CN110087643B - 通过激活线粒体生物发生的血小板生成刺激 - Google Patents

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Abstract

描述了一种使用刺激线粒体生物发生的药物刺激血小板形成的方法。该药物可用于治疗已被诊断为患有血小板减少症或血小板计数相对较低的受试者，或者可用于体外或间接体内刺激血小板生成。低照度光(LLL)疗法可与药物一起使用以刺激线粒体生物发生。

Description

通过激活线粒体生物发生的血小板生成刺激
继续申请数据
本申请要求于2016年6月27日提交的美国临时专利申请序列号62/355,027的权益，其全部内容以引用的方式结合于此。
背景技术
由于血液中异常低数量的血小板，血小板减少症是无法控制的出血和死亡的原因。迄今为止，该疾病主要通过血小板输注来控制，然而血小板输注与多种并发症相关并且仅限于具有危及生命的病症的患者。在过去的二十年中，在用于治疗血小板减少症的治疗剂的开发中取得了相当大的进展，并且几乎所有这些药剂都增加了造血干细胞(HSC)和/或祖细胞的生长和分化以用于独立于循环血小板的数量的巨核细胞生成。Hallam等人,Expert.Opin.Biol.Ther.13,1173-1185(2013)。高剂量的这些药剂引起有害的血栓形成，而低剂量则表现出适度或很弱的作用，这严重限制了它们的广泛临床应用。具有很小的血栓形成风险的有效形式仍然是处理血小板减少症的迫切和未满足的医疗需求。
血小板是小的无核细胞，并且由主要存在于成人的骨髓(BM)和新生儿的肝脏和BM中的巨核细胞(MK)产生。该细胞由HSC分化而来并且代表最大的细胞(50-100μm)并且也是在生理条件下仅由约0.05％的有核BM细胞组成的最稀有细胞之一，但是在患有血小板减少症的患者中细胞的数量呈指数增长。在MK成熟期间，在没有细胞分裂的情况下发生多轮DNA复制，这一过程称为核内有丝分裂，在该过程中其胞质得到广泛扩增并且基因组DNA在人体中扩增至64N或在小鼠中扩增至256N，同时合成丰富的细胞骨架蛋白、血小板特异性颗粒和内陷膜系统(IMS)。细胞扩增之后为前血小板形成，其中，末端成熟MK将其全部细胞质转变为许多长的、分支的前血小板，其以约1μm/min的速率增长以在几小时内达到250-500μm的长度。Patel等人，J.Clin.Invest 115，3348-3354(2005)。大量的细胞质重塑以及前血小板的剧烈突出和增长是由微管力驱动的并且严重依赖于ATP的产生，这意味着线粒体在该过程中起着核心作用。与此一致的是，MK线粒体的超微结构异常和功能不足通常与骨髓增生异常综合征(MDS)和免疫血小板减少症(ITP)患者中受损的血小板生成相关。线粒体细胞色素c中的点突变特异性地在人类中引起血小板形成失调和血小板减少症，这表明血小板生物发生对线粒体活性极其敏感。最近的研究还表明，线粒体功能不足易使小鼠在暴露于应激后对于血小板减少症缺乏立即的早期反应基因X-1(IEX-1)。Ramsey等人，Haematologica99，282-291(2014)。IEX-1的主要功能之一是增强在线粒体呼吸链上的ATP合酶活性，并且其无效突变会危害ATP的产生并以细胞类型特异性的方式增加线粒体中的活性氧(ROS)的产生。线粒体特异性抗氧化剂mitoquinone在IEX-1缺陷的小鼠中完全逆转血小板减少症的能力清楚地表明线粒体功能在血小板生成中至关重要。Ramsey等人，Platelets，26(5)：459-66(2015)。
发明内容
在一方面，本申请提供了一种通过对受试者施用有效量的刺激线粒体生物发生的药物刺激受试者中血小板形成的方法。在研究低照度光(LLL)介导的血小板生物发生的机制过程中，发明人发现LLL主要在巨核细胞中增强线粒体生物发生，从而导致血小板形成增加。巨核细胞中的线粒体质量和ATP生成与血小板形成的水平成比例相关。
已知许多线粒体生物发生促进药物。实例包括p38丝裂原活化蛋白激酶激活剂、钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV激活剂、AMP活化激酶激活剂、钙调神经磷酸酶A激活剂、过氧化物酶体增殖物反应元件激活剂和SIRT1激活剂。
在一些实施例中，用刺激线粒体生物发生的药物治疗的受试者已被诊断患有血小板减少症。在另一些实施例中，该方法包括向受试者施用抗血小板减少症药物。在另外的实施例中，该方法包括用低照度光(LLL)疗法治疗受试者。在更进一步的实施例中，该药物与药学上可接受的载体一起施用。
在另一个方面，本发明提供了一种刺激血小板形成的方法，包括使血小板前体与刺激线粒体生物发生的药物接触。在一些实施例中，血小板前体是巨核细胞(megakaryocyte)或原巨核细胞(megakaryoblast)。在另一些实施例中，血小板前体是体外的或间接体内(ex vivo)的。在其他的实施例中，血小板前体也暴露于低照度光治疗。
附图说明
图1A-1H提供了显示LLL促进MK成熟和血小板生成的图表和图像。(A)来自MK的间接体内血小板分化的时间线的示意图。从BM细胞分选CD41+FSChigh MK，用或不用LLL处理，并在MK培养基中培养。1小时后收集MK用于细胞ATP测量(B)，1天后收集MK用于研究前血小板形成(C-F)或3天后收集MK用于血小板计数(G)。(B)测量用不同能量密度的LLL处理的5x104 MK中的ATP。(C)在24小时分化之前和之后通过前向/侧向散射(FSC)的流式细胞术分析来分析CD41+MK的大小。(D)来自至少6个样品每组(每组中30个细胞)的MK的代表性透射电子显微照片。N，核；IMS，内陷膜系统。(E)LLL后24小时的PPF-MK的代表性图像。PPF-MK直径，小，<100μm；大，≥100μm。填充三角形代表前血小板轴(前血小板shaft)上的许多突起中的一个。未填充的三角形表示核。(F)数字表示每个样品分析的至少500个MK中的小或大PPF-MK的百分比，每组6个样品。###P<0.001，大PPF-MK，和**P<0.01，两组之间比较的总PPF-MK。(G)基于CD41表达和FSC，在LLL后第3天估计源自1x104 MK的血小板数。(H)分选的MK用或不用LLL处理，用CFSE标记，并以每只小鼠1x105个细胞输注到受体小鼠中。示出了在指定天数受体中所得的CFSE+血小板的百分比。所有数据均表示为平均值±SEM，B、C和G的n＝6，或H的n＝10；相比于对照，***P<0.001；比例尺，D中为5μm，或E中为25μm。
图2A-2H提供了显示LLL的血小板生成作用是ATP依赖性的图表和图像。(A)通过决定系数分析LLL后1小时的MK ATP水平与3天后测量的血小板之间的相关性。(B和C)通过5μg/ml抑制剂寡霉素A(OA)抑制LLL对血小板生成(B)和ATP合成(C)的影响。(D)WT和IEX-1KOBM细胞用抗CD41抗体和JC1染色。通过流式细胞术分析590nm处的红色J-聚集体荧光(redJ-aggregate fluorescence)来确定CD41+FSChigh MK的线粒体膜电位。(E)分选的MK用或不用LLL处理，并在如图1B的ATP测量前分化1小时。(F和G)PPF-MK的代表性图像在LLL后24小时从每组至少6个样品(每组25个细胞)获得(F)。比例尺，25μm。细胞直径在G中示出，其中，每个符号代表单个PPF-MK。(H)基于CD41表达和FSC(H)，在LLL后3天估计源自1×104MK的血小板数。所有数据代表平均值±SEM；n＝6，在指定组之间比较，**P<0.01和***P<0.001。
图3A-3L提供了显示LLL刺激多倍体MK中的线粒体生物发生的图表和图像。(A)在LLL后指定次数测量MK、BM细胞或LSK中的ATP。(B和F)在LLL后24小时，用MitoTracker染色指定的细胞并通过流式细胞术进行分析。(C)通过实时PCR测量MK的线粒体DNA含量并用核DNA归一化。(D，G和H)在LLL后4小时测量PGC-1α转录物(D和G)，并且在LLL后16小时通过qRT-PCR测量其他基因转录物(D和H)。(E至I)通过用Hoechst 33342和FITC-抗-CD41染色，基于DNA含量对MK进行分选(E)，用LLL或假光(sham light)处理，并在24小时后用MitoTracker进行流式细胞术分析(F)，或LLL后4小时进行PGC-1α转录物的RT-qPCR分析(G)，以及如上所述在LLL后16小时进行其他基因转录物(H)的分析。在LLL后3天估计源自1x104个MK的血小板数(I)。(J至L)在LLL后24小时的MK的代表性透射电子显微图在(J)中示出。比例尺，5μm。通过Image J软件从每组至少30个MK测量每个MK的线粒体数(K)以及每个线粒体与最近的核区域之间的最短距离(L)。所有其他数据来自三个独立的试验，每个试验重复三次并且表示为平均值±SEM，与非LLL的对照相比，*P<0.05和***P<0.001。
图4A-4D提供了显示LLL渗透到小鼠骨中的图表和图像。(A)使用激光功率计在小鼠新鲜皮肤和脊椎骨以下测量指定LLL模式的透射率(％)。(B)在30J/cm2的全身LLL照射后1小时，从指定的骨中分离BM细胞，以如图1B测定ATP水平。(C和D)在全身LLL照射后24小时，对小鼠静脉注射FITC-抗-CD41(绿色)和PE-抗-CD105(红色)抗体，并在15分钟后处死。随后，从小鼠中取出新鲜的股骨并通过共聚焦显微镜检查(C)。箭头表示BM MK。比例尺，50μm。PPF-MK的百分比由每个股骨至少50个MK和每组6个样品确定(D)。与对照比较或在指定组之间比较，*P<0.05，**P<0.01且***P<0.001；并且n＝6(A至C)。
图5A-5F提供了显示LLL缓解体内由IR诱导的血小板减少症的图表和图像。(A)IR后2周3-Gyγ-辐射的小鼠中的白血细胞(WBC)、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和红血细胞(RBC)的全血细胞计数。数据为平均值±SEM(n＝15)。(B)在指定天数获得在3-Gyγ-辐射的小鼠(IR)中的血小板计数，或者在IR后6小时获得用LLL处理一次的IR小鼠中的血小板计数(IR+1×LLL)，或在第0天和第1天一天一次(IR+2×LLL)，或从第0天到第3天一天一次(IR+4×LLL)。数据为平均值±SEM(n＝15)。与IR相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(C)在IR后2周检查每只小鼠的尾部出血时间，并由个体符号表示。(D)在IR后2周检查每只小鼠的血小板体积。数据均为平均值±SEM(n＝10)。(E)IR后2周从指定小鼠分离的血小板的代表性透射电子显微照片。比例尺，1mm。(F)在LLL后2周从非IR对照和IR+4×LLL小鼠分离的血小板用抗CD9或抗CD31抗体标记，混合，并用12-十四酸酯13-乙酸佛波醇酯(phorbol12-myristate 13-acetate)(100ng/ml)刺激。通过流式细胞术定量由双色事件指示的聚集血小板，并以平均百分比±SEM表示(n＝6)。P值通过双尾Student’s t检验(A)或单因素方差分析(one way ANOVA)(B至D)确定。
图6A-6D提供了显示LLL减轻小鼠中由抗CD41抗体或5-FU诱导的血小板减少症的图表。(A和B)在7天内每天给小鼠施用0.1mg/kg抗CD41抗体。从第3天至第7天每天给予LLL。(C和D)在第0天给小鼠注射50mg/kg的5-FU。在5-FU注射后4小时开始每天给予LLL连续3天。在LLL后6小时每天测量血小板计数(A和C)，并在第5天(B)或第4天(D)检查尾部出血时间(B和D)。n＝6；；ns，无显著性；在指定的组之间比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7A-7D提供了显示LLL显著提高人MK中血小板生产的图像和图表。(A)来自人CD34+细胞的间接体内血小板分化的时间线的图示。CD34+细胞分别在第6、12或15天主要分化为MK祖细胞、成熟MK和血小板。(B)如图1B测量在用不同能量密度的LLL处理的CD34+衍生的MK中的ATP。(C)在第0、6或12天使用Hoechst 33342染色对CD34+培养物进行倍性分析。(D)在CD34+细胞分化期间在第0、6或12天施用3J/cm2的LLL。在第15天通过流式细胞术定量血小板，并表示为衍生自1x 104个CD34+细胞的血小板的平均值±SEM。所有数据均从三个独立的试验获得，每个试验重复三次。与对照相比，*P<0.05和**P<0.01。
图8提供了显示药物诱导的PGC-1α介导的线粒体生物发生的方案。核呼吸因子(NRF-1和NRF-2)控制所有十个核编码的细胞色素氧化酶亚单位。ERR、雌激素相关受体α、β、γ；TCA、三羧酸循环；和FAO、脂肪酸氧化。
图9提供了显示通过线粒体药物(mito-drug)增加间接体内的血小板生成的图表。C.对照；Bez，苯扎贝特(Bezafibrate)(400μM)；Res，白藜芦醇(50μM)；SRT1720，0.1μM；Aicar，AICAR(500μM)；LLL，810nm 3J/cm2。小鼠MK在MK培养基中在指定药物存在下或在LLLT后分化3天。与对照相比，**，p<0.01和***，p<0.001。n＝6。
图10提供了显示体内通过线粒体药物的plt生成的增强的图表。所有小鼠用两个剂量的5-FU(FU)，连同指定的线粒体药物或LLLT连续处理4天(红色箭头)。在存在或不存在指定药物或LLLT的情况下，*，p<0.05，**，p<0.01和***，p<0.001。每组中n＝10。
图11提供了显示体内通过线粒体药物加LLLT对于血小板生成的增强的图。所有小鼠每天用抗CD41抗体以0.1mg/kg处理7天。小鼠用LLLT(980nm，0.025J/cm2，每天一次，连续4天(红色箭头))处理，用BEZ处理(100mg/kg，每天两次，持续4天)，或两者。与对照比较，***，p<0.001。每组中n＝10。
具体实施方式
本发明提供了一种使用刺激线粒体生物发生的药物刺激血小板形成的方法。该药物可用于治疗已被诊断患有血小板减少症或血小板计数相对较低的受试者，或者可用于在体外或间接体内刺激血小板生成。低照度光(LLL)疗法可与药物一起使用以刺激线粒体生物发生。
这里阐述的术语仅用于描述实施例，而不应被解释为对本发明的整体限制。除非另有说明，否则“一个”，“所述”，“该”和“至少一个”可互换使用。此外，如在本发明的描述和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”，“所述”和“该”包括它们的复数形式，除非由围绕它们的上下文排除。
在本文中，通过端点说明的数值范围包括该范围内包含的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
如本文所用，术语“受试者”可以指任何温血生物，包括但不限于人、大鼠、小鼠、狗、山羊、绵羊、马、猴、猿、猪、兔，牛等。当在受试者需要或要求本申请的组合物的上下文中使用该术语时，该术语可以被称为”需要其的受试者”并且包括已被临床诊断(例如通过医学专业人员，如医师)为需要本申请的组合物的受试者、被怀疑需要本申请的组合物的受试者、处于患有疾病或病症风险中并且可能受益于本申请的组合物的受试者以及已经患有疾病或病症并且可能受益于本申请的组合物的受试者。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在可靠的医学判断范围内，在没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症且与合理的利益/风险比相称的条件下，适合用于与人类和动物的组织接触的这些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“诊断”可以包括确定受试者将发展有疾病的可能性或在受试者中的疾病的存在或特质。如本文所用，术语诊断还包括确定疾病或疾病发作的严重性和可能结果或者恢复的前景(通常被称为预后)。
如本文所用，术语“治疗”等是指获得期望的药理学或生理学的作用。就疾病的部分或完全治愈或可归因于疾病的副作用而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，”治疗”包括哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并且可包括抑制疾病或症状，即，阻止其发展；和缓解疾病，即，引起疾病消退。
如本文所用，术语“预防”包括完全预防临床上明显的疾病(例如，出血)的发作或预防受试者中疾病的临床前明显阶段(例如，血小板减少症)的发作。预防性治疗在被确定为具有疾病发展高风险的受试者中是特别有用的。高风险表示受试者发展出诸如血小板减少症的疾病的风险高于平均水平。表明发展出血小板减少症的高风险的因素的例子包括维生素缺乏、白血病、败血症、肝功能衰竭，高血小板破坏率可能是由于免疫或非免疫疾病、用已知可诱导骨髓抑制的药物(如丙戊酸或甲氨蝶呤)的治疗、蛇咬伤、辐射、癌症患者中的放射治疗、化学治疗或化学/放射治疗以及莱姆病。
术语“治疗有效”旨在限定每种药剂的量，其将实现降低疾病严重程度并同时避免不良的副作用(例如通常与替代疗法相关的不良的副作用)的目标。治疗有效量可以是以一种或多种剂量给药。在该术语如在本文所用的含义内，治疗有效的治疗包括即使本身不改善疾病结果但是改善受试者生活质量的治疗。
“有效量”通常是指提供期望的局部或全身作用的量，例如，有效刺激血小板形成，包括实现本申请中描述的特定的期望的效果。例如，有效量是足以实现有益或期望的临床结果的量。
如本文所使用的，接触是指使两个物体物理相邻并且接触，或者将它们放置在将在合理的短时间范围内发生这种接触的环境中。例如，使细胞与刺激线粒体生物发生的药物接触包括将药物施用于受试者，使得药物将与位点(肺、骨髓、脾和肝)处的细胞相互作用以刺激血小板生成。然而，接触还包括全身给药，其通过循环介导的接触导致药物和血小板前体之间的接触。
除非另有说明，否则本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域常用的含义。本文提供的定义是为了便于理解本文中经常使用的某些术语，并不意味着限制本申请的范围。
刺激血小板生物发生
本发明提供了通过向受试者施用有效量的刺激线粒体生物发生的药物来刺激该受试者中血小板形成的方法。正常的人血小板计数范围为每微升血液150000至450000个血小板。在一些实施例中，受试者是由于具有少量血小板而需要治疗的受试者。例如，具有正常血小板水平的约5-15％、15-25％、25-35％、35-45％、45-55％、55-65％、65-75％、75-85％或85-95％的受试者可能需要治疗。具有正常血小板水平的40-95％的受试者通常不被认为患有血小板减少症，但仍可受益于血小板形成的刺激。通过将血液置于各种自动化的血液学分析仪中使用电阻抗或流式细胞术来测量血小板浓度(太小而无法计数)。
在一些实施例中，受试者已被诊断患有血小板减少症。血小板减少症是一种疾病，其中，受试者具有异常低量的血小板，例如具有每微升低于50000个血小板，或者低于特定人群的正常(平均或中值)血小板计数的2.5个百分点。血小板减少症通常没有症状，但患有血小板减少症的患者有时会出现诸如流鼻血或牙龈出血、瘀伤(紫癜)和疲劳等外部出血增加等症状。血小板减少症可以是遗传性的，或由于本领域技术人员已知的多种不同疾病(如脓毒症或狼疮)所引起。
本发明提供了一种刺激血小板形成的方法。血小板(也称为凝血细胞)是血液的一种成分，其功能(与凝血因子一起)是通过凝结和凝固受损的血管来止血。血小板没有细胞核并且是源自巨核细胞的细胞质的片段。在染色的血涂片上，血小板显示为深紫色斑点，约为红细胞直径的20％。血小板形成的刺激是指通过巨核细胞增加血小板形成的速率。刺激可以是指增加1-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、100-150％、150-200％或大于200％。
线粒体生物发生刺激药物
本发明的一个方面还包括施用有效量的刺激线粒体生物发生的药物。发明人已经确定线粒体在通过血小板前体(例如巨核细胞)的血小板形成中起到关键作用，因此刺激线粒体生物发生的药物可用于刺激血小板形成。如本文所用，术语”生物发生”是指生物物质的合成，而术语”线粒体生物发生”因此是指线粒体的合成。线粒体生物发生可以通过增加与线粒体生物发生相关的基因表达来证明，这些基因包括但不限于以下：PGC家族成员，如PGC-1α和PGC-1β、PPARδ、NRF-1、SIRT1、SIRT3、COX和AMPK；或者指增加的线粒体DNA的量或蛋白质含量、线粒体DNA相对于核DNA的更高的比例或线粒体功能的改善(比如线粒体酶活性增加或线粒体呼吸增加)。虽然线粒体生物发生刺激药物可以对线粒体生物发生具有普遍的刺激作用，但当涉及刺激血小板生物形成时，血小板前体(例如巨核细胞)中线粒体生物发生的刺激是特别重要的。
在一些实施例中，线粒体生物发生刺激药物是选自由p38丝裂原活化蛋白激酶激活剂、钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV激活剂、AMP活化激酶激活剂、钙调神经磷酸酶A激活剂、过氧化物酶体增殖物反应元件激活剂和SIRT1激活剂组成的组。这些激活剂都被证明可以刺激线粒体生物发生的增加。
在一些实施例中，线粒体生物发生刺激药物选自由已知的刺激线粒体生物发生的特定化合物组成的组。已知的刺激线粒体生物发生的化合物的例子包括白细胞介素15(美国专利公开2016/0354442)，丁酸羟甲酯(美国专利公开2016/0346238)、生物活性生物碱(美国专利公开2016/0184338)、释放铼基一氧化碳的化合物(美国专利公开2016/0243151)、麝香葡萄(muscadine)和白藜芦醇(美国专利公开2013/0184228)、羟基酪醇(美国专利公开2015/0030579)、姜黄素化合物(美国专利公开2015/0297536)、类黄酮化合物(美国专利公开号2014/0256741)和β2肾上腺素能受体激动剂(美国专利公开2014/0024677)。在其他实施例中，刺激线粒体生物发生的药物选自由苯扎贝特、罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazoe)、非诺贝特(fenofibrate)、AICAR、二甲双胍、白藜芦醇；SRT1720、SRT2183、SRT1460和槲皮素，及他们的衍生物组成的组。如本文所用，衍生物是指具有相同的基本化学骨架的化合物，例如特定芳族杂环化合物，其中，位于该骨架结构上的部分在不丧失化合物的活性的条件下可变化。小的变化包括同源变异，例如使用不同的卤素、用硫取代氧、通过单个甲基延伸烷基侧链等。
可以在动物模型中测试用于刺激线粒体生物发生的候选药物。通常，动物模型是用于研究血小板减少症或线粒体生物发生的动物模型。参见例如美国专利公开2005/0177887，其描述了可用作血小板减少症的动物模型的PTTG敲除啮齿动物。结果通常在用候选药剂治疗的对照动物和未接受治疗的对照同窝幼畜之间进行比较。例如，可以测试候选药剂对PGC-1α和PGC-1β、PPARδ、NRF-1、SIRT1、SIRT3、COX和AMPK的影响；或线粒体DNA的量或蛋白质含量，较高的线粒体DNA相对于核DNA的比例，所有这些都是线粒体生物发生的标志物。转基因动物模型也是可获得的，并且通常被接受作为人类疾病的模型(参见，例如Greenberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：3439-3443(1995))。候选试剂可以在这些动物模型中使用来确定候选试剂是否刺激线粒体生物发生。
与抗血小板减少症药物的组合
在一些实施例中，该方法还包括与刺激线粒体生物发生的药物组合向受试者施用第二抗血小板减少症药物。第二种抗血小板减少症药物是已知对治疗血小板减少症有用的药物。“抗血小板减少症药物”包括血小板生成素(TPO)，包括重组TPO和聚乙二醇化的人巨核细胞生长和发育因子(PEG-rhMGDF)，以及所谓的TPO模拟物，其作为TPO受体的激动剂而被设计用于有效地治疗TCP。TPO模拟物包括非肽分子和肽。例如，NplateTM(罗米司亭(romiplostim)，又名AMG 531)是最充分开发的TPO模拟物之一，并且是TPO受体结合肽和IgG1抗体的Fc结构域的融合蛋白。艾曲波帕(Eltrombopag)是示例性的非肽TPO模拟物。
在美国专利序列号7,160,870中描述了可用作抗血小板减少症药物的其他合适的TPO模拟物，例如，3’-{N’-[3-环丙基-1-(3,4-二甲基苯基)-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基]肼基}-2’-羟基联苯基-3-羧酸；[1-(4-氟-3-甲基苯基)-3-甲基-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2’-羟基联苯基-3-羧酸；3’-{N’-[3-甲基-5-氧-1-(4-三氟甲基苯基)-1,5-二氢吡唑-4-亚基]肼基}-2’-羟基联苯基-3-羧酸；3-{N’-[1-(3,4-二甲基苯基)-3-甲基-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基-]肼基}-2-羟基-3’-四唑-5-基联苯；3’-{N’-1-(3,4-二甲基苯基)-3-甲基-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基-肼基}-2’-羟基联苯基-3-羧酸；3’-{N’-[1-(3-氟-4-甲基苯基)-3-甲基-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基]肼基}-2’-羟基联苯基-3-羧酸；3’-{N’-[1-(3,4-二甲基苯基)-3-乙基-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2’-羟基联苯基-3-羧酸；和3-{N’-[1-(3,4-二甲基苯基)-3-乙基-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基-3’-四唑-5-基联苯，优选3’-{N’-[1-(3,4-二甲基苯基)-3-甲基-5-氧-1,5-二氢吡唑-4-亚基]肼基}-2’-羟基联苯基-3-羧酸，以及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯。
“组合”是指施用刺激线粒体生物发生的药物以及施用一定量的抗血小板减少症药物，使得存在累加效应或协同效应，如果在没有单独的、同时或相继地施用抗血小板减少症药物的情况下施用该线粒体生物发生刺激药物不会获得该累加效应或协同作用。抗血小板减少症药物的施用可以是连续的、相继的或偶发的。因此，如本文所用，组合不应限于包含本发明组合的单一制剂，而是对于包括以不同剂型施用本发明组合的活性剂的方案或治疗是开放的。
尽管药物的适宜剂量取决于给药途径、年龄、体重、性别或受试者的状况而变化，并且最终应由医生确定。在口服给药的情况下，每日剂量通常为每千克体重约0.01mg至约500mg之间，优选约0.01mg至约50mg之间，更优选约0.1mg至约10mg之间。在肠胃外给药的情况下，每日剂量通常可为每千克体重约0.001mg至约100mg之间，优选约0.001mg至约10mg之间，更优选约0.01mg至约1mg之间。每日剂量可以例如以每日1-4次个体给药的典型方案施用。给药剂量也可以通过使用目标血清浓度来测量。达到有效量的各种考虑因素描述于例如Goodman和Gilman所著：The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th ed.,Pergamon Press,1990；和Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1990。
药学上可接受的载体
在一些实施例中，刺激线粒体生物发生的药物与药学上可接受的载体一起施用。其他药物(如抗血小板减少症药物)也可与药学上可接受的载体一起施用。药学上可接受的载体包括一种或多种有助于施用药物或改善其药代动力学的额外成分。药学上可接受的载体中所包括的成分的例子包括药学上可接受的赋形剂和稀释剂。适宜的赋形剂和/或稀释剂是本领域熟知的，并且包括药用级的淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖(或其他糖)、碳酸镁、明胶油、醇、洗涤剂、乳化剂或水(优选是无菌的)。包含药学上可接受的载体的药物组合物还可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、增味剂、盐、缓冲剂、包覆剂或抗氧化剂。
药物组合物可以适于通过任何合适的途径施用，例如通过肠胃外、口服(包括口腔或舌下)、直肠或局部(包括口腔、舌下、皮内或透皮)的途径。此类组合物可通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体或赋形剂混合。
适于口服施用的药物组合物可以作为离散单元，例如胶囊或片剂；作为粉末或颗粒；作为溶液、糖浆或悬浮液(在水性或非水性液体中；或作为可食用的泡沫或条(whip)；或作为乳液)存在。用于片剂或硬明胶胶囊的合适的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。适用于软明胶胶囊的赋形剂包括例如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。为了制备溶液和糖浆，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。为了制备悬浮液，可使用油(例如植物油)来提供水包油或油包水的悬浮液。
适于局部施用的药物组合物可以配制成软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油。药物可以通过微针或微针阵列通过皮肤递送：药物负载的、药物嵌入的或药物涂覆的微针阵列(可溶解或不可溶解的微针阵列、空心微针或微针阵列)。其还可以通过胰岛素泵、导尿管、可穿戴式的注射泵和微递送技术进行递送(该药物不太可能通过皮肤局部应用递送，因为该药物在体内全身性地起作用并且需要较大量)。适合于直肠给药的药物组合物可以作为栓剂或灌肠剂。
适于肠胃外给药的药物组合物包括水性和非水性的无菌注射溶液，其可含有使制剂与预期接受者的血液基本上等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。可用于可注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以单位剂量或多剂量容器存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以以冻干的(lyophilized)状态储存，仅需要刚好在使用之前加入携带的无菌液体(例如注射用水)。即时的注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
低照度光疗法
在一些实施例中，该方法还包括用低照度光(LLL)疗法治疗受试者。如本文所用，术语“低照度光(LLL)”可以指一个过程，该过程涉及将细胞(例如，干细胞、其他类型的血小板前体细胞、血小板等)、组织和/或患者身体的至少一部分(例如，成人的血小板制造骨或婴儿的骨和肝脏)暴露于与其他形式的激光疗法(例如消融、切割、热凝固等)相比处于较低能量密度的低照度的红光和近红外(NIR)光。如本文所用，术语LLLT(“低照度光疗法”)可与LLL互换使用。
通常，低照度光(LLL)可以(以一个剂量或多个剂量)以与其他形式的激光疗法(例如消融、切割、热凝固等)相比处于较低能量密度施用于细胞(例如，干细胞、巨核细胞、其他血小板前体细胞、血小板等)、组织(例如骨髓和/或肝脏)、和/或患者身体的至少一部分。例如，LLL能量密度可以为0.001J/cm2至30J/cm2。作为另一个例子，LLL能量密度可以为0.001J/cm2至20J/cm2。在另一个例子中，LLL能量密度可以为0.1J/cm2至0.5J/cm2。LLL是一种简单、无创的、安全、方便且具有成本效益的方式，几十年来一直在临床上用于缓解疼痛和其他应用。在各种实施例中，本文使用的LLL可具有600nm至1500nm的波长、600nm至1100nm的波长或900nm至1000nm的波长。
虽然不希望受理论束缚，但据信LLL可用于增强体内和体外的血小板生物发生并延长血小板寿命，至少因为LLL可增强细胞和/或血小板内的ATP合成。发明人已经证明线粒体是LLL的初始效应发生的位点。参见Zhang等人，Sci Transl Med.，8(349)，349ra101(2016)和本文实施例I。LLL可以在线粒体呼吸链(MRC)中激发几种蛋白质复合物(例如I、III和/或IV)。通常，MRC可以在细胞中产生超过90％的ATP，但是在应激下的细胞中ATP合成的水平会降低，因此通过LLL，细胞内ATP的量可增加。在一些情况下，LLL可导致(额外地或替代性地增加ATP合成)增强的氧化磷酸化、提高的线粒体膜电位、降低的氧化应激和抗凋亡。
刺激血小板形成的方法
本发明的另一方面提供了一种刺激血小板形成的方法，该方法包括使血小板前体与刺激线粒体生物发生的药物接触。可以通过该方法可在体内、体外和间接体内刺激血小板形成。在一些实施例中，血小板前体也暴露于低照度光处理。刺激线粒体生物发生的药物可以是本文所述的任何药物。
“前体细胞”是一种细胞，该细胞已经失去了其大部分的多潜能性而变成单潜能的、部分分化的细胞。本文使用的“单潜能细胞”是指仅分化成一种细胞类型的祖细胞。“血小板前体”可以指任何有助于血小板生物发生的细胞。这些细胞通常发现于骨髓和/或肝脏中。血小板前体的实例包括造血干细胞、前巨核细胞、原巨核细胞、巨核细胞等。
在一些实施例中，血小板前体是巨核细胞或原巨核细胞。巨核细胞是具有分叶状核的负责产生血小板的大骨髓细胞。巨核细胞比通常的红细胞大10至15倍，平均直径为50-100μm。在其成熟过程中，巨核细胞的尺寸增加，并在称为核内有丝分裂(endomitosis)的过程中复制其DNA而不发生胞质分裂(cytokinesis)。细胞增大之后是前血小板形成，其中，末端成熟MK将其全部细胞质转化为许多长的分支的前血小板，其以约1μm/min的速率增长从而在几小时内达到250-500μm的长度。这种细胞质重塑和前血小板的剧烈突出和增长是由微管力驱动的，并且严重依赖于通过线粒体的ATP生成。促血小板生成素在诱导巨核细胞形成前血小板中起作用。
以下实施例仅用于说明的目的，并不意图限制所附权利要求书的范围。
实施例
实施例1：用于血小板减少症的无创低照度激光疗法
包括我们在内的许多研究者已经表明，具有相对较低的能量密度的特殊近红外激光(称为低照度激光(LLL)或冷激光)可以激活线粒体呼吸链中的细胞色素c氧化酶并改善线粒体功能。Yu等人，Photochem.Photobiol.66，866-871(1997)；Zhang等人，J.Cereb.Blood Flow Metab 34，1391-1401(2014)。LLL似乎能够直接提高线粒体膜电位，刺激ATP合成，并调节细胞ROS和Ca2+水平。Dong等人，J.Cereb.Blood Flow Metab.，35(9)，1435-44(2015)。LLL还可以减轻氧化应激，防止细胞凋亡，减少炎症，促进细胞增殖和分化。AlGhamdi等人，Lasers Med.Sci.27，237-249(2012)。光照射调节其他信号转导路径，其次是在各种应激条件下更有效的线粒体功能。Song等人，J.Neuroinflammation，9，219(2012)。LLL对创伤性脑损伤的有益作用已在许多临床前研究中得到证实。Zhang等人，J.Cereb.Blood Flow Metab，34，1391-1401(2014)。然而，LLL对血小板生成的影响是完全未知的。
目前的研究表明，无创全身LLL照射增加血小板生成并完全治愈或极大地改善小鼠中由γ-辐射、ITP或5-氟尿嘧啶(5-FU)引起的血小板减少症。尽管LLL在MK、HSC和BM细胞中瞬时增加ATP生成，但LLL主要靶向MK并且特异性地在多倍体MK中但不在二倍体细胞中促进线粒体生物发生。该发现有望使LLL成为治疗血小板减少症的预防和治疗方式。
结果
LLL加速了血小板形成并增加了MK的血小板生成
为了探究LLL对血小板生物发生的可能的影响，我们基于CD41+和高前向散射(FSChigh)从小鼠BM细胞中分选成熟MK，并将它们暴露于810nm二极管激光经过不同的持续时间(图1A)。然后将分选的MK在含有100ng/ml血小板生成素(TPO)的无血清扩增培养基(以下称为MK培养基)中培养1小时，然后进行ATP测量(图1B)。能量密度范围为1至10J/cm2的LLL显着增强MK中的ATP合成，最显着的效果为3-5J/cm2(图1B)。因此，除非另有说明，否则选择3J/cm2的激光用于随后的间接体内的研究。我们首先用LLL或假光处理已分选的MK并在MK培养基中培养24小时，然后通过基于CD41+细胞的FSC进行5000个MK的大小的流式细胞术分析，该分析表明，与假处理的MK中仅37％的大小增加相比，在LLL处理的MK中显示出平均60％的增加(p<0.001，图1C)。接下来通过透射电子显微镜证实了LLL介导的MK增大(图1D)。在培养24小时后，在LLL存在下，MK的主直径增加了76％，而在类似条件下在LLL不存在的情况下仅增加了39％(p<0.001，图1D，下右)。
除了细胞增大以外，LLL处理的MK在培养24小时后已经在整个细胞质中产生IMS(图1D，下中)，而这种膜系统在对照MK中形成很少，这表明LLL加速了MK成熟。IMS是前血小板的膜储库(membrane reservoir)并且是每个MK37产生的血小板数量的关键决定因素之一。据此，LLL处理的MK产生的血小板数量是对照MK的两倍(p<0.001，图1G)，这是由于形成大的前血小板的MK(PPF-MK)的比例增加(图1F)。在相差显微术下在24小时培养中跟踪PPF-MK，在此期间MK将它们的细胞质转化为以多个突起修饰的许多前血小板，所述多个突起形成不同大小的“开花”状的形态(图1E)。在没有LLL的情况下，约23.5％的CD41+FSChigh MK形成细胞直径≥100μm的大PPF-MK。引人注目的是，在存在LLL的情况下，大PPF-MK的百分比增加至42.7％，其表明与假处理相比增加了超过80％(图1F)。为了概括在体内的这一发现，分选了成熟的MK，用LLL或假光处理，用活体荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，并静脉输注到受体小鼠38中。在输注到受体后的第2天至第5天，LLL处理的MK产生比对照对应物更高水平的血小板(p<0.001，图1H)。
线粒体ATP生成在血小板形成中的关键作用
我们的进一步研究反应了在LLL后1小时测量的MK ATP水平与3天后测量的血小板计数之间的高度统计相关性，其具有决定系数R2＝0.9441(P<0.001)(图2A)。通过在MK培养基中包含5μg/ml的寡霉素A(Oligomycin A(OA))，LLL介导的血小板生成增强被严重减弱(图2B)。寡霉素A特异性地抑制线粒体F1F0-ATP合酶并减少细胞中的ATP合成(图2C)。ATP在血小板形成中的重要性也与缺乏IEX-139的小鼠在应激时不可逆的血小板减少症的发展相一致。与野生型(WT)对照相比，IEX-1敲除(KO)MK具有降低的线粒体膜电位(Δψm，图2D)和减少的ATP生成(p<0.01，图2E)。来自KO MK的前血小板分化受到严重阻碍，从而形成复杂度较低的网络的较少和较短的前血小板分支(图2F，中间图)。与24小时分化培养物中的WT MK相比，KO MK的平均大小减少了一半(p<0.001，图2G)，证实了线粒体活性在前血小板形成中的关键作用。用LLL对KO MK进行处理使ATP水平升高了89％(p<0.001，图2E)。值得注意的是，单一剂量的LLL处理基本上恢复了KO MK的前血小板形成，导致在LLL后24小时几乎正常的PPF-MK形态(图2F，右图)。KO PPF-MK的平均直径仅为67.0±17.8μm，但在LLL处理后增加至97.6±31.3μm，代表细胞增大46％(P<0.01)，尽管它们仍小于WT PPF-MK(图2G)。与3天培养物中的假处理相比，LLL介导的KO PPF-MK增大转化为产生的血小板数量的2倍增加(图2H)。这些数据佐证了线粒体活性是血小板生成的决定因素。
LLL促进MK中的线粒体生物发生
我们接下来探寻了MK的短暂(3分20秒)的LLL处理如何影响几天后的血小板分化。我们首先测量了ATP生成并观察到LLL仅短暂地提高了MK中的ATP生成，在60分钟达到顶峰并在90分钟内恢复到基础水平(图3A)。这种瞬时和稳健的ATP生成也在LLL处理后的BM有核细胞(BM)、造血干细胞和祖细胞(Lin-Sca1+cKit+细胞或LSK)中得到了证实(图3A)。但是，令我们惊讶的是，LLL促进的线粒体生物发生在MK中发生但不在LSK或BM中发生，如与对照相比在LLL后24小时仅MK中的线粒体含量加倍所示(图3B)。通过MitoTracker染色(图3B)以及线粒体DNA相对于核DNA的相对比例(图3C)对线粒体质量进行定量。LLL介导的线粒体生物发生进一步在分子水平上得到证实。在这方面，过氧化物酶体增殖物激活的受体-γ共激活因子1α(PGC-1α)是线粒体生物发生和呼吸功能的主调节基因。Greene等人，PhysiolRep.3(7).pii:e12470(2015)。该基因的表达在LLL后4小时强烈增强(图3D)，在此之后与线粒体生物发生相关的其他基因也在细胞中显着上调(图3D)。这些基因包括线粒体转录因子A(Tfam)、线粒体裂变相关基因发动蛋白相关蛋白(Drp1)、线粒体裂变1蛋白(Fis1)和线粒体裂变因子(Mff)。PGC-1α表达在BM细胞和LSK中相当低，并且也通过LLL处理得到升高，证实了如前所述的LLL在不同细胞类型中刺激PGC-1α表达的能力。Nguyen等人，Mitochondrion.14，42-48(2014)。但是，与MK相反，PGC-1α43下游的Tfam、Drp1、Fis1和Mff基因在平行测量的BM和LSK中均未上调，类似于Nguyen等人的描述，可能是由于细胞的二倍体不同于MK的多倍体。
为了确定MK多倍体在LLL介导的线粒体生物发生中的关键作用，我们在用活体荧光染料Hoechst 33342染色后基于DNA含量从BM细胞中分选了CD41+MK(图3E)。Baccini等人，Blood 98，3274-3282(2001)。如图3F和3G所示，具有≥8N DNA的MK对LLL的响应比2N/4NMK强得多，表现为在类似条件下相对于2N/4N MK，多倍体MK中线粒体生物发生和PGC-1α表达的显着增加(图3F)。与二倍体细胞相似，2N/4N细胞的成分含有84％的2N MK和16％的4NMK(平均＝2.3N)，而≥8N细胞的成分含有67％的8N MK，28％的16N MK和5％的32N MK(平均＝11.4N)，被认为是多倍体MK。LLL的DNA拷贝数依赖性效应在下游基因Tfam、Drp1、Fis1和Mff的表达中更为显著，这些下游基因在多倍体MK中增加100-200％，但在二倍体MK中仅增加0～20％(图3H)。据此，与假光相比，LLL使多倍体MK中的血小板生成增加200％，而在二倍体MK中仅增加29％(图3I)。这些结果解释了LLL可有效地提高多倍体MK中而非二倍体细胞中的线粒体生物发生。
如图3J和3K所示，在多核MK中观察到线粒体质量的增加，其中，在IMS完全发育之前仅在多核细胞中对线粒体进行计数。有趣的是，除了线粒体数量增加外，LLL治疗还改变了细胞中的线粒体分布。线粒体更均匀地分布于整个细胞(图3J，右)，而假处理的MK中的线粒体主要集中在核周区域(图3J，左)。对单个线粒体到最近的细胞核的距离的测量显示，LLL处理的MK中的16％的线粒体位于距离该细胞核>4μm处，而在对照MK中这些远离细胞核的线粒体仅为4％(P<0.05，图3L)。LLL刺激的ATP生成可以促进线粒体的更快移动，并且任意两个线粒体之间的距离增加可以发出刺激线粒体裂变的线粒体需求信号，以满足MK增大期间特定细胞区域的能量需求。线粒体生物发生可保证对MK增大和每个血小板的充足的能量供应，以通过遗传获得一些线粒体。
LLL快速治愈由γ-辐射诱导的血小板减少症。
为了探索LLL的治疗潜力，我们首先确定了可以充分穿透小鼠皮肤、肌肉和骨层的激光剂量，以3J/cm2到达BM。在几种被测试的激光中，包括660nm连续波激光，810nm 10Hz、100Hz脉冲激光和810nm连续波激光，后者显示出最有效的透射率，透射到BM中的激光功率为9.0±0.6％(图4A)。因此，选择以100mW/cm2或以30J/cm2的注量的810nm连续波激光进行全身照射5分钟，使得小鼠BM细胞能够获得约3J/cm2的能量密度，相当于间接体内培养中使用的激光能量(图1)。在全身LLL照射后1小时，从椎骨、股骨、胫骨和骨盆分离的BM细胞中增加的ATP生成证实了激光穿透(图4B)。随后通过共聚焦显微镜在股骨中证实了LLL对体内MK分化的影响，其中，血管和MK分别用PE-抗-CD105和FITC-抗-CD41抗体染色(图4C)。在LLL后24小时，在整个BM上可以看到大的“开花”状的MK，可能是PPF-MK(图4C，右图)，而在对照小鼠的BM中几乎没有发现这种“开花”状的细胞(图4C，左图)。定量地，在LLL处理的股骨中约36％的MK形成PPF-MK，而在对照股骨中仅有19％的MK形成PPF-MK(p<0.01，图4D)。
上述研究表明LLL主要靶向MK，并因此应该对具有大量MK的受试者(例如患有血小板减少症的受试者)具有更大的影响，因为该病症引发补偿性巨核细胞生成。因此，我们通过3-Gyγ-辐射(IR)诱导血小板减少症(Ramsey等人，Haematologica 99，282-291(2014))，随后使用以下三种方案如上定义地每天用全身LLL照射处理小鼠5分钟：(1)IR后6小时处理一次(IR+1xLLL)；(2)IR后6和24小时处理两次(IR+2xLLL)；(3)从第0天开始连续4天处理4次(IR+4xLLL)。每周检查全血细胞计数，并与接受假光的γ-辐射的小鼠进行比较。在整个试验期间，在存在或不存在LLL的情况下，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞或红细胞的计数没有显着变化。但是，在小鼠中，以激光剂量依赖性方式，血小板恢复快得多(图5A)。与5周的假处理小鼠(IR)相比，早在IR后2周(IR+4xLLL)或3周(IR+2xLLL)血小板计数达到IR前的水平或更高的水平。在IR后2周检查时，与血小板计数上升一致的是小鼠尾部出血时间的归一化(图5B)以及小鼠中的平均血小板体积。
当IR后2周检查时，与血小板计数上升一致的是尾部出血时间的归一化(图5C)以及小鼠中的平均血小板体积(图5D)。在4×LLL处理的小鼠中产生的血小板与含有相当水平的颗粒、线粒体和开放性小管系统的正常对照血小板在超微结构上难以区分(图5E)。相反，从g-辐射的小鼠中分离的血小板表现出具有较少量的线粒体和颗粒的异常的形态(比正常血小板大两到三倍)(图5E)。血小板的异常形态可以解释这些小鼠与正常对照相比出血时间加倍，尽管血小板计数仅下降40％(图5，B和C)。从4×LLL处理的小鼠分离的血小板的总体聚集活性也与未接受IR的正常对照的相同(图5F)。这些结果表明通过LLL处理产生的血小板在形态和功能上保持完整。
此外，尽管LLL显着增加了血小板减少小鼠中的血小板生成，但与假处理的小鼠相比，当每隔一天施用LLL达12天时，对正常小鼠的血小板计数没有显着影响。MK的数量也没有显着变化，这支持了这种方法的安全性，因为即使在重复LLL使用后也几乎不用担心血栓形成。
除了前血小板形成的增加和加速之外，LLL还可以保护MK免受IR诱导的细胞凋亡，导致在IR后的前3天内LLL处理的小鼠中的MK数量比假处理的小鼠中的MK数量更高。在LLL存在下，MK的数量在IR后2天达到顶峰并且在一个股骨中从37353升至78159，其比不存在LLL的情况高出约50％。当对MK进行分选并进行3-Gy IR，然后测定半胱天冬酶-3/7活化时，相对于非IR对应物，在g-辐射的MK中，平均获得了半胱天冬酶-3/7活性的三倍增加，同时在IR后24小时内细胞活力显着降低。在IR后6小时给予LLL显着抑制了半胱天冬酶-3活化并增强了γ-辐射MK的细胞存活。使MK免受IR诱导的损伤的LLL介导的保护导致总PPF-MK的百分比从20.5％增加到30.2％，特别是大PPF-MK的百分比(从5.8到19.2％)，并且导致间接体内培养的γ-辐射MK的血小板生成的恢复。值得注意的是，MK数量在初始增加之后急剧下降至IR后第5天的最低水平。但是，在LLL处理的小鼠中，MK的数量再次稳定上升，而假处理的小鼠中MK的数量继续下降，这可能归因于响应于LLL来自HSC的MK的更好的分化，尽管为了得出这一结论还需要进一步的研究。
LLL减轻由抗CD41抗体或5-氟尿嘧啶诱导的血小板减少症。
我们还进一步拓展了对ITP的研究，排除了LLL介导的血小板生成对γ-辐射诱导的血小板减少症是特异的。我们通过从第0天至第7天每天以0.1mg/kg体重施用抗CD41抗体来耗尽血小板，以创建常用的ITP动物模型。Katsman等人，Transfusion 50，1285–1294(2010)。每天用假光或30J/cm2 LLL处理小鼠，在血小板计数显着下降的第3天进行初始照射，并且在LLL后6小时每天检查血小板计数(图6A)。仅在两次处理(第4天)后LLL有效地提高了最低点，并且在抗CD41抗体存在的条件下大大加速了血小板计数的恢复，尽管最终由于补偿性血小板生成导致血小板计数在所有小鼠中反弹(图6A)。在LLL处理的动物中，出血时间也在第5天正常化(图6B)。在抗CD41抗体存在下LLL提高血小板再生的能力极大地拓宽了其应用，因为ITP是血小板减少症的常见形式。在接受5-FU的小鼠中也观察到LLL对血小板再生的类似作用。化学治疗药物在第4天以150mg/kg体重的剂量使循环血小板计数减少43％(Chenaille等人，Blood 76，508-515(1990))，但是从第0天至第2天每天一次给予三个剂量的LLL极大地缓解了药物治疗的小鼠中的血小板减少症(图6C)和正常化的出血时间(图6D)。
LLL在人细胞中显示了血小板生成潜能
我们继续使用人类细胞评估这种形式的翻译潜力。CD34+细胞在含有100ng/ml的人TPO的无血清扩增培养基中培养，其重现了如前所述的巨核细胞生成的所有分化阶段。Zeuner等人，Cancer Res.67,4767-4773(2007)。在培养物中，CD34+细胞在6天内主要分化为MK祖细胞，在12天内分化为MK，在15天内分化为血小板，如图7A所示。因此，我们从第12天的培养物中分选成熟MK，并用不同能量密度的LLL处理细胞。能量密度为0.5至10J/cm2(峰值响应为3J/cm2)的LLL显著地刺激了人MK中的ATP生成(图7B)，类似于小鼠MK(图1B)。因此，在第0天(主要是培养物中的CD34+细胞)，第6天(MK祖细胞)或第12天(MK)施用相同的激光(3J/cm2)，随后在第15天评价血小板生成。在这些培养物中的MK分化通过随时间增加的多倍体(在第12天达到多倍体细胞(≥8N)的最大百分比)得到证实(图7C)。细胞多倍性的增加与LLL对血小板生成的影响相关，在培养的第12天通过LLL处理诱导的血小板生成达到最高水平(图7D)。结果清楚地表明，MK是小鼠中LLL的优先靶标，并且LLL对人和小鼠MK之间的血小板生物发生有类似作用。
讨论
目前的研究表明，无创LLL照射能够稳健地增加血小板减少的小鼠中的血小板生成，但在正常对照中不能。激光在间接体内的人和小鼠MK中同样有效，与这两个物种之间线粒体的进化保守和血小板生物发生一致。该观察结果有说服力地证明了LLL作为血小板减少症的治疗和预防的翻译潜力。该研究最重要的发现在于，LLL主要靶向MK，其在游离血浆TPO(与循环血小板的数量呈负相关)的检查下保持LLL介导的血小板生成。Shinjo等人，Leukemia 12，295-300(1998)。形成鲜明对比的是，在临床中或在治疗血小板减少症的开发条件下所使用的所有当前药剂促进MK前体独立于血小板计数地从HSC分化，从而如果以高剂量施用则带来血栓形成的高风险。由于MK的数量经巨核细胞生成通过血小板计数相互调节，血小板减少症越严重，将诱导越强烈的巨核细胞生成，产生大量MK，那么LLL对血小板形成的影响就越显着。相反地，在生理条件下或者当血小板计数恢复到正常水平时，LLL对血小板计数几乎没有影响，因为这些健康受试者中MK的数量极少(图5E)。理论上，LLL应该使所有患有获得性血小板减少症的患者受益，无论其病因如何，条件是尽管在当前研究中测试了IR、ITP和5-FU诱导的血小板减少症，但是可以通过血小板减少症剧烈地触发巨核细胞生成。然而，目前尚不清楚这种方式是否对遗传性的血小板减少症有类似的影响。对于巨核细胞生成不足的患者，LLL与巨核细胞生成药物(如重组人白细胞介素-11(rHuIL-11)、romiplostim和eltrombopag)的组合可以累加或协同地增强血小板生物发生并减少这些药物的剂量依赖性的副作用(Vadhan-Raj,S.,Semin.Hematol.,46,S26-S32(2009))，因为这些药物靶向不同于LLL的血小板生成的早期分化阶段。据我们所知，目前还没有特异性靶向前血小板形成或巨核生成的下游的任何药剂。
LLL介导的血小板生成的机理主要依赖于其对线粒体的独特作用。LLL保护MK免受γ-辐射诱导的细胞凋亡，γ-辐射通过线粒体依赖的途径诱导细胞凋亡，如大量研究所证明的。Sridharan等人，Radiat.Res.，181，324-334(2014)。其次，LLL特异性地增强MK中的线粒体生物发生(图3)，这是从未在其他类型的细胞中发现过的，并且归因于MK的多倍性(MK的独特特征)。先前的研究表明，近红外光暴露使肌肉细胞中的PGC-1α表达增加约20％，但下游线粒体组分基因(Tfam、NRF-1、Sirt3和细胞色素c)的表达未改变。同样地，LLL增加了BM和LSK中的PGC-1α转录，但没有伴随线粒体生物发生(图3B)或伴随着其他线粒体组分基因的表达增加。LLL对多倍体MK中的线粒体生物发生的这种独特作用与增加与血小板功能相关的蛋白质合成所需的MK基因组的功能性扩增一致，与细胞增大平行。Raslova等人，Blood，101，541-544(2003)。LLL的特异性MK效应很好地解释了为什么LLL对MK的影响很大，而对类似条件下的BM和LSK(图3B)、淋巴细胞和红细胞几乎没有影响。
LLL增加MK线粒体生物发生和线粒体活性的能力可能是其血小板生成效应必不可少的(Mostafa等人，Exp.Hematol.29，873-883(2001))，这是从ATP生成和血小板生成之间的相关性(图2A)推断出来的。前血小板形成的高能量需求也与体内血小板生物发生一致，其中，MK在前血小板形成期间向BM正弦曲线迁移，其中，氧水平升高以确保大量线粒体氧化磷酸化，与主要存在于骨中的低氧生态位(low-oxygen niche)中的HSC和祖细胞相反。同样，MK倾向于在还含有较高水平的氧的肺毛细血管中形成前血小板。相反，缺乏IEX-1的线粒体活性不足阻碍了前血小板形成，这可以显著地通过LLL处理得以正常化(图2)。前血小板形成中ATP重要性的直接证据来自Richardson和Patel等人的研究。Richardson等人，Blood 106，4066-4075(2005)。他们表明，通过向由Triton X-100透化的PPF-MK中加入ATP激活了前血小板伸长，并显着增加前血小板生长。该研究不仅提供了关于ATP在血栓生成晚期阶段的速率决定因子的令人信服的证据，而且还提供了关于如何在体外和体内提高血小板生成效力的有价值的提示。
LLL疗法已经常规地在临床中用于镇痛、抗炎和伤口愈合超过二十年，具有长期的安全性记录。大多数从业者可以容易地采用这种安全、无药物和不依赖于供体的方式作为血小板减少症的独立或补充治疗。对于人体内的激光照射，超脉冲红外激光可以穿透组织达10～13厘米，而不产生任何过热的风险。因此，值得研究的是，超脉冲LLL是否能够在不久的将来无创地增加大动物的血小板生物发生。值得强调的是，这种方式并不旨在取代失血处理中的血小板输注，而是为了大大减少血小板输注的需要，并提供血小板减少症的一级或二级预防。
材料和方法
研究设计
该研究旨在确定LLL对血小板生物发生的决定性作用及其对血小板减少症的治疗和预防潜能。对于所有间接体内研究，我们使用从小鼠BM或CD34+细胞衍生的培养物中分选的初代MK。试验的数量(包括生物和技术重复)在每个图例中定义。对于体内试验，测试了三种不同的小鼠模型以验证LLL治愈或改善由辐射、免疫耗竭和5-FU诱导的血小板减少症的能力。每个图例中都标出了小鼠的数量。研究人员对样本特征不知情。研究对象的所有异常值均包括在数据分析中。
小鼠
在8～12周龄的任一性别的C57BL/6小鼠购自Jackson Laboratory。129Sv/C57BL/6背景的WT和IEX-1KO小鼠由我们试验室产生。Zhang等人，J.Cereb.Blood Flow Metab 34，1391-1401(2014)。根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)关于试验动物护理和使用的指南，动物协议得到马萨诸塞州综合医院研究动物护理小组委员会(Research Animal Care of the Massachusetts General Hospital)的批准。
低照度激光治疗
对于间接体内照射，将810nm的红外二极管激光(Acculaser，PhotoThera)设定为连续波，功率密度为15mW/cm2，持续3分20秒，以获得3J/cm2的能量密度。对于全身LLL照射，用异氟烷麻醉去除毛发的小鼠并将其置于覆盖整个躯干和四肢的激光透镜下。LLL的功率密度为100mW/cm2，总曝光时间为5分钟，以获得30J/cm2的能量密度。在IR或5-FU处理后4-6小时或在第一次抗CD41抗体注射后3天给予第一剂量的LLL。使用通用电气的小型柔软白色LED灯泡(3W，A15)施加假光。为了测量激光功率传输，在处死小鼠并暴露于不同的激光之后立即移除新鲜的皮肤、肌肉和椎骨层。通过激光功率计(Ophir Nova II)测量穿透的光，并且计算皮肤表面和骨层下方的光能密度差作为透射率(％)。
前血小板形成测定
分选CD41+FSChigh MK，用或不用LLL处理，并置于补充有3.75g/L的甲基纤维素(Sigma)的MK培养基中。细胞在37℃下在含有5％CO2的腔室中分化。通过延时显微镜(ZeissAxio Observer Z1)使用40倍物镜记录相差活细胞图像直至24小时。通过AxioVision软件(Zeiss)测量PPF-MK的最长或主直径。直径<100μm的PPF-MK定义为“小”，直径≥100μm的定义为“大”。为了估计PPF-MK形成的比例，在每个孔中放置500个CD41+FSChigh MK，并且由对处理不知情的研究者由每组至少6个样品手动计算PPF-MK的百分比。
跟踪股骨MK
在全身LLL照射后24小时，分别对每个小鼠静脉内施用12μg的FITC抗CD41和12μg的PE抗CD105抗体(BioLegend)。15分钟后处死小鼠并取出股骨并通过共聚焦显微镜检查。在从每个股骨中随机选择的6个视图中跟踪至少50个MK，并且以对样本不知情的方式从每组6个样本计算PPF-MK的百分比。
人巨核细胞和血小板培养物
从STEMCELL Technologies获得冷冻的人BM CD34+细胞，并如前所述地，在补充有100ng/ml的人TPO(STEMCELL Technologies)的无血清扩增培养基中分化。Zeuner等人，Cancer Res.67，4767-4773(2007)。在培养期间，通过May-Grünwald-Giemsa染色(Sigma)和通过流式细胞术的CD41水平常规评估巨核细胞的分化阶段。分别在培养的第0、6、12或15天收集CD34+细胞、MK祖细胞、成熟MK或血小板。
统计分析
结果表示为平均值±SEM。用双尾student's t检验(用于两组之间的比较)或通过单因素方差分析(用于多组的比较)来评价统计学显着性。p<0.05的值被认为是统计学上显着的。通过回归和相关分析测试ATP水平与血小板之间的关系，并计算决定系数(R2)。使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software)进行所有统计学分析。
实施例2：用于血小板再生的线粒体生物发生促进药物
几十年来一直在广泛研究线粒体生物发生，主要是在具有高能量需求的组织中，例如心脏、肝脏、骨骼肌、脂肪和脑。尽管巨核细胞(MK)在最终分化阶段线粒体也很丰富，但直到我们最近的研究才发现线粒体生物发生在血小板生物发生中的重要性。Yang等人，Sci.Rep.6:38238(2016)；Zhang等人，Sci.Transl.Med.，8:349ra101(2016)。我们证实了，在血小板形成的最后阶段中，大量细胞质重塑和前血小板的剧烈突出和伸长严重依赖于线粒体活性。作为支持，线粒体细胞色素c的点突变导致人类中血小板形成失调和血小板减少症，家族中没有其他疾病同时发生。Morison等人，Nat.Genet.，40:387-389(2008)。我们还证明了，在小鼠应激时，线粒体功能不足易导致血小板减少。Ramsey等人，Haematologica99：282-291(2014)。相反，低照度激光治疗(LLLT)促进了MK中的线粒体生物发生和血小板形成，并减轻了几种鼠模型中的血小板减少症。这些发现提出了一种有趣的可能性，即，线粒体生物发生促进药物(在此统称为线粒体药物(mito-drugs))可能能够增强血小板再生和治疗血小板减少症。
线粒体生物发生可以通过诱导过氧化物酶体增殖物-激活受体(PPAR)-γ共激活因子1α(PGC-1α)的表达进行药理学调控，所述过氧化物酶体增殖物-激活受体(PPAR)-γ共激活因子1α(PGC-1α)是用于线粒体生物发生的主调节基因，如图8所示。Scarpulla,R.C.,Biochim.Biophys.Acta 1813:1269-1278(2011)。该基因可以被各种激酶和PPAR激动剂转录激活，或者经过用AMP激活激酶(AMPK)的磷酸化和用沉默信息调节因子二蛋白1(SIRT1)的脱乙酰化(De-Ac)进行翻译后修饰(图8)。Komen等人，Br.J.Pharmacol.171:1818-1836(2014)。许多研究表明，线粒体生物合成可以充分地由以下诱导：pan-PPAR激动剂，包括苯扎贝特(BEZ)、罗格列酮、吡格列酮和非诺贝特；AMPK的激活剂，如AICAR(AMP模拟物)、二甲双胍、以及可能是白藜芦醇；和SIRT1的激活剂，如SRT1720，其衍生物SRT2183和SRT1460、槲皮素，以及可能是白藜芦醇。Uittenbogaard,M.and Chiaramello,A.,Curr.Pharm.Des,20:5574-5593(2014)；Arbel等人，Cardiovasc.Diabetol.,15:11(2016)。这些线粒体药物中的一些目前正在用于治疗代谢综合征、肥胖症、杜氏肌营养不良症(Duchenne musculardystrophy)和各种神经退行性疾病的临床试验，而其他药物(诸如BEZ、二甲双胍)已经在临床中使用了几十年。Hofer等人，Hum.Mol.Genet.23:2400-2415(2014)。但是，尚未对这些药物以单独或以任何组合的方式增加MK中线粒体生物发生或血小板生成的能力进行研究。
测试的一些线粒体药物增强了间接体内的MK的血小板生成。我们发现，尽管程度略低于LLLT，白藜芦醇(Res)、BEZ和SRT1720可以显着增强间接体内的MK的血小板生成，而AICAR不可以(图9)。用于各个药物的浓度是常用于在其他细胞培养物中诱导PGC-1α表达的浓度，除了以低100倍的浓度使用的SRT1720。较高浓度的SRT1720不会显着增加血小板生成。也许可以进一步优化每种药物的浓度以增强血小板生成。这些线粒体药物也显示出对化学疗法的益处(Aires等人，Mol.Nutr.Food Res.58:1785-1794(2014)；Liu等人，J.Cancer 6:1214-1221,(2015)；Fresco等人，Curr.Pharm.Des 16:114-134(2010))，并且因此可以给接受化疗的癌症患者带来双重益处，尽管这一结论还需要进一步的研究。
线粒体药物与体内LLLT类似地增加血小板生成，尽管以一定的延迟的方式：为了证明体内线粒体药物介导的血小板生物发生，给予8周龄的B6小鼠两剂化学药物5-氟尿嘧啶(5-FU)：在第1天和第4天分别给予120和90mg/kg体重以诱导血小板减少症(图9)。在第一次5-FU注射后6小时开始，用100mg/kg体重的BEZ或Res或载体对照每天两次地强饲5-FU处理的小鼠，连续4天。为了比较，5-FU处理的小鼠平行地还每天给予LLL，连续4天。BEZ在第7天和第7天后表现出与LLLT相似的保留plt计数的功效，但其在第7天之前不如LLLT，可能是因为LLLT保护MK和血小板免于凋亡，但BEZ没有。尽管相对于LLLT存在延迟，但BEZ能够将血小板计数维持为等于或高于血小板计数的非风险水平(正常值的70％)并且实质上减少了最低点，这是最低点造成最危险的出血的关键。Res还增强了血小板生物发生并显着提升了最低点，但与BEZ或LLLT相比，其功效相对较弱。结果证实，线粒体生物发生的诱导可以减轻血小板减少症。研究中的Res或BEZ的剂量与临床中线粒体药物的当前剂量相当。BEZ的更高的剂量或药量能否进一步提高功效仍有待研究。
LLLT和线粒体药物的组合可以扩展益处。LLLT的快速作用和口服BEZ的便利性促使我们将两者结合用于治疗由抗CD41抗体诱导的血小板减少症(一种常用的免疫性血小板减少症(ITP)模型)。从第0天到第7天每天给予抗血小板抗体，这导致两次注射后循环血小板的急剧下降并且在第2天达到最低点。在整个试验的8天中，血小板水平保持低于正常血小板计数的40％。单独的BEZ没有有效地防止血小板计数下降到最低点，但是其在最低点之后很快显著地增加了血小板计数。与此形成鲜明对比的是，LLLT使血小板计数水平维持在高于正常水平的50％，大大降低了出血风险。BEZ和LLLT的组合进一步改善了血小板再生并维持血小板计数等于或高于正常水平的70％(循环血小板计数的安全水平)。这些结果证明了线粒体药物单独使用或者与LLLT或其他促进巨核细胞生成促进药物联用治疗血小板减少症的线粒体药物潜力。这些结果显示在图10和11中。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可获取材料的完整公开内容通过引用结合到本文中。通过引用并入的材料与本说明书之间的任何不一致都以有利于本说明书的方式解决。仅为了清楚理解，给出了以上详细描述和实施例。不应从以上详细描述和实施例中理解出不必要的限制。本发明不限于所示和描述的具体细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求限定的本发明内。

Claims (7)

1.一种化合物在制备刺激受试者中血小板形成的药物中的应用，其中，所述化合物选自由苯扎贝特、白藜芦醇和SRT1720组成的组。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述受试者已被诊断患有血小板减少症。
3.根据权利要求2所述的应用，所述药物还包括抗血小板减少症药物。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物还包括药学上可接受的载体。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物通过与血小板前体接触来刺激受试者中血小板的形成。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述血小板前体是巨核细胞或原巨核细胞。
7.根据权利要求5所述的应用，其中，所述血小板前体是体外的或间接体内的。
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