CN110079553B - 一种增强猪抗病毒性疫病的生物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强猪抗病毒性疫病的生物制剂，本发明利用Bac‑To‑Bac昆虫杆状病毒表达系统获得了高质量和高活性的3种不同类型的猪干扰素(pIFN)：pIFN‑α、pIFN‑γ和pIFN‑λ1，在优化3种pIFN抗病毒活性条件的基础上，按照不同比例进行联合应用，获得3种类型pIFN联合应用抗病毒活性的最佳比例。3种pIFN联合应用与单一应用的抗病毒活性提高10‑1000倍。可开发成增强猪免疫活性、抗病毒性疫病的生物制剂和抗生素的替代品，从而为猪病毒性疫病特别是新发或突发的重大疫病防控提供物质基础。

Description

一种增强猪抗病毒性疫病的生物制剂
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种增强猪抗病毒性疫病的生物制剂。
背景技术
病毒性疫病是目前危害养猪的头号病原，主要通过疫苗免疫的方式进行防控。但是对于新发病毒或者是由基因组高变异的病毒感染引起的再发疫病，尚无疫苗或者疫苗免疫效果不理想。例如：2018年出现的非洲猪瘟，至今尚未有商品化的预防疫苗和治疗药物；2006年出现的高致病性PRRSV及2013年出现的NADC30样猪繁殖与呼吸综合征病毒，经典的疫苗株及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗对其交叉保护率较低，导致现有的疫苗免疫效果不理想；2010年出现的猪伪狂犬病毒的变异株，传统的gE缺失疫苗是无法防控的；猪瘟兔化弱毒C株的应用也没有阻止临床上猪瘟病毒野毒的不断流行和猪瘟的暴发。这些疫病的存在特别是非洲猪瘟在我国养猪业中的暴发流行，给我国养猪业造成巨大的经济损失，面临着严峻的考验。
除了利用疫苗和药物对疫病的进行正面防控外，提高机体免疫反应水平也是防控疫病的一个重要方式。提高机体对病毒感染的免疫反应，使病毒在机体存活和复制的几率降到最低，同时可降低抗生素的使用量，是实现无抗绿色养殖的重要物质基础。干扰素(Interferon，IFN)就是其中重要的一种理想的机体免疫增强剂及抗生素的替代物。IFN为细胞分泌的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性的细胞因子，它并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制，根据结合膜受体不同，IFN分为三个类型，I型、II型和III型。I型称之为病毒IFN包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ω等，II称之为免疫IFN，包括IFN-γ，III型IFN为新发现的一类IFN，包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。
尽管IFN能够有效抑制许多病毒的复制，但几乎所有的DNA和RNA病毒都进化了一种机制来逃避宿主IFN的作用，例如，A型流感病毒NS1蛋白能够在病毒感染的细胞内阻断IFN介导的反应，导致IFN的抗病毒效果受到影响。另外，干扰素生产成本高昂抑制是干扰素在兽医临床应用的最大障碍。目前，干扰素在国内畜牧生产上的应用仍然很少，基本局限于临床试验阶段。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种增强猪抗病毒性疫病的生物制剂。本发明将猪I型pIFN中的pIFN-α、II型pIFN pIFN-γ和III型pIFN中的pIFN-λ1的基因进行克隆，将密码子优化成昆虫细胞偏嗜密码子，连接入杆状病毒表达载体，利用昆虫细胞杆状病毒表达系统进行表达，获得高质量和高活性的3种不同类型的猪干扰素(pIFN)：pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1。本发明将pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1三种不同类型的猪干扰素联合应用，制备得到增强猪抗病毒性疫病的生物制剂，其抗病毒活性与单一类型的猪干扰素相比，提高了10-1000倍，为猪病毒性疫病，特别是新发或突发的防控提供了物质基础。本发明中pIFN为分泌性表达，鉴于昆虫细胞培养的成分简单，不需要常规去除细胞培养大量添加的牛血清等过程，大大简化了纯化成本。同时，又由于表达的pIFN的活性高，使用量显著降低，大大降低了成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种增强猪抗病毒性疫病的组合物，由pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1组成；所述pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1的重量(ng)比为(0.03-0.04)：(0.01-0.015)：(0.05-0.06)。
优选的，所述pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1的重量(ng)比为0.032：0.011：0.058。
优选的，编码pIFN-α的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码pIFN-γ的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码pIFN-λ1的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明根据昆虫杆状病毒表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子对猪pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1的编码核苷酸序列进行基因修饰和改造，添加蜂素信号肽，以利于其分泌表达。重新合成了编码pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1的核苷酸序列，分别如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.3所示，提高了干扰素的表达活性，所表达的干扰素具有具有高活性、高质量、易纯化、无散毒等优点。
优选的，所述pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1由如下方法制备而成：
分别将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的基因片段连接到昆虫细胞杆状病毒表达载体，转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，将获得重组杆状病毒感染sf9细胞中进行表达。
优选的，所述昆虫细胞杆状病毒表达系统为Bac-To-Bac表达系统，利用该系统表达的pIFN具有高活性、易于纯化等特点。
本发明的第二方面，提供上述组合物在制备预防和/或治疗猪病毒性疫病的生物制剂中的应用。
上述应用中，所述生物制剂具有如下1)-3)中至少一项所述的性能：
1)提高机体抗病毒基因的表达；
2)提高机体抗病毒感染的能力；
3)增强机体的免疫反应。
优选的，所述抗病毒基因包括：OAS基因、ISG15基因、Mx1基因、GBP1基因、STAT1基因和CXCL9基因。
本发明发现，pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1这三种不同类型的猪干扰素联合应用制备的生物制剂，能够显著提高上述多种抗病毒基因的表达，进而从根本上提高其抗病毒活性。
本发明的第三方面，提供一种增强猪抗病毒性疫病的生物制剂，所述生物制剂以上述的组合物为活性成分。
本发明的有益效果：
本发明利用昆虫杆状病毒表达系统对3种不同类型的猪干扰素(pIFN)：pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1进行表达，对表达条件进行优化，获得最佳表达条件。对3种pIFN的研究抗病毒活性进行了研究，结果表明，获得了高活性的pIFN，pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1的抗病毒活性分别为0.032ng、0.11ng、5.8ng。鉴于3种pIFN具有不同的的抗病毒和免疫调节功能，其生物学功能上能互补，起到协同作用。因此，本发明将3种不同类型的pIFN按照不同比例进行应用，获得3种类型pIFN联合应用的最佳比例，按pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1为0.032ng、0.011ng、0.058ng混合使用，其抗病毒活性能提高10-1000倍。这些组方可开发成增强猪免疫活性的生物制剂和抗生素的替代品，从而为猪病毒性疫病特别是新发或突发的防控提供物质基础，同时为响应全国无抗绿色养殖，抗生素的替代品提供重要选择。为猪病毒病防治提供了一个全新的思路，对于实际生产有着极为重要的意义。
附图说明
图1：pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1在昆虫细胞中的表达；图中，A：IFA结果；B：Western blot结果。
图2：在PK-15细胞和CRL-2843细胞检测pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1在不同刺激时间(A、B)和稀释度(C、D)诱导的抗病毒基因的qRT-PCR检测结果。
图3：VSV感染50％的PK15/CRL-2843细胞最适接毒量，A：VSV/PRV在PK-15细胞上的最适接毒量流式细胞仪分析和IFA结果；B：VSV在CRL-2843细胞检测的最适接毒量的流式细胞仪分析结果。
图4：pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1抗病毒效果检测；A：VSV的抗病毒效果；B：PRV的抗病毒效果。
图5：pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1最佳联合应用比例1:1:1总体积300μl的病毒基因检测；A：PK-15细胞；B：CRL-2843细胞。
图6：pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1最佳联合应用比例1:1:1总体积300μl的抗病毒效果检测；A：VSV的抗病毒效果；B：PRV的抗病毒效果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，病毒性疫病是目前危害养猪的头号病原，主要通过疫苗免疫的方式进行防控。但是在新发病毒或者是基因组高变异的病毒，无疫苗或者疫苗免疫效果不理想。提高机体免疫反应水平是防控疫病的一个重要方式。干扰素(Interferon,IFN)是一种由细胞分泌的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性的细胞因子，它并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制。是一种理想的机体免疫增强剂及抗生素的替代物。根据结合膜受体不同，IFN分为三个类型，I型、II型和III型。3种IFN在机体内发挥着不同的生物学功能，通过不同的方式均可以增强机体的免疫反应，提高机体对病毒的抵抗力。因此推测将3种IFN联合应用要比单种IFN的生物学效果要好。但三者的应用比例至关重要，因此本发明种3种猪pIFN的配比比例、刺激时间等条件进行了研究，获得的3种pIFN的联合应用的最佳比例，抗病毒效果与单种pIFN应用相比提高10-1000倍。
在本发明的一种实施方案中，对pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1基因序列优化和表达，具体为：根据NCBI公布的pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1(GenBank登录号：NM_001166318.1、NM_213948.1、MF503618.1)基因序列，获得其氨基酸序列，根据氨基酸序列及昆虫细胞密码子的偏嗜性，在基因的5’端添加蜂素信号肽，促进其分泌表达，优化成昆虫细胞中偏嗜表达的序列(SEQ ID NO.1-3)。将基因序列克隆入杆状病毒载体pFastBac1上，构建了猪pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ重组Bacmid杆状病毒载体，将重组Bacmid质粒转染入Sf9细胞中，获得pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ重组毒，使用IFA和Western blot验证pIFN在真核系统中均获得表达(图1A、图1B)。
本发明根据密码子的简并性优化，多个密码子编码同一个氨基酸，选择一个昆虫细胞中使用频率最高的密码子，在不改变pIFN氨基酸序列的前提下，可以使目的蛋白的表达达到最佳。经测定，采用本发明的pIFN编码基因和表达系统表达的猪pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ的活性较常规方法相比，提高了10倍以上；蛋白表达量提高了30％以上。
基于在真核系统中表达的猪pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ，本发明分别考察了其对抗病毒基因表达的影响以及抗病毒的效果。在本发明的一种实施方案中，通过将相同稀释度的pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1分别加入到PK-15和CRL-2843细胞系，在刺激后不同时间收取细胞，提取RNA，用real-time PCR方法对抗病毒基因进行检测，同时，用不同量的三种pIFN刺激PK-15和CRL-2843细胞系相同时间后，收集细胞，提取RNA，用real-time PCR方法对抗病毒基因进行检测。结果表明在PK-15细胞中，pIFN-α在稀释度为1：100，诱导时间为10-12h，抗病毒基因表达最高；pIFN-γ稀释度为1:10，诱导20-22h，抗病毒基因表达最高；pIFN-λ稀释度为1：10，诱导20-22h诱导的抗病毒基因表达最高(见图2A、2C)。在CRL-2843细胞上pIFN-α稀释度为1：10，诱导10-12h，抗病毒基因表达最高，pIFN-γ稀释度为10，诱导20-22h，抗病毒基因表达最高，pIFN-λ稀释度为10，诱导20-22h诱导的抗病毒基因表达最高(见图2B、2D)。
在本发明的另一种实施方案中，对pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ的抗病毒效果进行了检测。本发明用带有GFP的VSV系统评价三种pIFN的抗病毒活性，因此首先对VSV在PK15/CRL-2843细胞上最适接毒量进行探索，用流式细胞仪检测感染病毒的细胞数，发现0.1moi的VSV感染PK-15细胞，可以使细胞的感染率达到50％，PRV用1moi感染PK-15细胞，可以使细胞的感染率达到50％(图3A)。4moi的VSV感染CRL-2843细胞，可以使细胞的感染率达到50％(见图3B)。
本发明中分别验证3种IFN对VSV和PRV的抗病毒效果。首先用BCA(Bio-Rad公司产品)测定表达的pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ的浓度分别为0.32μg/ml、0.11μg/ml、0.58μg/ml。分别将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1倍比稀释后加入细胞中进行刺激诱导，流式细胞术结果显示，在PK15细胞上，pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1对VSV的抗病毒效价分别为：10-3(0.32ng)、10-3(0.11ng)、10-1(58μg)(见图4A)。抗PRV效价分别为：10-3(0.32ng)、10-3(0.11ng)、10-1(58ng)(见图4B)。在CRL-2843细胞对VSV的抗病毒效价分别为：10-3(0.32ng)、10-3(0.11ng)、10-1(58ng)(未展示研究结果)。
为研究不同类型的干扰素的联合应用效果，在本发明的又一实施方案中，将不同加入量pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1联合加入到细胞中，对其诱导的抗病毒基因进行检测，荧光定量结果显示，在PK15细胞上，将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1 100倍稀释，按照1:1:1的比例混匀分别加入90μl(0.1ng：0.03ng:0.2ng)，150μl(0.16ng：0.06ng:0.3ng)，300μl(0.32ng：0.11ng:0.58ng)混合液，加入300μl混合液的抗病毒基因表达最高(见图5A)。在CRL-2843细胞上将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1按照1:1:1的比例混匀分别加入90μl(0.1ng：0.03ng:0.2ng)，150μl(0.16ng：0.06ng:0.3ng)，300μl(0.32ng：0.11ng:0.58ng)混合液，加入300μl(0.32ng：0.11ng：0.58ng)混合液的抗病毒基因表达最高(见图5B)。
进一步对pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1联合应用抗病毒效果检测，将3种IFN按1：1：1混合，取90μl、150μl、300μl进行1000倍和10000倍稀释后，分别加入到PK15细胞中。流式细胞术和荧光显微镜结果显示，300μl时抗病毒效果最好，300μl的联合应用能比pIFN-α、pIFN-γ分别单独应用时的抑制VSV活性提高10倍，比pIFN-λ1单独应用时提高1000倍(图6A)。分别单独应用时的抑制PRV活性提高10倍，比pIFN-λ1单独应用时提高1000倍(图6B)。因此获得的最佳联合应用比例为1：1：1，最佳接种量为300μl，其抗病毒活性为：0.032ng：0.011ng：0.058ng。
通过以上研究发现了每1种干扰素的最佳诱导时间和最佳稀释度及3种pIFN联合应用具有协同作用，并具有剂量依赖性。3种pIFN联合应用，共同诱导下游不同抗病毒基因的表达来增强其对不同病毒的抗病毒效果。本发明从IFN发挥抗病毒功能的根源即对其诱导的抗病毒基因的表达来分析抗病毒活性，并从诱导表达的抗病毒基因水平上优化应用比例。优化比例选择的依据是根据单个IFN诱导的抗病毒基因的种类和特点不同，为了保证每一种IFN诱导的特定抗病毒基因的最佳表达，所以选择了1：1：1.机体内IFN的活性发挥受到正负反馈调控。在一定范围内，随着浓度的增加，其诱导的抗病毒基因增加，但超过一定范围就会影响其抗病毒活性，我们之所以选择300μl，是因为这个量时抗病毒效果已经提高，从经济方面考虑，这个量也能接受。pIFN可对病毒感染细胞有显著的抑制活性，可开发成抗病毒感染的药物，从而为实验室研究研究和临床防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1：pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1基因序列优化和蛋白表达
我们前期将pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1基因连接到真核表达系统(昆虫细胞杆状病毒表达系统)，转染Sf9细胞中进行表达，选择状态良好的Sf9细胞以1×106个/mL密度铺于6孔板，等细胞密度为70％左右进行DNA转染。根据X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent说明书，每孔以2μg的量分别进行转染DNA，混匀，于37℃，5％CO2培养箱培养24h，观察细胞状态待细胞变大。收集上清，将获得的重组毒盲传3代后，收集病毒。将获得的重组毒感染sf9细胞，用IFA和Western blot验证，结拜表明说明获得了表达pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1的重组杆状病毒(见图1A)。Western blot验证发现22KD左右目的条带，说明pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1干扰素真核表达成功(见图1B)。
实施例2：pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1刺激抗病毒基因表达检测
为了验证获得的pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1的抗病毒活性，先对其诱导的抗病毒基因的表达情况进行检测。选择状态良好的PK-15/CRL-2843细胞以2.7×105个/mL密度铺于24孔板，等细胞密度为单层进行pIFN诱导。将pIFN进行倍比稀释，每孔加入100μl，pIFN-α于37℃，5％CO2培养箱培养12h；pIFN-γ和pIFN-λ1于37℃，5％CO2培养箱培养22h。弃旧细胞培养基，用预冷的PBS清洗细胞，加入RNAiso裂解细胞，提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
荧光定量的结果显示在PK-15细胞中，pIFN-α稀释度为10-2，诱导10-12h，抗病毒基因表达最高，pIFN-γ稀释度为10-1，诱导20-22h，抗病毒基因表达最高，pIFN-λ稀释度为10-1，诱导20-22h诱导的抗病毒基因表达最高(见图2A、2C)。在CRL-2843细胞上pIFN-α稀释度为10-1，诱导10-12h，抗病毒基因表达最高，pIFN-γ稀释度为10-1，诱导20-22h，抗病毒基因表达最高，pIFN-λ稀释度为10-1，诱导20-22h诱导的抗病毒基因表达最高(见图2B、2D)。
表1：本发明中用于抗病毒基因检测的荧光定量PCR引物
Figure BDA0002041818710000071
注：表1中，用于抗病毒基因ISG15、OAS、MX1、OAS-R、CXCL9、STAT1、GBP1检测的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.17所示。
表1中，N.C表示阴性对照序列。本发明中使用了PK-15细胞系和CRL-2843细胞系，两者均是猪源细胞系，来自于猪肾上皮细胞和猪肺巨噬细胞，这两个细胞系用于检测GAPDH的引物序列相同，分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
实施例3：VSV/PRV感染PK15/CRL-2843细胞最适接毒量。
本发明中pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1抗病毒效果检测利用的是VSV系统和猪伪狂犬病毒(PRV)。因此优先要对VSV和PRV感染PK15/CRL-2843细胞最适接毒量进行检测，选择标准以50％的细胞感染为最佳接毒量。在24孔细胞板上按比例铺入生长状态良好的PK-15细胞和CRL-2843细胞，12h后PK15细胞上按1、0.5、0.1、0.01个MOI接种VSV/PRV，CRL-2843细胞按1、2、3、4、5、6、7个MOI进行接毒，病毒感染细胞12h后，细胞培养箱中取出细胞板，PBS清洗两遍，每孔加入胰酶进行消化，细胞培养箱消化5min，加入含FBS的DMEM，终止消化，收集到1.5mL EP管中，300g离心3min，加入1mL PBS，300g离心3min，清洗2次，加入流式细胞仪上样缓冲液，流式上机检测VSV病毒感染情况，结果显示，PK-15细胞上，VSV按0.1moi，PRV按1moi感染时有50％的细胞被感染(图3A)。CRL-2843细胞上，4moi感染VSV时50％的细胞被感染(见图3B)。因此以下的实验中PK-15细胞上接种0.1moiVSV，1moi的PRV，CRL-2843细胞上接种4moi的VSV。
实施例4：pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1抗病毒效果检测
在前面的pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1诱导抗病毒基因表达情况基础上，用VSV系统检测其抗病毒活性。首先用BCA(Bio-Rad公司产品)测定表达的pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ的浓度分别为0.32μg/ml、0.11μg/ml、0.58μg/ml。将生长状态良好的PK-15/CRL-2843细胞以2.7×105个/mL密度铺于24孔板，等细胞密度为单层进行pIFN诱导。将pIFN进行倍比稀释，每孔加入100μl，pIFN-α于37℃，5％CO2培养箱培养12h；pIFN-γ和pIFN-λ1于37℃，5％CO2培养箱培养22h。在单层PK-15细胞上，将0.1MOI的VSV，换成含有1％FBS的DMEM维持液，CRL-2843细胞上，将4MOI的VSV感做1h，换成含有2％FBS的DMEM维持液12h后取出细胞板，PBS清洗两遍，每孔加入胰酶进行消化，消化5min，加入10％FBS的DMEM，终止消化，收集到1.5mLEP管中，300g离心3min，加入1mL PBS，300g离心3min，清洗2次，加入流式细胞仪上样缓冲液，流式上机检测病毒感染情况。在单层PK-15细胞上，10倍稀释的PRV感做1h，换成含有1％FBS的DMEM维持液，12h后荧光显微镜观察抗病毒效果分别将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1倍比稀释后加入细胞中进行刺激诱导。流式细胞术结果显示，在PK15细胞上，pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1对VSV的抗病毒效价分别为：10-3(0.32ng)、10-3(0.11ng)、10-1(58μg)(见图4A)。抗PRV效价分别为：10-3(0.32ng)、10-3(0.11ng)、10-1(58ng)(见图4B)。在CRL-2843细胞对VSV的抗病毒效价分别为：10-3(0.32ng)、10-3(0.11ng)、10-1(58ng)(未展示研究结果)。
实施例5：pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1联合应用抗病毒基因检测
为了研究pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1联合应用的抗病毒效果，首先对3者联合应用的抗病毒基因诱导的表达情况进行检测。选择状态良好的PK-15/CRL-2843细胞以2.7×105个/mL密度铺于24孔板，等细胞密度为单层进行pIFN诱导。将pIFN 100稀释，分别设置3种加入量，将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1按体积比1:1:1的比例混合均匀，分别在不同的孔中加入90μl，150μl，300μl，在37℃，5％CO2培养箱培养22h。弃旧细胞培养基，用预冷的PBS清洗细胞，加入RNAiso裂解细胞，提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。荧光定量结果显示，在PK15细胞上，将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1 100倍稀释，按照1:1:1的比例混匀分别加入90μl(0.1ng：0.03ng:0.2ng)，150μl(0.16ng：0.06ng:0.3ng)，300μl(0.32ng：0.11ng:0.58ng)混合液，加入300μl混合液的抗病毒基因表达最高(见图5A)。在CRL-2843细胞上将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1按照1:1:1的比例混匀分别加入90μl(0.1ng：0.03ng:0.2ng)，150μl(0.16ng：0.06ng:0.3ng)，300μl(0.32ng：0.11ng:0.58ng)混合液，加入300μl(0.32ng：0.11ng：0.58ng)混合液的抗病毒基因表达最高(见图5B)。
实施例6：pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1联合应用抗病毒效果检测，分别加入到PK-15/CRL-2843细胞中。用流式细胞术分析和IFA进行检测。将生长状态良好的PK-15/CRL-2843细胞以2.7×105个/mL密度铺于24孔板，等细胞密度为单层进行pIFN诱导。将pIFN进行100倍比稀释，分别设置3种加入量，将pIFN-α、pIFN-γ、pIFN-λ1按体积比1:1:1的比例混合均匀，分别在不同的孔中加入90μl，150μl，300μl，在37℃，5％CO2培养箱培养22h。在单层PK-15细胞上，用0.1MOI的VSV，换成含有1％FBS的DMEM维持液，CRL-2843细胞上，用4个MOI的VSV感做1h，换成含有2％FBS的DMEM维持液12h后取出细胞板，PBS清洗两遍，每孔加入胰酶进行消化，消化5min，加入10％FBS的DMEM，终止消化，收集到1.5mL EP管中，300g离心3min，加入1mL PBS，300g离心3min，清洗2次，加入流式细胞仪上样缓冲液，进行分析。单层PK-15细胞上，10倍稀释的PRV感做1h，换成含有1％FBS的DMEM维持液，12h后荧光显微镜观察抗病毒效果。结果显示300μl时抗病毒效果最好，300μl的联合应用能比pIFN-α、pIFN-γ分别单独应用时的抑制VSV活性提高10倍，比pIFN-λ1单独应用时提高1000倍(图6A)。分别单独应用时的抑制PRV活性提高10倍，比pIFN-λ1单独应用时提高1000倍(图6B)。因此获得的最佳联合应用比例为1：1：1，最佳接种量为300μl，其抗病毒活性为：0.032ng：0.011ng：0.058ng。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种增强猪抗病毒性疫病的生物制剂
<130> 2019
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaattcatga agttcctggt gaacgtcgct ctggtgttca tggtggtcta catcagctac 60
atctacgctg cctgcgacct gcctcagacc cactctctgg ctcacactag ggccctgaga 120
ctgctggctc agatgcgccg tatcagccct ttctcttgcc tggactacag gagagacttc 180
ggtttcccac aggaggccct gggtggaaac caggtgcaga aggcccaggc tatggccctg 240
gtccacgaaa tgctgcagca gaccttccag ctgttctcaa ctgagggctc cgctgccgct 300
tgggacgaat cactgctgca ccagttctgc accggactgg accagcagct gagagacctg 360
gaggcttgcg tgatgcagga ggccggactg gaaggtaccc cactgctgga ggaagactcc 420
atcctggctg tccgcaagta cttccaccgt ctgactctgt acctgcagga gaagtcatac 480
tccccttgcg cctgggagat cgtgagggct gaagtcatgc gcgccttctc cagctctact 540
aacctgcagg accgcctgcg taagaaggaa caccaccacc accaccacta aaagctt 597
<210> 2
<211> 532
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaattcatga aattcttagt caacgttgcc cttgttttta tggtcgtata catttcttac 60
atctatgcgg cctactgcca ggcgcccttt tttaaagaaa taacgatcct aaaggactat 120
tttaatgcaa gtacctcaga tgtacctaat ggtggacctc ttttcttaga aattttgaag 180
aattggaaag aggagagtga caaaaaaata attcagagcc aaattgtctc cttctacttc 240
aaattctttg aaatcttcaa agataaccag gccattcaaa ggagcatgga tgtgatcaag 300
caagacatgt ttcagaggtt cctaaatggt agctctggga aactgaatga cttcgaaaag 360
ctgattaaaa ttccggtaga taatctgcag atccagcgca aagccatcag tgaactcatc 420
aaagtgatga atgatctgtc accaagatct aacctaagaa agcggaagag aagtcagact 480
atgttccaag gccagagagc atcaaaacac caccaccacc accactaagc tt 532
<210> 3
<211> 602
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaattcaaat ggccctgggt ggctctctgg tgctggtgct cgtgctgatg actgtggccc 60
ctccccgtac tggtgctgtc ccagtgcctg aagctctgag agctctgcct ggagcccgcg 120
gttgccacct ggctcagttc aagtctctgt caccacaggc tctgcaggcc ttcaagaggg 180
ctaaggacgc cttcgaggaa tccctgctgg aggactggaa ctgctccagc cgtatcttcc 240
cacgcagccg tgacctgaag cagctgcagg tctgggaaag gcctgtggct ctggaggccg 300
aagtcgctct gaccctgtcc gtgctgggta gcctggccaa ctcttcactg cactccagcc 360
tggaccagcc tctgcacact ctgagacaca tccacgctca gctgcaagct tgcgtgccag 420
ctcaacctat ggctggtcct aggccaagag gaaggctcca ccactggctg cacaggctgc 480
aggaggccca gaagaaggaa ccccagtctt gcctggaagc ttcagtgatg ttcaacctgt 540
tccgtctgct gaccagggac ctgaagtgcg tcgcttccgg cgacctgtgc gtgtaactcg 600
ag 602
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttgatggtg caaagcttca g 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cacataggct tgaggtcata ctc 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccacaggagg aagatatcta gacg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccaggtctg acaccaactc 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcattaagaa gcaggtcagt gtcc 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttggcagttc tgtggaggtt g 21
<210> 10
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<212> DNA
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gccaggtctg acaccaactc 20
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<212> DNA
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uuuggcuuuc uguaccagct t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttcctgcatc aacaccagcc 20
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<212> DNA
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gaagtaaggt tcgcctccgt tctg 24
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<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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acgugacacg uucggagaat t 21
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<211> 21
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aactcgcaca tcacgcagca g 21
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tgttgctgta gccaaattca 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
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<400> 18
actcactctt ccacttttga tgct 24
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgctggaatg aggtgttt 18

Claims (1)

1.由pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1组成的组合物在制备预防和/或治疗由VSV病毒引起的猪病毒性疫病的生物制剂中的应用；
所述组合物由pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1按重量(ng)比为0.032：0.011：0.058组成；
编码pIFN-α的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码pIFN-γ的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码pIFN-λ1的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述pIFN-α、pIFN-γ和pIFN-λ1由如下方法制备而成：
分别将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的基因片段连接到昆虫细胞杆状病毒表达载体，转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，将获得重组杆状病毒感染sf9细胞中进行表达；所述昆虫细胞杆状病毒表达系统为Bac-To-Bac表达系统；
所述生物制剂具有如下1)-3)中至少一项所述的性能：
1)提高机体抗病毒基因的表达；
2)提高机体抗病毒感染的能力；
3)增强机体的免疫反应；
所述抗病毒基因包括：OAS基因、ISG15基因、Mx1基因、GBP1基因、STAT1基因和CXCL9基因。
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猪α干扰素在杆状病毒中表达及其对PRRSV的抑制作用;王彦彬等;《中国兽医学报》;20091231;全文 *
猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定;秦立廷等;《生物工程学报》;20070531;摘要、第387页左栏第1段 *
猪干扰素α 在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测;王彦彬等;《中国农业科学》;20091231;摘要 *

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