CN110082534A

CN110082534A - 一种羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒

Info

Publication number: CN110082534A
Application number: CN201910211134.0A
Authority: CN
Inventors: 关贵全; 徐建林; 王锦明; 刘军龙; 刘爱红; 李有全; 罗建勋; 殷宏
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2019-08-02

Abstract

本发明公开一种羊巴贝斯虫抗体检测的通用试剂盒。本发明的羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒内至少包括有截短的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原的底物包被品。本发明是以羊巴贝斯虫微线体分泌的AMAl蛋白为检测标识，将目的基因在大肠杆菌中表达纯化该蛋白，用已获得的重组抗原建立间接ELISA试剂盒，用以检测或诊断羊巴贝斯虫病，本发明弥补现有技术的不足，首次建立一种能检测羊巴贝斯虫未定种及莫氏巴贝斯虫6个虫株感染的通用诊断试剂盒，用于羊巴贝斯虫抗体的定性检测，具有操作简便、节约成本、高通量和易于标准化等优点。

Description

一种羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种寄生虫的通用检测试剂盒，确切讲本发明涉及一种羊巴贝斯虫抗体检测的通用试剂盒。

背景技术

巴贝斯虫是一类寄生于动物和人红细胞内的、隶属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoea）、梨形虫目（Piroplasmida）、巴贝斯科（Babesiidae）、巴贝斯属（Babesia）的蜱传性血液原虫。到目前为止，世界范围内报道的巴贝斯虫共有100 多个种，但目前报道并命名的感染羊的巴贝斯虫主要有莫氏巴贝斯虫（B. motasi ）、绵羊巴贝斯虫（B. ovis）和粗糙巴贝斯虫（B. crassa）三种。感染我国羊的巴贝斯虫的主要有两种，即莫氏巴贝斯虫（Babesia. Motasi Bm）和巴贝斯虫未定种 (Babesia sp. Bsp) (Guan et al., 2002,2009; Liu et al., 2007; Niu et al., 2009)。巴贝斯虫病（babesiosis）是由巴贝斯属的原虫寄生于宿主红细胞内引起的一类蜱传性血液寄生虫病，以高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿和死亡为临床特征，其肺、脑、肾等实质器官毛细血管中的红细胞呈线状或集落状凝集，从而影响这些器官的正常功能。本病在世界各地广泛流行，2012-2013年间，Guan等和Wang等利用莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种的可溶性虫体抗原建立的ELISA方法，对我国22个省份羊巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查，结果显示莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为43.5%（Guan et al. 2012a），羊巴贝斯虫未定种的为31.66%（Wang et al. 2013）。说明羊巴贝斯虫病在我国普遍流行，严重危害我国养羊业的健康持续发展。建立快速、灵敏、准确、操作方便的检测方法，以配合该病的防控计划的实施，是控制该病在我国的流行的先决条件。

羊巴贝斯虫病的检测技术主要有血涂片显微镜镜检，以聚合酶链反应（PCR）为代表的分子方法和以酶联免疫吸附试验（ELISA）为代表的血清学方法。

根据研究报道，使用环介导等温扩增（LAMP）对新疆伊犁州的145份血样，进行流行病学调查，显示巴贝虫未定种的阳性率3.5％(Guan et al., 2008)。用BspRAP-1为靶标分子建立的巢式PCR方法（专利申请号：201610905860.9），对我国15个省份987份血样进行流行病学调查，巴贝虫未定种平均感染率为3.89％ (Niu et al., 2017)。用real-time PCR方法（专利申请号：201510035493.7），对采自我国10省份共823份羊血样进行了检测，结果显示，莫氏巴贝斯虫平均阳性率为5.95%，羊巴贝斯虫未定种平均阳性率为0.85%（杨强，2016）。He等以trap基因为靶基因建立的多重PCR方法，对采自我国云南、贵州等9省份的976份野外血液样品进行了检测，结果显示，羊巴贝斯虫未定种平均阳性率为0.82%，莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为1.02%(待发表)。这些数据远远低于血清流行病学调查的结果，但其与巴贝斯虫感染特性相一致，高染虫率的虫血症只能持续3周，而抗体可以持续大约1年。因此，分子方法主要用于临床病例的诊断，在进行流行病学调查时，由于病原检测为阳性的持续时间较短，所以不能真实的反应我国羊巴贝斯虫的感染情况。

目前已报道血清学诊断方法已有4种，这些血清学诊断方法都有各自的缺点和不足。用体外培养的莫氏巴贝斯虫临潭株裂殖子可溶性抗原建立的间接ELISA(Guan et al.,2010)，只能检测到莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株，而不能检测到莫氏巴贝斯虫河北株、宁县株；用体外培养的巴贝斯虫未定种新疆株的裂殖子可溶性抗原建立的间接ELISA(Guan etal., 2012)，只能特异性的检测到巴贝斯虫未定种新疆株；用BspXJ-rRAP-1为靶标抗原建立的间接ELISA（专利申请号：201610890348.1），只能特异性的检测巴贝斯虫未定种新疆株；以BmLT-rRAP-1为靶标抗原建立的间接ELISA(Niu et al., 2016)，只能检测莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株、宁县株，却不能检测到莫氏巴贝斯虫河北株。只能特异性的检测巴贝斯虫的现有技术在实际的应用中到限制，在实际的应用中需要对同一份样本至少进行不同虫种的两次检测，使其操作繁琐，效率低下，以致进行大批量的流行病病学的调查和生产实践中临床病例的诊断检测变得十分困难，甚至无法具体实施。

正是因为存在前述的问题，寻找一种能全覆盖检测感染两个种的6株巴贝斯虫，从而实现在同一份样本中同时检测感染我国羊巴贝斯虫两个种的单一感染或混合感染、能快速准确的进行临床上羊巴贝斯虫感染的诊断和流行病学调查的方法是本领域急待解决的课题。

发明内容

本发明即是一种可解决前述的现阶段本领域急待解决的课题的羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒，本发明同时提供可供所述检测试剂盒使用的检测抗原的制备方法。

本发明的羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒内至少包括有截短的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原的底物包被品。

为方便使用，本发明的羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒内还有：包被液、预包被酶标版、血清稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、酶标结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。

本发明所涉及的检测抗原是截短的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原，其制备方法是以羊巴贝斯虫cDNA为模板，用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2扩增，将得到的目的片段和pET-30a用EcoR I和Not I双酶切，双酶切的目的片段和pET-30a产物进行纯化回收、连接，并将其转化到表达菌株BL21(DE3)进行表达，经亲和层析纯化获得截短的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原。优选地，本发明以羊巴贝斯虫未定种新疆株cDNA为模板。

本发明所述检测试剂盒用于羊巴贝斯虫非疾病诊断的检测方法是，将稀释后的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原包被于酶标板，用PBST洗涤酶标板后用封闭液37℃封闭，再用PBST洗涤酶标板后加入待检血清，再用PBST洗涤后，加入经PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠源抗羊单克隆抗体，再加入TMB进行显色，再加入终止液终止反应，根据显色情况确定被检样品是否感染羊巴贝斯虫。

优选地，本发明的检测试剂盒用于羊巴贝斯虫非疾病诊断的检测方法是，最佳包被浓度为0.5ug/孔；血清最佳稀释倍数为1：20；酶标结合物最佳稀释倍数为1：2000；5%BSA为最佳封闭液。

前期研究认为AMA1蛋白具有作为诊断标识、药物靶点和疫苗候选抗原，具有研制顶复门寄生虫所引起疫病的防控技术的潜力（Niu et al. 2016）。本发明在研制过程中获得了羊巴贝斯虫未定种新疆株、敦煌株、莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株、宁县株和河北株6个虫株的AMA1基因的全长序列。经序列比对分析，本发明选择羊巴贝斯虫未定种新疆株AMA1基因作为羊巴贝斯虫抗体检测的全覆盖诊断标识，用于建立检测巴贝斯虫两个种的通用血清学检测方法。

本发明是以羊巴贝斯虫微线体分泌的AMAl蛋白为检测标识，将目的基因在大肠杆菌中表达纯化该蛋白，用已获得的重组抗原建立间接ELISA试剂盒，用来检测或诊断羊巴贝斯虫病。本发明弥补现有技术的不足，首次建立一种能检测羊巴贝斯虫未定种及莫氏巴贝斯虫6个虫株感染的通用诊断试剂盒，用于羊巴贝斯虫抗体的定性检测。

与现有的分子生物学方法环介导等温扩增（LAMP）、Real-time PCR、巢氏PCR、多重PCR相比，本发明所建立的间接ELISA方法，检出阳性率更高，能检测得到病原感染的持续时间更长。分子诊断技术只能在第2-3周检测到病原，而本发明所建立的间接ELISA方法能在第2-25周持续检测出感染的抗体。同时，分子生物学方法需要昂贵的仪器设备和试剂，操作过程比较复杂，不利于大规模的流行病学调查，主要用于临床紧急诊断，而本发明所建立的间接ELISA操作简便、节约成本、高通量和易于标准化等优点。

实际应用本发明建立的羊巴贝斯虫AMA1间接ELISA试剂盒对采自甘肃省古浪、天祝、武威、景泰地区554份羊血清进行检测。结果显示，羊巴贝斯虫的感染平均阳性率为51.98%。这一结果与我国已报道羊巴贝斯虫的流行情况更为吻合，在开展流行病学调查时能全覆盖感染我国羊的两个种6株巴贝斯虫，不存在漏检，更能全面准确的反应我国羊巴贝斯虫的流行情况。

本发明中，所用的检测巴贝斯虫的重组抗原虽然是通过巴贝斯虫未定种新疆株的AMA1设计的，但该重组蛋白也适用于其它5株巴贝斯虫（巴贝斯虫未定种敦煌株，莫氏巴贝斯虫临潭株，宁县株、天祝株和河北株），且与羊泰勒虫和无浆体无交叉反应，检测结果良好。该方法实现了同一样本只需要一次实验，即可全覆盖检测出羊巴贝斯虫抗体的目的，用一个AMA1重组抗原全覆盖检测感染我国的六株羊巴贝斯虫的方法，弥补了以往血清学检测技术的缺陷。

附图说明

图1：羊巴贝斯虫间接ELISA抗体检测试剂盒Cot-off值。

图2：羊巴贝斯虫间接ELISA交叉反应试验。

图3：羊巴贝斯虫抗体动态检测。

具体实施方式

本发明以下结合实例进行解说。

一、目的蛋白的获取

1、目的基因的获取（两条人工序列）

SEQ ID No.1： Bsp-AMA1-F

5' CCGGAATTCAGGTTTGACATTCCTAGGGT 3'

SEQ ID No.2：Bsp-AMA1-R

5' ATTTGCGGCCGC GTACTTAGTTAGCTTGTCTG 3'，预获得的目的片段大小为393bp（AMA1核苷酸序列第288-681位碱基）

2、重组表达载体的构建

以实验室保存的羊巴贝斯虫未定种新疆株的cDNA为模板进行扩增，采用50μL的PCR反应体系，反应条件为94℃预变性3min，然后94℃1min、56℃1min、72℃30s，34个循环，72℃延伸10min。取PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒（OMEGA）进行纯化回收，将目的片段和pET-30a经EcoR I和Not I双酶切，双酶切的目的片段和pET-30a产物进行纯化回收，连接，并将其转化到表达菌株BL21(DE3)，从转化的平板中挑选单克隆，PCR阳性克隆鉴定，将阳性克隆送由宝生物生物工程（大连）有限公司进行测序。测序正确的重组载体命名为PET-AMA1，

3、目的蛋白的诱导表达纯化及分析

测序正确的菌液扩大培养，进行表达条件的优化，SDS-PAGE 分析诱导表达结果，在37℃，IPTG终浓度为0.5mM，诱导时间为8h的条件下，目的蛋白表达，表达量最高且是可溶性蛋白，目的蛋白大小约为25kDa。AMA1重组蛋白的纯化，通过亲和层析纯化羊巴贝斯虫AMA1截短表达重组蛋白，将超声处理后菌液上清与Ni-NTA（QIAGEN）结合过夜，将填料与上清混合物加入至纯化柱中，弃去液体，加入Wash buffer洗涤填料，重复3-5次，弃去洗涤液；加入Elution Buffer，洗脱目的蛋白，重复3次，收集洗脱液进行浓度测定，并将其冻存至-20℃(整个纯化过程在4℃操作)，AMA1重组蛋白的纯化及West-blot鉴定，我们成功表达纯化出AMA1截短重组蛋白。

二、羊巴贝斯虫AMA1间接ELISA诊断方法的建立

1、羊巴贝斯虫AMA1间接ELISA诊断方法条件的优化

（1）采用方阵滴定法测定，用0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)将重组抗原2ug/ml依次以1:100，1:200，1:400，1:800稀释，分别包被于酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。用PBST洗涤酶标板3次，然后用封闭液37℃封闭1h。再用PBST洗涤酶标板3次。将待检血清（一抗），每孔加入100μL用血清稀释液稀释以1：10、1：20、1：40稀释的阳性血清(感染羊的血清)以及阴性血清为一抗，37℃作用1h。PBST洗涤3次后，加入100μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠源抗羊单克隆抗体经PBST稀释到1：2000(二抗)，37℃作用1h。每孔加入100μL TMB避光显色8min，再加入100μL2mol/L硫酸终止反应，测定450nm波长处的光密度值(OD 450 )，选定阳性血清OD值较大，且P/N值较大时的反应孔的抗原作为最佳工作条件，结果表明，抗原最佳包被浓度为1：400（0.5ug/孔），血清最佳稀释倍数为1：20。

（2）按已确定好的抗原浓度与一抗工作浓度的反应条件，将酶标二抗按1：1000、1：2000、1：4000的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用1h，其他步骤同上，结果表明：酶标二抗最佳稀释倍数为1：2000。

（3）按已确定好的抗原浓度，一抗工作浓度和二抗工作浓度的反应条件，选用12种封闭液，2%GEL，5%GEL，2%GEL+5%HS，5%GEL+5%HS，1%BSA，2%BSA，5%BSA，10%BSA，1%SMP，2%SMP，5%SMP，10%SMP，在37℃封闭1h，其他步骤同上，结果表明5%BSA为最佳封闭液。

2、羊巴贝斯虫间接ELISA试剂盒阈值和特异性、敏感性的判断

在优化好的最佳反应条件下，以本实验室羊巴贝斯虫感染后收集的血清作为阳性血清（303），野外采集的羊血清以重组RAP1重组蛋白间接ELISA检测及PCR检测均为阴性的羊血清作为阴性血清（200份），共计503份阴阳性血清进行实验。按照阴、阳性分为两组，每次设立标准阴、阳性对照。将ELISA结果进行统计分析（ROC曲线），最佳临界值根据敏感性（Sn）、特异性（Sp）和ROC曲线下的面积（AUCs）来确定，结果显示，Cut-off值33.23为系统分析的最优临界点，此时的Sn为97.4%，Sp为98.0%，AUCs为0.998，参见图1。

3、羊巴贝斯虫间接ELISA的交叉反应试验

在优化好的ELISA最佳反应条件下，分别取吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni) 、尤氏泰勒虫(Theileria uilenbergi)、绵羊无浆体（Anaplasma ovis）、巴贝斯虫未定种新疆株、巴贝斯虫未定种敦煌株、莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫河北株、莫氏巴贝斯虫宁县株，共九个阳性血清，以1：20进行稀释，用已优化好的羊巴贝斯虫AMA1间接ELISA方法检测，同时设立阴性血清对照，每份血清平行做2个重复，观察各血清与系统是否有交叉反应。结果显示，羊巴贝斯虫AMA1重组截短蛋白，只与巴贝斯虫未定种新疆株、巴贝斯虫未定种敦煌株、莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫河北株、莫氏巴贝斯虫宁县株六株羊巴贝斯虫阳性血清反应，而与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫及绵阳无浆体阳性血清不反应。说明本发明的羊巴贝斯虫AMA1间接ELISA试剂盒特异性良好，能全覆盖羊巴贝斯虫的两个种6个虫株，而与羊泰勒虫和无浆体均不反应，参见图2。

三、抗体动态检测及田间样本的检测

1、抗体动态检测

用本发明建立的羊巴贝斯虫AMA1间接ELISA试剂盒，对实验室感染羊巴贝斯虫后收集的血清进行抗体动态检测，阳性血清的收集方式，接种后每周静脉采血2次，4周后每周1次，3个月后每两周1次，5个月后每月1次，一共检测了两只羊26个时间点收集的血清（编号：BspDH-057、BspXJ-170）。结果显示，感染巴贝斯虫未定种后，平均12天后就可以检测到巴贝斯虫的抗体，持续到180天后抗体逐渐降低变为感染前的水平，参见图3。

2、田间样本的检测

应用本发明建立的羊巴贝斯虫AMA1间接ELISA试剂盒对采自甘肃省古浪、天祝、武威、景泰地区554份羊血清进行检测。结果显示，在古浪采集的82份羊血清，检测到41份（50.0%）羊巴贝斯虫的感染；在天祝采集的86份羊血清中，检测到46份（53.48%）羊巴贝斯虫的感染；在武威采集的243份羊血清中，检测到133份（54.73%）羊巴贝斯虫的感染；在景泰采集的143份羊血清中，检测到68份（47.55%）羊巴贝斯虫的感染，平均阳性率为51.98%。这些结果与巴贝斯虫媒介蜱的分布、采样地点及前期Guan等和Wang等利用莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种的可溶性虫体抗原建立的ELISA方法调查的结果基本相一致。

四、本发明的试剂盒制备与应用

1.方法材料

96 孔酶标板、底物包被品、标准阴性对照品、标准阳性对照品、底物包被液、封闭液、血清稀释液、洗涤液、酶标结合物、显色液、终止液。

标准阳性对照品：为实验室前期制备的羊巴贝斯虫阳性血清；

标准阴性对照品：为实验室前期制备的羊巴贝斯虫阴性血清；

底物包被品 1×30ul/支：经诱导、纯化、鉴定的AMA1重组截短蛋白（2mg/ml）；

酶标板 1/块：商品化96孔酶标板（9018 CORNING 11416010）；

血清稀释液 1×10 ml/瓶：商品化血清稀释液（济南百迪泰生物科技有限公司BIDTA-17111906）；

酶标结合物 1×10ul/支：商品化辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠源抗羊单克隆抗体（克隆GT-34）IgG（Sigma ，A9452）；

底物包被液1×10 ml/瓶：商品化碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液0.1mol/L(pH9.6)（C3041-100CAP SIGMA ，SLBD1763V），取一片（胶囊）溶于100ml去离子水；

封闭液1×10 ml/瓶：5%BSA，商品化BSA (0332-100G Amresco 1356C065)，称取0.5g溶于10ml1ÍPBST溶液；

洗涤液1×10 ml/瓶：10ÍPBST，称取NaCl 80g ，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g ，KH₂PO₄2.7g溶于去离子水，将PH值调至7.4，加入5ml Tween20混匀，定容至1L，使用前用去离子水按1：10 稀释（1ÍPBST（0.05% Tween20( pH7.4)的0.01M PBS 溶液）；

显色液 1×10 ml/瓶：商品化TMB （KPL SureBlue^TM SeraCare 10283795）;

终止液 1×10 ml/瓶：2mol/LH₂SO₄，量取108.7毫升浓硫酸，缓慢倒入盛有约600毫升水的烧杯中同时不断搅拌，等溶液冷却至室温后转移至1L容量瓶中，定容至1L。

其中，底物包被品（纯化的重组蛋白）、标准阴阳性对照品、HRP酶标二抗保存于-20℃，封闭液、显色液4℃避光保存。

2. 本发明的试剂盒操作步骤

（1）抗原包被：用抗原包被液将抗原稀释到合适浓度（0.5ug/孔），在ELISA 96孔板中每孔加入稀释后的抗原100μL，于37℃孵育1h后4℃过夜。

（2）封闭：弃去液体，甩干，用洗涤液1×PBST洗涤（10×PBST原液使用前用去离子水按1：10 稀释），每孔 300μl，洗涤3次，甩干，用5%BSA进行封闭，每孔 100μl，37℃放置1h。

（3）一抗孵育：弃去液体，甩干，洗3次，甩干，将待检样本用血清稀释液按1：20 稀释，每孔100μl。同时设立标准阴阳性对照，37℃放置1小时。

（4）二抗孵育：弃去液体，甩干，洗3次，，甩干，酶标二抗，用PBST按1:2000稀释，每孔100μl，37 ℃放置 1h。

（5）显色：弃去液体，甩干，洗6次，甩干，加显色液TMB，每孔100μl，37℃避光显色8min。

（6）终止读数：加2mol/L硫酸终止反应，每孔 100μl，轻轻摇晃，终止反应，用BioTech Epoch型酶标仪(Thermo Scientific)测定OD 450nm 值。

（7）结果判定： AbR为33.23，当AbR大于等于33.23为阳性，当AbR小于33.23为阴性。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列上游扩增引物(Bsp-AMA1-F)

<400> 1

ccggaattca ggtttgacat tcctagggt 29

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列下游扩增引物(Bsp-AMA1-R)

<400> 2

atttgcggcc gcgtacttag ttagcttgtc tg 32

Claims

1.一种羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒，其特征在于试剂盒中至少包括有羊巴贝斯虫AMA1截短重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的羊巴贝斯虫的通用检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还有预包被酶标版、血清稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。

3.截短的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原的制备方法，其特征在于以羊巴贝斯虫cDNA为模板，用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2扩增目的片段，将得到的目的片段和pET-30a用EcoR I和Not I双酶切，双酶切的目的片段和线性pET-30a产物进行纯化回收，连接，并将其转化到表达菌株BL21(DE3)，表达产物经Ni-NTA亲和层析处理，得到截短的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原。

4.根据权利要求3所述的截短的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原的制备方法，其特征在于以羊巴贝斯虫未定种新疆株cDNA为模板。

5.权利要求1或2所述检测试剂盒用于羊巴贝斯虫非疾病诊断的检测方法，将稀释后的羊巴贝斯虫AMA1重组抗原包被于酶标板，用PBST洗涤酶标板后用封闭液37℃封闭，再用PBST洗涤酶标板后加入待检血清，再用PBST洗涤后，加入经PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠源抗羊单克隆抗体，再加入TMB进行显色，再加入终止液终止反应，根据显色情况确定被检样品是否感染羊巴贝斯虫。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：最佳包被浓度为0.5ug/孔；血清最佳稀释倍数为1：20；酶标结合物最佳稀释倍数为1：2000；5%BSA为最佳封闭液。