |
| 4.5 | 6 | n.d. |
| 4.75 | 6 | n.d. |
| 5 | 6 | n.d. |
| 5.5 | 6 | n.d. |
| 6 | 9 | n.d. |
| 7 | 9 | 49 |
| 24 | 29 | n.d. |
| 48 | 70 | n.d. |
程序2：
1.3mg和1.4mg连接子14((E)-N'-(2-(苄氧基)亚乙基)-4-甲氧基苯甲酰肼)和连接子15((E)-N'-(2-(苄氧基)亚乙基)-2-羟基-4-甲氧基苯甲酰肼)分别溶解在100μL DMSO中。将10μL每种储备溶液加入到含有1000、5000或10,000当量葡萄糖的990μL 1×PBS缓冲液(pH 7.4)中，得到最终连接子浓度为0.42mM。将溶液加热至37℃并通过UPLC-MS(C18柱，乙腈/水/甲酸)在0至72小时的不同时间点进行分析。分析连接子-葡萄糖化合物的反应完全转化的百分比。
表2：连接子14(％连接子-葡萄糖)
| 时间(h) | 1000当量葡萄糖 | 5000当量葡萄糖 | 10,000当量葡萄糖 |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | n.d. | n.d. | 3 |
| 24 | 7 | 16 | 39 |
| 54 | 11 | 30 | 62 |
| 72 | 17 | 50 | 87 |
表3：连接子15(％连接子-葡萄糖)
| 时间(h) | 1000当量葡萄糖 | 5000当量葡萄糖 | 10,000当量葡萄糖 |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 | n.d. | 2 | 9 |
| 2 | 1 | 6 | 15 |
| 4 | 3 | 12 | 33 |
| 6 | 5 | 21 | 44 |
| 24 | 21 | 68 | 89 |
| 48 | 35 | 98 | 99 |
结果和讨论：
在所有三个实施例中，反应速率，即形成的连接子葡萄糖缀合物的量与增加的葡萄糖浓度相关。
实施例8：胰岛素缀合物的体外葡萄糖感测评估
该实施例的目的是评估在葡萄糖存在下与胰岛素连接的连接子的水解性。
一般方案：
将1.0mg胰岛素缀合物溶解在100μL DMSO中。将10μL加入到含有50,000当量葡萄糖的490μL 1×PBS缓冲液(pH 7.4)中，得到32μM的终浓度。将样品在37℃温育并通过HPLC(C18柱，乙腈/水/甲酸)在1、24、48和72小时进行分析。
结果和讨论：
在不存在葡萄糖的情况下，胰岛素缀合物被水解，平衡稳定化并且在整个实验中保持相同。当存在葡萄糖时，动态平衡从胰岛素缀合物向具有水解连接子的胰岛素移动，这表明连接子的葡萄糖敏感性。
实施例9：体外胰岛素受体B(INSRb)功能测定
该实施例的目的是测试胰岛素B受体的体外效力。
一般方案：
使用PathHunter INSRb功能测定试剂盒(DiscoverX)，其具有含有0.1％BSA(牛血清白蛋白)的1×PBS缓冲液(pH 7.4)，而不是使用制造商的缓冲液。
| 化合物 | EC50(nM) |
| 人胰岛素 | 0.10 |
| 胰岛素缀合物1 | 0.11 |
| 胰岛素-C18 | 31 |
| 胰岛素缀合物2 | 8.2 |
结果和讨论：
胰岛素缀合物1(不含抑制剂的胰岛素)的效力与人胰岛素的效力相似。胰岛素缀合物2的效力比人胰岛素低100倍，胰岛素-C18的效力比人胰岛素的效力低300倍。
实施例10：瘦大鼠中胰岛素-C18的体内scITT
该实施例的目的是评估与C18脂肪酸缀合的人胰岛素及其与白蛋白相互作用并降低胰岛素活性的能力，其通过瘦大鼠的scITT测量。在载体、5U胰岛素-C18或0.5U人胰岛素(n＝4)的皮下施用前以及之后的五个时间点测量血糖浓度。
结果和讨论：
结果表明胰岛素-C18与白蛋白具有强烈的相互作用，从而在测量期间消除了胰岛素的作用。
Claims (15)
1.式P-L-I的缀合物，其中P是影响体内碳水化合物代谢的肽激素，L是由Lp和Li组成的可水解连接子分子，并且I是能够失活或抑制所述肽激素P对体内碳水化合物代谢的影响的分子，其特征在于
a.所述连接子分子L在体内能够水解，使得缀合物P-L-I和缀合物部分P-Lp和Li-I在体内以动态平衡存在，其中所述缀合物P-L-I以相对于缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一种摩尔过量而存在，并且其特征还在于
b.缀合物部分P-Lp和Li-I中的至少一个与葡萄糖共价结合，由此当体内葡萄糖浓度增加时，未与I结合的P浓度在体内增加，或者，其特征还在于葡萄糖促进所述可水解连接子L的水解。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中反应物P-Lp与葡萄糖共价结合。
3.如权利要求1或2所述的缀合物，其中P是胰岛素或胰岛素类似物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中I是能够抑制P的活性位点的试剂。
5.如权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中I是能够在体内聚集多个所述式P-L-I的缀合物的试剂。
6.如权利要求1-5中任一项所述的缀合物，其中I是能够结合血清白蛋白的试剂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其中I包含结构A，其中A选自
以及a至少为10。
8.如权利要求1-5中任一项所述的缀合物，其中L选自腙、O,O-缩醛、N,O-缩醛、N,N-缩醛、包括噻唑烷和噻唑啉的S,N-缩醛，或包括二硫戊环的S,S-缩醛，以及它们的衍生物。
9.如权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其中L具有通式
其中，
R1包括I或P，优选与芳族部分连接，以及
R2包括P或I。
10.如权利要求7所述的缀合物，其中L具有通式
其中，
R1包含与I或P连接的芳族部分，和
R3是一个或多个给电子基团，和
R4包含P或I。
11.如权利要求1-10中任一项所述的缀合物，其用于治疗或预防性治疗人或动物受试者。
12.如权利要求1-10中任一项所述的缀合物，其用于治疗人或动物受试者的糖尿病。
13.如权利要求1-10中任一项所述的缀合物，其用于治疗人或动物受试者的糖尿病，所述治疗包括以每天2次或更少次施用的频率施用所述缀合物。
14.如权利要求1-10中任一项所述的缀合物，其用于治疗人或动物受试者的糖尿病，所述治疗包括以每天1次或更少次施用的频率施用所述缀合物。
15.药用或兽医用组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的缀合物和至少一种药用或兽医用赋形剂。
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