CN110078778A - 一种从百香果果皮粗提物中去除野黑樱苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从百香果果皮粗提物中去除野黑樱苷的方法,包括以下步骤:1)获得百香果果皮粗提物;2)将百香果果皮粗提物上大孔树脂柱层析,经洗脱、浓缩,得到花色苷浓缩液;3)将花色苷浓缩液过葡聚糖凝胶树脂柱,用pH=1‑3、浓度为10‑20v/v%的甲醇溶液洗脱,收集含目标物的流份,浓缩,干燥,即得到百香果果皮花色苷提取物。与现有技术相比,本发明在过葡聚糖凝胶树脂柱时,创造性的选用pH=1‑3、浓度为10‑20v/v%的甲醇溶液作为洗脱剂洗脱,在有效提高所得百香果果皮花色苷提取物中花色苷含量的同时还很好的去除了野黑樱苷,使所得百香果果皮花色苷提取物可直接应用于食品、医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及植物中有效成分的提取方法,具体涉及一种从百香果果皮粗提物中去除野黑樱苷的方法。
背景技术
百香果(Passiflora edulia Sims),又名鸡蛋果,是西番莲科西番莲属的草质藤本植物,我国主产区为广东、广西、台湾、福建等省份。百香果果汁营养物质丰富,香味浓郁独特,有“果汁之王”的美誉。百香果目前主要用于生产果汁,极小部分作为鲜果食用。在大量的百香果果汁生产中,百香果果皮被作为废弃物丢弃,这不仅造成了资源的极大浪费,也给环境造成负担。
花色苷是广泛存在于植物的花,果实、茎、叶等器官中,使植物呈现绚丽色彩的一类化合物,由花色素与糖以糖苷键的形式结合而成。目前许多合成色素因安全性问题而被禁止使用,而花色苷作为一种天然色素,因其安全无毒,色彩绚丽,来源广泛,且还具有抗炎,抗肿瘤、抗衰老等多种生理活性的优点,慢慢地在食品、医药和化妆品等领域占据重要份额。
已有的研究表明,百香果果皮富含花色苷,是一种理想的天然色素来源。现有技术中已有通过从百香果果皮中提取花色苷而减少百香果果皮造成的不利影响。如公开号为CN106578825A的发明专利公开了一种百香果花色苷的提取方法,具体是将百香果和果皮混合物进行常温高压浸提,过滤,真空浓缩干燥得到百香果花色苷。但该发明仅只是停留在果皮粗提取的阶段,并未对所得提取物进行纯化除杂。
另一方面,Kevin C.Spencer等(Cyanogenesis of Passiflora edulis[J].AgricFood Chem 1983,31:794-796)研究发现,百香果中含有野黑樱苷。野黑樱苷本身并没有毒性,但其进入人体后,在β-葡萄糖苷酶的作用下水解产生剧毒的氢氰酸。氢氰酸能够迅速地被血液吸收和运输,在人体内积累一定量后会抑制酶活性,进而抑制组织细胞呼吸,导致死亡。研究显示,氢氰酸对人的急性致死量为0.5-3.5mg/kg体重,鉴于其毒性大,在饮用水及含有氢氰酸的食品中均有其限量的要求。
可见,如果将含有野黑樱苷的百香果果皮花色苷提取物直接应用于食品、医药等领域,存在一定的安全隐患。因此,对百香果果皮花色苷提取物进行纯化以去除野黑樱苷等杂质显得尤为必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从百香果果皮粗提物中去除野黑樱苷的方法,该方法能够实现将花色苷与野黑樱苷进行有效洗脱分离,使最终所得百香果果皮花色苷提取物的花色苷含量有效提高同时不含野黑樱苷。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种从百香果果皮粗提物中去除野黑樱苷的方法,包括以下步骤:
1)获得百香果果皮粗提物;
2)将百香果果皮粗提物上大孔树脂柱层析,经洗脱、浓缩,得到花色苷浓缩液;
3)将花色苷浓缩液过葡聚糖凝胶树脂柱,用pH=1-3、浓度为10-20v/v%的甲醇溶液洗脱,收集含目标物的流份,浓缩,干燥,即得到百香果果皮花色苷提取物。
本发明所述技术方案的步骤1)中,可以采用现有常规方法对百香果果皮进行提取以获得含花色苷的百香果果皮粗提物。通常采用以下方法来获得百香果果皮粗提物:以百香果果皮为原料,以水或乙醇为溶媒进行提取,收集提取液,之后回收溶剂以得到百香果果皮粗提物。其中,
所述的乙醇为浓度为10-90v/v%的乙醇溶液,或者是经过酸化后的乙醇溶液如pH=1-5、浓度为10-90v/v%的乙醇溶液。
所述的提取可以是常规的加热提取、超声提取或常温浸提等,优选采用回流提取。对于提取的次数,每次提取时溶媒的加入量、提取的时间等可参考现有常规技术,具体的,提取的次数通常为1-3次,每次提取时溶媒的加入量通常为原料重量的5-20倍,每次提取的时间通常为0.5-3h。
本发明所述技术方案的步骤1)中,所述的百香果果皮优选是经干燥、粉碎后所得的物料,通常是粉碎至20-50目。
本发明所述技术方案的步骤2)中,在将百香果果皮粗提物上大孔树脂柱层析时,所用的洗脱剂可以是现有技术中能够将百香果果皮粗提物中的花色苷洗脱下来的洗脱剂,优选为酸化乙醇溶液或酸化甲醇溶液。其中,当以酸化乙醇溶液为洗脱剂时,优选采用pH=1-5、乙醇的体积含量为30-90%的酸化乙醇溶液为洗脱剂,更优选采用pH=1-3、乙醇的体积含量为30-60%的酸化乙醇溶液为洗脱剂,最优选采用pH=2-3、乙醇的体积含量为50-60%的酸化乙醇溶液为洗脱剂;当以酸化甲醇溶液为洗脱剂时,优选采用pH=1-5、甲醇的体积含量为30-90%的酸化甲醇溶液为洗脱剂,更优选采用pH=1-3、甲醇的体积含量为30-60%的酸化甲醇溶液为洗脱剂,最优选采用pH=2-3、甲醇的体积含量为50-60%的酸化甲醇溶液为洗脱剂。
本发明所述技术方案的步骤2)中,所述的大孔树脂为现有技术中能够富集花色苷的常规大孔树脂,优选的,采用型号为D101、AB-8或HPD-100的大孔树脂。
为了减少大孔树脂的负担,并减少进入下一工序的杂质,优选在对大孔树脂进行洗脱之前,先用水洗大孔树脂柱,更优选是用5-8倍柱体积的酸性水(pH=1-5)洗柱。
本发明所述技术方案的步骤3)中,所述葡聚糖凝胶树脂的型号优选为SephadexLH-20、Sephadex G-25或ephadex G-50,优选Sephadex LH-20。在洗脱过程中用紫外-可见光分光光度计和薄层层析监测洗脱过程,收集530nm处吸光值大于零且不含野黑樱苷的洗脱液。优选采用pH=2-3、浓度为10-20v/v%的甲醇溶液洗脱。
与现有技术相比,本发明在过葡聚糖凝胶树脂柱时,创造性的选用pH=1-3、浓度为10-20v/v%的甲醇溶液作为洗脱剂洗脱,使花色苷解吸之前将树脂中吸附的绝大部分野黑樱苷先行洗脱下来,实现将花色苷与野黑樱苷进行有效洗脱分离,使最终所得百香果果皮花色苷提取物的花色苷含量有效提高同时不含野黑樱苷,因此,采用本发明所述方法所得百香果果皮花色苷提取物可直接应用于食品、医药领域。此外,相对于高浓度甲醇溶液洗脱,本发明所述方法成本更低。
附图说明
图1为实施例1所得百香果果皮花色苷提取物及其中步骤1)所得粗提物以及野黑樱苷对照品的HPLC图谱,其中a为实施例1中步骤1)所得粗提物的HPLC图谱,b为实施例1最终所得百香果果皮花色苷提取物的HPLC图谱,c为野黑樱苷对照品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
1)取百香果果皮(20目)500g,加入10L的pH=2.5、浓度为70v/v%的乙醇溶液常温浸提60min,过滤,滤渣重复上述提取操作2次,合并滤液,所得提取液回收乙醇,得到百香果果皮粗提物;
2)将百香果果皮粗提物上大孔树脂柱(D101)层析,先用5BV的pH=2.5的纯净水洗柱,以除去糖、蛋白质等杂质;然后用pH=2.5、浓度为60v/v%的乙醇溶液洗脱,收集红色明显的洗脱液,真空浓缩,得到花色苷浓缩液;
3)将花色苷浓缩液过葡聚糖凝胶树脂柱(Sephadex LH-20),用pH=2.5、浓度为10v/v%的甲醇溶液洗脱,用紫外-可见光分光光度计和薄层层析监测洗脱过程,收集530nm处吸光值大于零且不含野黑樱苷的洗脱液,浓缩,干燥,即得到百香果果皮花色苷提取物456mg。
对比例1
重复实施例1,不同的是:
步骤3)中,用pH=2.5、浓度为30v/v%的甲醇溶液洗脱。
最后得到百香果果皮花色苷提取物463mg。
对比例2
重复实施例1,不同的是:
步骤3)中,用pH=1、浓度为40v/v%的甲醇溶液洗脱。
最后得到百香果果皮花色苷提取物472mg。
实施例2
重复实施例1,不同的是:
步骤3)中,用pH=2.5、浓度为20v/v%的甲醇溶液洗脱。
最后得到百香果果皮花色苷提取物489mg。
实施例3
重复实施例1,不同的是:
步骤2)中,用pH=2.5、浓度为30v/v%的乙醇溶液洗脱;
步骤3)中,用pH=2.5、浓度为20v/v%的甲醇溶液洗脱。
最后得到百香果果皮花色苷提取物432mg。
实施例4
重复实施例1,不同的是:
步骤3)中,用型号为Sephadex G-25的葡聚糖凝胶树脂代替Sephadex LH-20。
最后得到百香果果皮花色苷提取物426mg。
实施例5
重复实施例1,不同的是:
步骤2)中,用型号为AB-8的大孔吸附树脂代替D101。
最后得到百香果果皮花色苷提取物418mg。
实施例6
重复实施例1,不同的是:
步骤2)中,用型号为HPD-100的大孔吸附树脂代替D101。
最后得到百香果果皮花色苷提取物421mg。
实施例7
重复实施例1,不同的是:
步骤2)中,用pH=1、浓度为90v/v%的乙醇溶液洗脱。
最后得到百香果果皮花色苷提取物468mg。
实施例8
重复实施例1,不同的是:
步骤1)中,用水代替pH=2.5、浓度为70v/v%的乙醇溶液作为溶媒;
步骤2)中,用pH=5、浓度为50v/v%的甲醇溶液洗脱;
步骤3)中,用pH=3、浓度为15v/v%的甲醇溶液洗脱。
最后得到百香果果皮花色苷提取物236mg。
实施例9
重复实施例1,不同的是:
步骤1)中,用浓度为80v/v%的乙醇溶液作为溶媒,提取的方式为回流提取,提取次数为3次,每次提取时溶媒的加入量为原料重量的8倍,每次提取的时间为30min;
步骤2)中,不用酸性水洗柱除杂质,直接用pH=2、浓度为80v/v%的乙醇溶液洗脱;
步骤3)中,用pH=1、浓度为20v/v%的甲醇溶液洗脱。
最后得到百香果果皮花色苷提取物432mg。
对上述各实施例所得的百香果果皮花色苷提取物的理化性质的测定
1)花色苷含量的测定
采用直接比色法测定各实施例及各对比例所得的百香果果皮花色苷提取物及各实施例步骤1)所得粗提物中的花色苷总含量,并以矢车菊-3-O-葡萄糖苷为标准,结果表示为mg矢车菊-3-O-葡萄糖苷/1g花色苷纯化物。
直接比色法的具体操作:百香果果皮花色苷提取物(或粗提物)5mg,以酸性纯净水(pH2.5)定容至25mL。以酸性酸性纯净水(pH2.5)为空白对照,取1mL,用紫外分光光度计在λmax(百香果果皮花色苷的最大吸收波长,经扫描确定)下测定吸光值。按以下公式计算花色苷含量:
花色苷含量(mg/g)=(A×MW×DF×V)/ε×1×Wt,
式中,A表示吸光值;MW表示花色苷分子量,DF表示稀释倍数;ε为摩尔消光系数;1表示1cm光径;V定容体积;Wt样品质量。以矢车菊-3-O-葡萄糖苷计,MW=449.2,ε=29600。
λmax的确定:以酸性酸性纯净水(pH2.5)为空白对照,取1mL,用紫外分光光度计在波长200-700nm的范围内进行光谱扫描,得到百香果果皮花色苷在可见光区的最大吸收波长,结果如下述表1所示。
表1.各实施例和对比例步骤1)中的粗提物以及各实施例和各对比例所得的百香果果皮花色苷提取物中花色苷、野黑樱苷含量
2)HPLC分析百香果果皮花色苷成分
使用高效液相色谱对各实施例百香果果皮花色苷提取物及各实施例步骤1)所得粗提物进行分析。将各实施例百香果果皮花色苷提取物及各实施例步骤1)所得粗提物和野黑樱苷分别溶于甲醇,配制成1mg/mL的溶液。12000r/min离心后取上清,用HPLC分析。色谱条件:流动相A为色谱乙腈,流动相B为0.2%磷酸,进样体积5μL。梯度条件:0min,5%A;40min,40%A。结果如上述表1所示,其中实施例1所得百香果果皮花色苷提取物及其中步骤1)所得粗提物以及野黑樱苷对照品的HPLC图谱如图1所示,其中a为实施例1中步骤1)所得粗提物的HPLC图谱,b为实施例1最终所得百香果果皮花色苷提取物的HPLC图谱,c为野黑樱苷对照品的HPLC图谱。
3)实施例1所得百香果果皮花色苷提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物,α—葡萄糖苷酶为催化剂,在pH为6.8的磷酸盐缓冲液体系中进行反应。将50μL磷酸盐缓冲液(浓度50mM)加入96孔板中,然后加入20μL各个浓度的待测样品(样品浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)和10μL酶液(1∪/mL),震荡混匀,置于37℃恒温箱中预热5min,然后加入20μL PNPG(1mM),于37℃恒温箱中反应30min,最后加入50μL无水碳酸钠溶液(0.2M)终止反应,在波长405nm处测定吸光值。用缓冲液代替样品做空白,其他步骤及试剂同上。按以下公式计算各样品系列浓度下的酶活性抑制率,并由此计算出IC50值,结果如下述表2所示。
酶活性抑制率=(A空白-(A样品-A背景))/A空白×100%,
其中,A空白不加样品反应后的吸光值;A样品加入样品抑制反应后的吸光值;A背景只加样品的吸光值。
50mM磷酸盐缓冲液的配制:取NaH2PO4·H2O 6.9g,Na2HPO4·12H2O 17.9g溶于蒸馏水中,定容至1000mL,调节pH至6.8。
1mM PNPG的配制:30.125mg PNPG溶于磷酸缓冲液中,定容至100mL。
0.2M碳酸钠溶液的配制:2.12g Na2CO3溶于磷酸缓冲液中,定容至100mL。
表2.实施例1所得百香果果皮花色苷提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性
4)实施例1所得百香果果皮花色苷提取物对酪氨酸酶抑制活性的测定
以左旋多巴为底物,蘑菇酪氨酸酶为催化剂,在pH为6.8的PBS缓冲液体系中进行反应。将80μL PBS缓冲液加入96孔板中,然后加入40μL各个浓度的待测样品(样品浓度为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL)和40μL酶液(125∪/mL),震荡混匀,置于37℃恒温箱中预热10min,然后加入40μL左旋多巴(2.5mM),于37℃恒温箱中反应30min,在波长490nm处测定吸光值。用缓冲液代替样品做空白,其他步骤及试剂同上。按以下公式计算各样品系列浓度下的酶活性抑制率,并由此计算出IC50值,结果如下述表3所示。
酶活性抑制率=(A空白-(A样品-A背景))/A空白×100%,
其中,A空白不加样品反应后的吸光值;A样品加入样品抑制反应后的吸光值;A背景只加样品的吸光值。
表3.实施例1所得百香果果皮花色苷提取物对酪氨酸酶抑制活性
Claims (10)
1.一种从百香果果皮粗提物中去除野黑樱苷的方法,包括以下步骤:
1)获得百香果果皮粗提物;
2)将百香果果皮粗提物上大孔树脂柱层析,经洗脱、浓缩,得到花色苷浓缩液;
3)将花色苷浓缩液过葡聚糖凝胶树脂柱,用pH=1-3、浓度为10-20v/v%的甲醇溶液洗脱,收集含目标物的流份,浓缩,干燥,即得到百香果果皮花色苷提取物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中,在将百香果果皮粗提物上大孔树脂柱层析时,洗脱剂为酸化乙醇溶液或酸化甲醇溶液。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述酸化乙醇溶液的pH=1-5,乙醇的体积含量为30-90%。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述酸化甲醇溶液的pH=1-5,甲醇的体积含量为30-90%。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于:步骤2)中,在洗脱之前,先用酸性水洗柱。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于:步骤2)中,所述大孔树脂的型号为D101、AB-8或HPD-100。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于:步骤1)中,以百香果果皮为原料,以水或乙醇为溶媒进行提取,收集提取液,之后回收溶剂以得到百香果果皮粗提物。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述的乙醇为浓度为10-90v/v%的乙醇溶液,或者是pH=1-5、浓度为10-90v/v%的乙醇溶液。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于:步骤3)中,所述葡聚糖凝胶树脂的型号为Sephadex LH-20、Sephadex G-25或ephadex G-50。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于:步骤3)中,pH=2-3、浓度为10-20v/v%的甲醇溶液洗脱。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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