CN110072544A - 由adt和雄激素受体疫苗组成的组合治疗 - Google Patents
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Abstract
本文公开了治疗前列腺癌的方法，包括向对象给予雄激素剥夺疗法(ADT)和针对雄激素受体或雄激素受体片段的疫苗的组合。还公开了增加前列腺癌对象中雄激素剥夺疗法功效的方法，包括向对象给予有效量的针对雄激素受体或其片段的疫苗，其中该方法抑制、延迟或减少前列腺癌的生长和/或去势抗性前列腺癌的发展。
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相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月9日提交的美国临时申请第62/347,646号的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA142608下于政府资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
前列腺癌对于50岁以上的男性来说是一个重要的健康风险，在美国每年约有200,000例新诊断的病例(Jemal A.等，Cancer Statistics，2005(2005)CA Cancer J Clin，55：10-30)。它是在男性中诊断的最常见的肿瘤，并且是美国男性癌症相关死亡的第二大原因(Jemal等，Cancer Statistics，2003(2003)CA Cancer J Clin，53：5-26)。尽管在筛选和早期检测方面取得了进展，但是大约30％的接受确定性前列腺切除术或消融放射治疗的患者将在10年时复发疾病(Oefelein等，1997，J Urol，158：1460-1465)。
雄激素受体(AR)是类固醇激素受体，其在正常前列腺组织的发育以及前列腺癌的进展中起关键作用。患有转移性疾病的患者最初用雄激素剥夺疗法治疗，并且一旦患者患有转移性前列腺癌，通常无限期地继续雄激素剥夺。鉴于其在这种背景下的使用超过60年，雄激素剥夺(AD)代表了实体肿瘤的第一个真正“靶向”治疗之一，并且在目前的新型癌症靶向药物的设备中几乎没有具有同样高的响应速度的例子。然而，尽管超过80％的患者对该治疗有初步应答，但通常会出现去势抗性，中位时间为2-3年。其他研究小组已经确定AR的扩增是雄激素剥夺治疗的常见，也许是最常见的抗性机制，超过50％的去势抗性疾病患者发生AR激活突变，过表达和/或基因扩增。这些发现强调了AR对前列腺癌的重要性，并表明AR抗原丢失(对免疫疗法具有抗性的主要手段)在人类前列腺癌中的可能性较小。最近的发现已经证明AR介导的信号传导在大多数去势抗性肿瘤中保持活性，因此优选的命名法现在是“去势抗性的”而不是以前使用的“雄激素非依赖性的”。因为雄激素剥夺抗性的中心手段之一是AR表达增加，所以矛盾的是，在某些情况下通过基因扩增，AR的药理学靶向可使得AR仍然是患有晚期去势抗性疾病的患者的靶标。去势抗性的转移性前列腺癌(mCRPC)是该疾病的致死形式。对于mCRPC患者，预期寿命中位数小于3年，迫切需要能够延迟建立去势抗性或更有效治疗该疾病阶段的治疗方法。
最近已将DNA疫苗添加到针对前列腺癌的治疗库中。相对于其他疫苗方法，DNA疫苗的优势在于制造相对容易和便宜，并且是“非专门设计的”而不是个体化的。动物研究已经证明DNA疫苗通过天然加工的MHC I类和II类表位导致抗原呈递。学术界和工业界正在研究几种DNA疫苗作为不同癌症类型的新型治疗方法，早期临床试验表明DNA疫苗可以增强免疫应答并显示临床应答的证据。我们实验室最近致力于雄激素受体(AR LBD)的配体结合结构域作为生物学相关的靶蛋白，其对前列腺癌的发展和进展至关重要。我们实验室已经证明，许多患有前列腺癌的患者具有对AR LBD特异的体液和细胞免疫应答，并且对于AR LBD特异性的溶细胞CD8+ T细胞可以以MHC I类限制性方式裂解人前列腺癌细胞。我们进一步证明编码AR LBD的DNA疫苗可在HLA-A2转基因小鼠中引发表位特异性溶细胞CD8+ T细胞，并使用这些小鼠作为肿瘤模型系统来评估靶向AR LBD和其他抗原的DNA疫苗。用AR LBDDNA疫苗免疫荷瘤小鼠引发抗肿瘤应答并显著延长小鼠的总体存活。
需要对前列腺癌进行新的和更有效的治疗，特别是在治疗或预防去势抗性疾病中。
发明内容
本公开内容基于令人惊讶的发现，即将针对雄激素受体的疫苗添加到雄激素剥夺疗法抑制前列腺肿瘤生长并延迟转移性疾病的发作或进展。
因此，在第一方面，本发明包括一种在患有前列腺癌的对象中引发抗肿瘤响应的方法，包括：a)向对象给予雄激素剥夺疗法(ADT或雄激素抑制疗法)；并且b)向对象给予针对雄激素受体的疫苗，其中疫苗以有效引发增加的对前列腺癌的抗肿瘤应答的量给予。这导致前列腺癌或转移性疾病的生长的抑制，延迟或减少。实施例证明当疫苗与标准ADT疗法组合时肿瘤生长显著延迟。在一个实施方式中，疫苗是DNA疫苗，其包含编码雄激素受体或雄激素受体片段的多核苷酸。在另一个实施方式中，疫苗是包含雄激素受体或其片段的多肽疫苗。
因此，在第二方面，本公开内容涵盖在患有前列腺癌的对象中引发抗肿瘤应答的方法，其包括：a)向对象给予ADT；并且b)向对象给予重组DNA疫苗，所述重组DNA疫苗包含与转录调节元件操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码雄激素受体或雄激素受体的片段，其中所述ADT和重组DNA疫苗以有效引发对前列腺癌的增加的抗肿瘤应答的量给予，并且其中所述组合延迟，减少或抑制前列腺癌细胞生长或转移。
在第三方面，本公开内容包括提高患有前列腺癌的对象中雄激素剥夺疗法的功效的方法，包括向对象给予有效量的重组DNA疫苗，所述重组DNA疫苗包含与转录调节元件操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码雄激素受体或雄激素受体的片段，其中该方法抑制，延迟或减少前列腺癌的生长。
在第四方面，本发明包括增加ADT功效和/或增强或增加ADT治疗的抗肿瘤应答的方法，通过给予有效量的重组DNA疫苗和有效量的PD-1途径抑制剂以增加ADT的抗肿瘤功效和/或增加或增强对ADT治疗的抗肿瘤应答。这种三联组合疗法导致前列腺肿瘤生长和转移的显著延迟。
在第五方面，本发明包括用于治疗前列腺癌的药盒，其包含雄激素剥夺疗法和引发抗雄激素受体免疫应答的疫苗。
在另一方面，本发明包括用于治疗前列腺癌的药盒，其包含雄激素剥夺疗法，引发抗雄激素受体免疫应答的疫苗和PD-1途径抑制剂。
附图的一些方面的简要说明
图1显示短期或长期雄激素撤除增加22Rv1前列腺癌细胞中的AR蛋白表达。
图2显示长期雄激素剥夺增加全长AR表达，并且短期雄激素剥夺诱导AR-V7表达的瞬时增加。上图：相对表达(标准化为β-肌动蛋白对照)。下图：在长期FCS培养的22rv1细胞上表达诱导倍数。*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图3A-D显示表达HLA-A2的长期雄激素剥夺的22Rv1细胞具有增加的雄激素受体表达。通过ELISA评估22Rv1/FCS(含有雄性激素的含胎牛血清培养基)和22Rv1/CSS(含活性炭处理的血清的培养基，雄激素耗尽)细胞系(或非HLA-A2转染的22Rv1对照)的AR蛋白表达(图3A)，通过qRT-PCR评估RNA表达(图3B)，通过流式细胞术评估HLA-A2表达(图3C)和PD-L1表达(图3D)(蓝色：22Rv1/FCS；红色：22Rv1/CSS；黑色：野生型22Rv1；灰色：IgG染色的22Rv1)。*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图4A-B描绘了用22Rv1/FCS(4A)或22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的脾细胞的细胞内细胞因子染色(插图中定量的平均荧光强度-*表示通过斯氏t检验的p＜0.05)。
图4C描绘了用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的脾细胞的CD69表达(插图中定量的平均荧光强度-*表示通过斯氏t检验的p，0.05)。
图4D描绘了用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的脾细胞的细胞毒性。
图5A显示了用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的脾细胞的CD69表达(在相邻条形图中定量-*表示通过斯氏t检验p＜0.05)。
图5B显示用22Rv1/CSS(右图)或22Rv1/FCS(左图)细胞培养的T细胞的细胞内细胞因子染色(TNFα的IFNγ)。
图5C显示表达零(蓝色)，一个(绿色)，两个(黄色)，三个(橙色)或四个(红色)Th1相关分子(IFNγ，TNFα，IL-2和/或颗粒酶B)的CD8+ T细胞的频率。
图5D显示用22Rv1/FCS(红色)或22Rv1/CSS(蓝色)细胞培养后CD8+ T细胞的颗粒酶B表达(在相邻条形图中定量-*表示通过斯氏t检验p＜0.05)。图5E显示表达表面脱粒标记物CD107a的CD8+ T细胞的频率。图5F显示用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的T细胞的细胞毒性。
图6A描绘了临床试验的时间示意图。
图6B描绘了临床试验中疫苗的建议剂量方案。
图7A和7B描绘了经雄激素剥夺的22Rv1人前列腺癌细胞和去势抗性的MycCaP小鼠前列腺癌细胞在ADT处理后具有增加的AR表达。
图7C描绘了在使用GnRH拮抗剂地加瑞克进行化学去势后体内MycCaP前列腺癌模型中肿瘤中AR表达的增加。
图7D描绘了由AR特异性CD8+ T细胞活化引起的CD69表达(左图)，IFNγ和TNFα细胞因子表达(中图)和细胞毒性(右图)的T细胞活化。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图8A描绘了通过细胞内细胞因子染色收集并针对MycCaP/CR肿瘤细胞的免疫应答分析的脾细胞(左图)并且测量来自pTVG-AR免疫小鼠的AR肽刺激的脾细胞裂解MycCap/AS对比MycCap/CR肿瘤细胞的能力(右图)。
图8B描绘了跟踪肿瘤体积的小鼠。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图8C描绘了对照(假)，地加瑞克+pTVG4和地加瑞克+pTVG-AR在攻击后的肿瘤体积。
图9A显示先前用PAP靶向疫苗免疫的患者的PBMC在PD-1阻断抗体(或IgG对照)存在下用PAP体外培养72小时，并通过ELISA测量PBMC的IFNγ(左图)或颗粒酶B分泌(右图)。
图9B显示将获自免疫后患者的PBMC与PAP蛋白和PD-1阻断抗体(或IgG对照)注射到NOD/SCID小鼠的足垫中，24小时后，测量足垫肿胀。
图9C显示在用靶向PAP的DNA疫苗免疫后，对来自具有持久性PAP特异性Th1-偏向免疫应答的患者(R)与无应答者(NR)的循环肿瘤细胞测量PD-L1表达。显示了治疗后样品的PD-L1MFI与治疗前样品相比的比率。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图10A显示来自用ADT处理并用pTVG-AR免疫的携带MycCaP肿瘤的动物的CD8+ T细胞具有升高的PD-1表达。
图10B显示复发性肿瘤具有升高的PD-L1表达。
图10C描绘了与单独用pTVG-AR免疫相比，具有AR靶向免疫与PD-1阻断抗体相结合的小鼠的肿瘤生长延迟。
图10D显示将AD与AR引导的免疫和PD-1阻断相结合进一步延迟了肿瘤生长。
图11A显示了通过定量ELISA分析在雄激素充足(FCS)或雄激素剥夺(CSS)培养基中培养1-7天(1d-7d)或超过六个月(长期：LT)的前列腺细胞系(永生化人上皮细胞系：RWPE-1和PrEC-E6；雄激素非依赖性前列腺癌细胞系：DU-145和PC-3；和雄激素依赖性前列腺癌细胞系：LNCaP和22Rv1)的雄激素受体蛋白表达(组图A)。
图11B显示了长期FCS(浅灰色)或CSS(深灰色)培养的前列腺细胞系。使用对配体结合结构域(上图)或氨基末端结构域(下图)特异的抗体通过细胞内染色分析培养的细胞系的AR表达。
图11C显示培养的前列腺细胞系中AR表达的定量幅度。
图11d显示培养的前列腺细胞系中AR+细胞的频率。
图11E显示了从培养不同时间段的22RV1/CSS细胞定量的RNA，分析了全长(深灰色)或AR-V7(浅灰色)AR转录物的存在。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05，并且数据代表至少两个独立实验。
图11F显示了HLA-A2转染的22Rv1/FCS和22Rv1/CSS细胞的表型验证。用编码HLA-A2的慢病毒载体转染在雄激素充足(22Rv1/FCS)或雄激素剥夺(22Rv1/CSS)培养基中培养超过6个月的22Rv1细胞。然后通过荧光激活细胞分选对表达HLA-A2的细胞进行分选，并通过定量ELISA评估扩增系的AR蛋白。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图11G显示通过qRT-PCR评估图11F的扩增系的AR蛋白。
图11H显示了分析图11G的细胞的HLA-A2表达。
图11I显示通过流式细胞术分析图11G的细胞的检查点配体PD-L1。
图12A显示AR特异性T细胞具有增加的对经雄激素剥夺的肿瘤细胞的识别和裂解。测量与表达HLA-A2的22Rv1/FCS或22Rv1/CSS细胞一起孵育的AR805特异性人T细胞培养物的CD69表面表达。
图12B显示用表达HLA-A2的22Rv1/FCS或22Rv1/CSS细胞孵育的AR805特异性人T细胞培养物，并测量IFNγ和/或TNFα的细胞内细胞因子表达。
图12C显示了在用表达HLA-A2的22Rvi/FCS或22Rv1/CSS细胞孵育的AR805特异性人T细胞培养物中定量的多功能细胞因子表达。
图12D显示通过细胞内颗粒酶B表达测量的AR特异性T细胞的溶细胞和脱粒活性。
图12E显示通过表面CD107a表达测量的AR特异性T细胞的溶细胞和脱粒活性。
图12F显示AR特异性T细胞的肿瘤细胞毒性。
图12G显示肽免疫后获得的AR特异性T细胞具有增加的对经雄激素剥夺的前列腺肿瘤细胞的识别和裂解。将来自AR811肽免疫的HLA-A2转基因(HHDII-DR1)小鼠的脾细胞与表达HLA-A2的22Rv1/FCS或22Rv1/CSS细胞共培养，并测量IFNg和TNFα的细胞内细胞因子表达。
图12H显示图12G的AR特异性T细胞在其表面上表达CD69。
图12I显示图12G的AR特异性T细胞是细胞毒性的。
图13A证明雄激素剥夺在体外和体内增加Myc-CaP肿瘤细胞中的AR表达。通过定量ELISA分析雄激素敏感(Myc-CaP/AS)和去势抗性(Myc-CaP/CR)细胞的AR蛋白表达。
图13B显示通过细胞内染色分析雄激素敏感性(Myc-CaP/AS)和去势抗性(Myc-CaP/CR)细胞的AR蛋白表达(对侧图中的表达的幅度和频率进行量化)。
图13C显示来自Myc-CaP/AS和Myc-CaP/CR细胞的RNA样品，通过定量PCR分析其全长或剪接变体mAR V2或mAR V4的表达。
图13D显示具有可触知肿瘤的携带Myc-CaP/AS肿瘤的FVB小鼠用地加瑞克(n＝4)或假处理(n＝3)处理，并跟踪肿瘤生长。结果代表两项独立研究。
图13E显示了收集并通过使用针对配体结合结构域的抗体(在侧图中定量的幅度和频率)的细胞内染色分析AR表达的复发肿瘤。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图14A显示雄激素剥夺与使用pTVG-AR免疫接种相结合延迟了去势抗性的Myc-CaP肿瘤的复发。带有可触知肿瘤的Myc-CaP/AS荷瘤小鼠进行假处理(n＝3)或地加瑞克处理以及用pTVG-AR(n＝5)或空载体(n＝5)每两周进行的免疫，并跟踪肿瘤生长(肿瘤体积)。结果代表三项独立研究。
图14B显示了图14A的卡普兰-迈耶曲线。结果代表三项独立研究。
图14C显示与myc-CaP/AS或Myc-CaP/CR细胞培养的用pTVG4或pTVG-AR免疫的雄激素剥夺动物的脾细胞，并评估CD4+和CD8+ T细胞细胞内细胞因子表达(多功能表达在侧饼图中定量)。
图14D显示了与Myc-CaP/AS或Myc-CaP/CR细胞培养的用pTVG4或pTVG-AR免疫的雄激素剥夺动物的脾细胞，并评估细胞毒性。
图14E证明了在存在或不存在ADT的情况下用pTVG-AR免疫延迟肿瘤生长，并导致肿瘤浸润T细胞增加。给予Myc-CaP/AS荷瘤小鼠地加瑞克或假处理，然后用pTVG-AR或pTVG4对照免疫，并测定肿瘤生长(肿瘤体积)。
图14F显示了图14E的小鼠的卡普兰-迈耶图。
图14G显示了通过IHC对从图14E收集的肿瘤的浸润T细胞的频率的分析。*表示通过曼-惠特尼U检验p＜0.05。
图15A显示雄激素剥夺增加PTEN缺陷肿瘤中的AR表达，并且用pTVG-AR免疫延迟Pten-/-小鼠中去势抗性前列腺肿瘤的发展。通过细胞内染色分析在雄激素充足(FCS)或雄激素剥夺(CSS)培养基中培养的PTEN-CaP8肿瘤细胞的AR表达(在侧图中对幅度和表达进行定量)。*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图15B显示了通过定量ELISA分析在雄激素充足(FCS)或雄激素剥夺(CSS)培养基中培养的PTEN-CaP8肿瘤细胞的AR表达的结果。*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
图15C显示了二十周龄PbCre+PTENf1/f1小鼠的结果，该小鼠给予假处理(n＝9)或地加瑞克处理以及用pTVG4(n＝13)或pTVG-AR(n＝13)每两周进行的免疫，持续5个月。在治疗完成和开始前一周，向动物给予124I-CLR1404并在静脉内注射后96小时扫描PET/CT(治疗前和治疗后的PET/CT图像)。使用大于最大PET信号的百分之六十的信号来计算肿瘤的平均和最大注射剂量百分比(％ID/g组织)，并将其标准化至背景肌肉摄取。
图15D显示了治疗组随机化的治疗前平均124I-CLR1404摄取。*表示通过曼-惠特尼U检验p＜0.05。
图15E显示了治疗组随机化的治疗前最大124I-CLR1404摄取。*表示通过曼-惠特尼U检验p＜0.05。
图15F显示计算的治疗前后的％ID/g平均的变化(实心水平线显示平均值)。*表示通过曼-惠特尼U检验p＜0.05。
图15G显示计算的治疗前后的％ID/g平均(实心水平线显示平均值)。*表示通过曼-惠特尼U检验p＜0.05。
图15H显示在尸检期间收集并分析的泌尿生殖器复合体。*表示通过曼-惠特尼U检验p＜0.05。
图16是使用抗雄激素疗法亮丙瑞林与DNA疫苗和抗PD1疗法组合的治疗的示意图。
具体实施方式
本公开内容提供了与用于治疗前列腺癌的组合疗法相关的组合物和方法。雄激素疗法和针对雄激素受体的疫苗(例如DNA疫苗)的特定组合出乎意料地并且协同地改善了用于治疗前列腺癌的功效ADT，包括转移性或去势抗性疾病。与单独的ADT相比，联合治疗导致肿瘤生长的显著降低。
一个实施方式中，用于在患有前列腺癌的对象中引发抗肿瘤应答的方法包括：向对象给予ADT并向对象给予针对雄激素受体的疫苗，其中疫苗以与单独的ADT治疗相比有效引发增加的对前列腺癌的抗肿瘤应答的量给予。这种增加的对前列腺癌的抗肿瘤应答导致前列腺癌细胞生长和/或转移的减少，抑制或延迟，延长对象存活。在一个实施方式中，与单独的ADT治疗相比，组合治疗的抗肿瘤应答导致肿瘤细胞生长的显著延迟。在一个实施方式中，疫苗是DNA疫苗，其包含编码雄激素受体或雄激素受体片段的多核苷酸。在另一个实施方式中，疫苗是包含雄激素受体或其片段的多肽疫苗。
在一个实施方式中，本公开内容提供了在患有前列腺癌的对象中引发抗肿瘤应答的方法，其包括：a.向对象给予雄激素剥夺疗法(ADT)；并且b.向对象给予重组DNA疫苗，所述重组DNA疫苗包含与转录调节元件操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码雄激素受体或雄激素受体的片段，其中所述ADT和重组DNA疫苗以有效引起对前列腺癌的抗肿瘤应答的量给予。
对象中的抗肿瘤应答包括减少、阻遏、延缓或防止肿瘤生长，减小肿瘤体积和/或防止、阻遏、延缓或减少肿瘤的转移。抗肿瘤应答包括减少对象体内肿瘤细胞的数量。在一些实施方式中，抗肿瘤应答包括对表达雄激素受体的肿瘤细胞的免疫反应，例如针对表达雄激素受体的细胞的细胞毒性免疫应答。例如，抗肿瘤应答可包括通过AR特异性CD8+ T细胞裂解肿瘤细胞。优选地，在有或没有体液免疫反应的情况下诱导针对雄激素受体的细胞免疫反应。
雄激素剥夺疗法(ADT)是降低雄激素激素水平或干扰雄激素受体功能/信号传导的疗法，例如通过使用雄激素受体途径靶向(例如抗雄激素)或化学去势来实现。雄激素剥夺疗法包括给予有效量的至少一种雄激素受体途径靶向药物。合适的药物是本领域技术人员已知的，包括但不限于LHRH(或GnRH)类似物(激动剂)，LHRH(或GnRH)拮抗剂，AR拮抗剂，雄激素合成抑制剂，其他AR降解或阻断剂，及其组合。合适的ADT包括用一种或多种下列药物治疗：
(a)AR拮抗剂，包括但不限于氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，恩杂鲁胺，阿帕他胺，醋酸环丙孕酮，醋酸甲地孕酮，醋酸氯地孕酮，螺内酯，坎利酮，屈螺酮，托瑞利胺(氟尿苷)，西咪替丁；
(b)雄激素合成抑制剂，包括但不限于，(i)5α-还原酶抑制剂，其包括非那甾胺，度他雄胺，α雌二醇和锯棕榈提取物的非限制性实例，(ii)CYP17A1(17α-羟化酶，17,20-裂解酶)抑制剂，其包括非限制性实例醋酸环丙孕酮，螺内酯，达那唑，孕三烯酮，酮康唑，醋酸阿比特龙；(iii)3β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂，其包括非限制性实例达那唑，孕三烯酮，醋酸阿比特龙；(iv)17β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂，其包括非限制性实例达那唑，辛伐他汀；(v)CYP11A1(胆固醇侧链裂解酶)抑制剂，其包括非限制性实例氨基戊二酰亚胺，达那唑；和(vi)HMG-CoA还原酶抑制剂，其包括非限制性实例他汀类药物(例如阿托伐他汀，辛伐他汀)；
(c)抗促性腺激素，包括(i)孕激素，例如非限制性实例，包括黄体酮，醋酸环丙孕酮，醋酸甲羟孕酮，醋酸甲地孕酮，醋酸氯地孕酮，螺内酯，屈螺酮；(ii)雌激素，包括雌二醇，乙炔雌二醇，己烯雌酚，共轭马雌激素的非限制性实例；(iii)GnRH类似物，例如GnRH激动剂，包括非限制性实例，布舍瑞林，德舍瑞林，戈那瑞林，舍瑞林，组氨瑞林，亮丙瑞林，萘法瑞林，曲普瑞林；GnRH拮抗剂，包括非限制性实例阿巴瑞克，西曲瑞克，地加瑞克，加尼瑞克；及其组合。例如，合适的ADT治疗包括但不限于AR拮抗剂比卡鲁胺(Casodex，)，阿帕他胺(ARN-509，Janssen)或恩杂鲁胺(Xtandi，)，GnRH拮抗剂地加瑞克(Firmagon，Ferring))，AR降解剂如加勒通(galeterone)(Tokai)等。在一些实施方式中，可以使用一种或多种合适的ADT药物，例如LHRH激动剂或拮抗剂与AR拮抗剂或降解剂的组合。
在一些实施方式中，雄激素剥夺疗法(ADT)导致大多数前列腺癌患者肿瘤中雄激素受体(AR)的过表达。虽然这种过表达可以促进肿瘤逃逸变体的发展，但是如本公开所讨论的，它还使前列腺肿瘤细胞更容易被AR特异性CD8+ T细胞裂解。实例在体外证明，前列腺肿瘤细胞中AR表达的增加可以在标准雄激素剥夺后发生，或在用市售AR拮抗剂比卡鲁胺(Casodex，)或恩杂鲁胺(Xtandi，)处理后进行。另外，实例在体内证明用地加瑞克(Firmagon，Ferring)(一种临床上用于雄激素剥夺疗法的GnRH拮抗剂)治疗导致MycCaP前列腺肿瘤模型中AR表达增加。值得注意的是，虽然单独使用地加瑞克治疗导致肿瘤生长延迟，但与单独使用地加瑞克治疗相比，将该治疗与靶向雄激素受体(pTVG-AR)的疫苗相结合导致肿瘤生长显著延迟。另外，在组合地加瑞克和pTVG-AR治疗后发生复发性疾病的动物中，肿瘤具有显著降低的AR表达，表明这可能是治疗失败的生物标志物。
使用多种AR靶向药剂进行雄激素剥夺的患者可以用针对雄激素受体的DNA疫苗免疫，例如pTVG-AR，从而改善对这些标准疗法的应答。改善的应答包括抑制或减少肿瘤细胞生长或转移和/或延迟肿瘤细胞生长或转移。
ADT可以通过本领域技术人员已知的任何合适的剂量和时间表递送。例如，非限制性实例包括单独的LHRH激动剂或与抗雄激素(例如比卡鲁胺或恩杂鲁胺)组合的LHRH激动剂。另一个非限制性实例是LHRH激动剂与阿比特龙和阿帕他胺的组合。
LHRH激动剂的合适剂量的非限制性实例包括，例如，每三个月亮丙瑞林20-25mg(例如22.5mg)肌内(IM)；和/或戈舍瑞林LHRH激动剂通常每三个月约9-12mg(例如10.8mg)皮下(sc)。LHRH拮抗剂的剂量的非限制性实例包括作为第一剂量的皮下地加瑞克240mg，和随后每28天皮下80mg；阿比特龙：每日口服1000mg；阿帕他胺：每日口服240mg；比卡鲁胺：每日口服50mg；和/或恩杂鲁胺：每日口服160mg。
在一些实施方式中，预期当与本发明所述的疫苗组合时，本领域已知和理解的ADT剂量或方案可能与常规参数不同(例如减少的剂量频率或量)。
用于本公开内容的方法的疫苗可以是编码雄激素受体或其片段的重组DNA疫苗或包含多肽雄激素受体或其片段的肽疫苗。用于本公开内容的方法的重组DNA疫苗可包含编码哺乳动物雄激素受体的多核苷酸，雄激素受体的配体结合结构域，或雄激素受体的片段。适用的重组DNA疫苗公开于题为“前列腺癌疫苗”的美国专利7,910,565和8,962,590中，它们通过引用全文并入本文。在一些实施方式中，重组DNA疫苗包含编码哺乳动物雄激素受体的多核苷酸，哺乳动物雄激素受体的片段，该片段包含配体结合结构域，或配体结合结构域的某些片段。当质粒DNA疫苗在体内直接体内导入对象如人时，其诱导对象内编码多肽的表达，并使对象的免疫系统对多肽具有反应性。疫苗可以是能够引发对编码的多肽的免疫应答的任何多核苷酸。
在一些实施方式中，DNA疫苗包含pTVG-AR(pTVG-AR或pTVG-ARLBD是相同的载体并且在本文中可互换使用)。pTVG-AR是包含插入pTVG4载体的人雄激素受体基因的配体结合结构域的编码序列的载体，以产生免疫载体pTVG-AR，如美国专利7,910,565中所公开的，该专利全文通过引用并入本文。
可以将疫苗给予对象以引发对象中针对雄激素受体的免疫应答。“有效量”或“免疫有效量”是指以单剂量或作为系列的一部分向对象给予该量有效诱导针对雄激素受体(并且因此，针对表达雄激素受体的细胞)的免疫反应。此外，本发明中考虑的“有效量”是增强或增加ADT的抗肿瘤功效的疫苗量，导致前列腺肿瘤生长和转移的延迟或抑制。
雄激素受体基因是已知的并且已从许多物种中克隆。例如，可以分别在GenBank登录号NM_000044(cDNA-SEQ ID NO：1和氨基酸序列-SEQ ID NO：2)，NM_013476(cDNA-SEQ IDNO：3和氨基酸序列-SEQ ID NO：4)，NM_012502(cDNA-SEQ ID NO：5和氨基酸序列-SEQ IDNO：6)，NM_001003053，NM_001009012，U94179和U94178中找到对应于cDNA以及氨基酸序列的人，小鼠，大鼠，狗，黑猩猩，猕猴和狐猴雄激素受体mRNA。来自其他物种的雄激素受体基因也是已知的。这些物种包括但不限于猪(Sus scrofa)，蓝宝口孵(Astatotilapiaburtoni)，原鸡(Gallus gallus)，花斑溪鳉(Kryptolebias marmoratus)，美国短吻鳄(Alligator mississippiensis)，猬白鳐(Leucoraja erinacea)，伯氏朴丽鱼(Haplochromis burtoni)，黑头呆鱼(Pimephales promelas)，欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)，食蚊鱼(Gambusia affinis)，细须石首鱼(Micropogonias undulates)，青鳉(Oryzias latipes)，黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)，牛蛙(Rana catesbeiana)，斑鬣狗(Crocuta crocuta)，红领美狐猴(Eulemur fulvus collaris)和日本鳗鲡(Anguillajaponica)(分别参见GenBank登录号NM_214314(或AF161717)，AY082342，NM_001040090，DQ339105，AB186356，DQ382340，AF121257，AY727529，AY647256，AB099303，AY701761，AB076399，AY219702，AY324231，AY128705，U94178和AB023960)。雄激素受体的配体结合结构域是本领域熟知的。为了本发明的目的，人雄激素受体的配体结合结构域是指从氨基酸位置651至681的任何氨基酸开始并终止于氨基酸位置900至920的任何氨基酸的多肽。例如，人雄激素受体或包含氨基酸681-900的人雄激素受体片段以及含有编码上述的多核苷酸的DNA疫苗是合适的疫苗。如本领域普通技术人员将容易认识到的，编码配体结合结构域或包括来自上述物种之一以及其他动物的全长受体的雄激素受体的较大片段的任何DNA序列适用于本发明。
药学上可接受的运载体是本领域普通技术人员熟知的(Arnon，R.(编)《合成疫苗I》(Synthetic Vaccines I)：83-92，CRC出版公司，Boca Raton，Fla.，1987)。它们包括适合用作载剂的液体介质，以将肽或多核苷酸引入患者体内，但本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体。这种液体介质的一个例子是盐水溶液。
此外，疫苗还可含有用于刺激免疫应答的佐剂，从而增强疫苗的效果。合适的佐剂是本领域已知的，包括但不限于GM-CSF，蒙塔尼(Montanide)或皂苷衍生物佐剂。
根据另一个实施方式，DNA疫苗包含与转录调节元件(例如，启动子，例如异源启动子)操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自以下的成员：(i)哺乳动物雄激素受体(例如，人雄激素受体)，(ii)雄激素受体的片段，其包含配体结合结构域，(iii)由SEQID NO：9定义的配体结合结构域的片段(LLLFSIIPV，SEQ ID NO：2的氨基酸811-819)；(iv)由SEQ ID NO：10(RMLYFAPDLV，SEQ ID NO：2的氨基酸761-770)定义的配体结合结构域的片段，(v)由SEQ ID NO：11(FLCMKALLL，SEQ ID NO：2的氨基酸805-813)定义的配体结合结构域的片段，和(vi)由SEQ ID NO：12定义的配体结合结构域的片段(QLTKLLDSV，SEQ ID NO：2的氨基酸859-867)，其中向对象给予所述疫苗诱导针对表达雄激素受体的细胞的细胞毒性免疫反应。
DNA疫苗可包含与转录调节元件直接连接的多核苷酸，所述转录调节元件促进对象细胞内蛋白质(例如雄激素受体或其片段)的表达。合适的转录调节元件(例如，启动子，例如异源启动子)是本领域已知的，并且包括但不限于CMV启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，猿猴病毒40(SV40)启动子，人延伸因子-1α(EF-1α)启动子，和人泛素C(UbC)启动子等。
疫苗适合通过皮内，肌肉内，皮下或血管内(包括静脉内和动脉内)给予哺乳动物如人。另一方面，DNA疫苗适于通过肌肉或皮肤电穿孔给药，以增加免疫部位DNA的摄取。
该疫苗可用于与ADT疗法相关的初免-加强策略，以诱导对雄激素受体的稳健和持久的免疫应答。基于重复注射相同抗原构建体的初免和加强疫苗接种方案是众所周知的并且导致强烈的CTL应答。一般来说，第一剂可能不会产生保护性免疫，但只能“引发”免疫系统。在第二剂或第三剂后产生保护性免疫应答。
本文所述的疫苗可以有效量提供以增强或增加ADT治疗的功效，这可通过延迟，减少或抑制前列腺肿瘤细胞生长或转移看出。
在一个实施方式中，疫苗可以用于常规的初免-加强策略，其中以多剂量向动物给予相同的抗原。在优选的实施方式中，DNA或肽疫苗用于一次或多次接种。这些加强根据常规技术进行，并且当与另一种疫苗，治疗或同源疫苗一起给予时，可以在给药方案，给药途径，佐剂选择，剂量和潜在序列方面凭经验进一步优化。
在一个实施方式中，疫苗每两周至每三个月给予一次。在一些实施方式中，疫苗给予持续至少6周，或者至少10周，或者至少15周，或者至少20周，或者至少25周，或者至少30周，或者至少35周，或者至少40周，或者至少45周，或者至少48周，或者至少50周，或者至少一年，或者至少18个月，或者至少20个月，并且可以包括其间的任何时间(例如，16周，17周，18周，19周，24周等)。在一些实施方式中，疫苗每两周给予持续约6至约14周，随后每季度给予持续至少一年。在一些实施方式中，疫苗每两周给予一次，持续约6至约14周，随后每季度给予一次，持续至少一年。在一些实施方式中，疫苗每两周给予持续约6至约14周，随后每季度(即每三个月)给予持续至少18个月。在一些实施方式中，疫苗每两周给予一次，持续约6至约14周，随后每季度(即每三个月)给予一次，持续至少18个月。
合适的DNA疫苗剂量是本领域已知的，并且包括但不限于每剂量约10mcg至约1mgDNA。
在一些实施方式中，ADT和重组疫苗同时给予。在其他实施方式中，用ADT处理对象，并随后用重组疫苗处理。ADT和重组疫苗给予之间的时间段可以是短时间(例如，数小时或数天)或可以是更长的时间(例如数周或数月)。在一些实施方式中，该术语同时表示两种组分在彼此接近的时间内(例如在数小时内或在同一天内)给药，但可以通过不同的给药途径给药(例如口服ADT和注射疫苗)给药。在一些实施方式中，给药是分开的，例如，在疫苗和ADT之间分开数小时或数天。在一些实施方式中，疫苗和ADT在相同的时间段内给予，但使用需要在不同日期给予的不同方案。本文更多地讨论了合适的方案，例如，在开始ADT剂量方案之前给予疫苗持续一段时间的方案。
在一些实施方式中，在雄激素剥夺疗法之前给予重组DNA疫苗。在一些实施方式中，在开始给予ADT之前每隔一周给予DNA疫苗持续2-24周，并且在一些实施方式中，在ADT治疗期间每2-16周持续给予DNA疫苗。不受任何理论的束缚，但在给予雄激素剥夺疗法之前给予DNA疫苗可导致优选的免疫和抗肿瘤应答，因为已经显示在免疫前给予ADT可能直接干扰引发T细胞应答。本领域技术人员将能够确定ADT和疫苗给予的优选方案。
在一些实施方式中，对象是哺乳动物，优选人。
在一些实施方式中，本公开内容的方法还包括向对象给予除针对雄激素受体疫苗外的有效量的检查点途径抑制剂以增强ADT治疗。在一个实例中，检查点途径抑制剂是PD途径抑制剂。合适的PD-途径抑制剂是本领域已知的。在一些实施方式中，PD途径抑制剂是抗PD-1阻断抗体或抗PD-L1抗体。
使用不同的肿瘤抗原系统，我们发现DNA疫苗接种可以引发肿瘤中的PD-L1表达，这是由于引发的肿瘤特异性T细胞分泌IFNγ。具体地，表达模型抗原的肿瘤在用编码该抗原的DNA疫苗免疫后具有增加的PD-L1表达(Rekoske，B.T.，H.A.Smith，B.M.Olson，B.B.Maricque，and D.G.McNeel.(2015).“PD-1或PD-L1阻断在SSX2表位修饰的DNA疫苗免疫后恢复抗肿瘤功效(PD-1 or PD-L1 Blockade Restores Antitumor EfficacyFollowing SSX2 Epitope-Modified DNA Vaccine Immunization).”Cancer ImmunolRes.3：946-55)。如果免疫经修改以引发具有更高PD-1表达的CD8+ T细胞，则这导致较差的抗肿瘤应答。
以下实施例证明，与AR靶向疫苗组合靶向PD-1/PD-L1途径可以减少或预防肿瘤介导的免疫抑制。在用AD处理并用pTVG-AR免疫的MycCaP荷瘤动物中，发现CD8+ T细胞具有升高的PD-1表达(图10A)。另外，一些复发性肿瘤具有升高的PD-L1表达(图10B)。与单独用pTVG-AR免疫相比，当AR靶向免疫与PD-1阻断抗体组合时，该治疗显著延迟了肿瘤生长(图10C)。此外，将ADT与AR定向免疫和PD-1阻断相结合进一步延迟了肿瘤生长(图10D)。因此，疫苗接种和ADT与抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗的组合导致更强的抗肿瘤应答并且可以根除肿瘤。添加抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗增强或增加对雄激素受体的免疫应答。例如，治疗方法的一个非限制性实例包括ADT与AR疫苗和抗PD-1抗体的组合，所述ADT包含LHRH，阿比特龙，阿帕鲁胺或其组合。
设想了许多不同的可能方案用于本发明的方法，包括使用本发明所考虑的双联组合(DNA疫苗和ADT)和三联组合疗法(DNA疫苗，PD-1途径抑制剂和ADT)的治疗方案。在这些情况下，双联和三联组合不必共同给予，并且可以仅在合适的剂量方案中在相同的时间段内给予。在其他实施方式中，每个疗法的开始是交错的，以提供最有效的治疗方案(例如在ADT治疗开始前给予至少2个或更多个疫苗剂量)。在一些实施方式中，治疗方法包括给予三联组合持续一段时间，然后给予双联组合持续第二段时间。在其他实施方式中，治疗方法包括给予双联组合的一段时间，然后给予三联组合疗法的一段时间。在其他实施方式中，治疗方法包括给予双联或三联组合的一段时间，该段时间包括在该时间段内不给予一种或多种治疗而维持其他治疗的时间段。例如，在DNA疫苗中，PD-1途径抑制剂可以在给予ADT之前每周或每两周给予持续2-12周，由此DNA疫苗，PD-1途径抑制剂和ADT全部给予持续至少12-48周，之后，ADT治疗可以停止一段时间，期间可以继续加强疫苗给药，并且使用或不使用PD-1途径抑制剂。在某些情况下，ADT治疗可能在数周至数月后重新开始。预期治疗，治疗时间和给药方案的其他合适组合由本领域技术人员确定。
在一些实施方式中，考虑了DNA疫苗和ADT的双联组合疗法。在一些实施方式中，DNA疫苗在ADT开始前每周或每两周给予至少一次(即，1至12次)。在ADT处理之前开始疫苗可能在引发免疫系统以使其针对表达雄激素受体的细胞而被激活方面具有一些优势，我们发现雄激素受体在ADT处理后肿瘤细胞中过表达。这允许对肿瘤细胞的更强大和增强的免疫应答，导致延迟或减少肿瘤生长。在一些实施方式中，ADT疗法在给予DNA疫苗之前开始，例如，在给予DNA疫苗之前持续至少一个月或更长时间。
在一些实施方式中，ADT给药也可以是间歇性的。在间歇性ADT给药期间，可以监测对象中的PSA数以确定是否应该停止和/或再次开始ADT治疗。例如，一旦PSA值降低到合适的水平并稳定，就停止ADT；并且当PSA数量再次增加时(有时几个月，也许几年后)，重新启动ADT。此外，DNA疫苗的使用可包括在第一年内定期(例如每2周至每3个月)给予疫苗以引发抗肿瘤应答然后偶尔(例如3个月或更长时间)给予疫苗作为维持加强剂以维持抗肿瘤免疫应答与连续或间歇性ADT给药相结合的剂量。
在一些实施方式中，DNA疫苗，PD-1途径抑制剂和ADT各自分别给予，并且各自在不同的重叠时间段内给予。在某些情况下，所有三种都在同一时间段内给予。在一些实施方式中，所有三种治疗在相同的时间段内持续但以不同的时间间隔给予。在一些实施方式中，不是持续给予所有三种治疗(例如，有一段时间不给予一种或多种治疗)。在一些实施方式中，每种治疗以不同剂量提供，所述剂量在治疗开始后的不同时间间隔开。例如，DNA疫苗可以在用PD-1途径抑制剂开始治疗之前和ADT治疗开始之前给药。在一些实例中，DNA疫苗可以每1-12周给予一次，持续至少6周或更长时间，例如每周一次或每隔一周一次持续1-24周，然后每3-8周一次持续至少另外24周或更长时间。在另一个实例中，DNA疫苗和PD-1途径抑制剂可以在ADT治疗开始之前以相同的给药方案给予(例如，每2周一次，持续6-36周，然后每4-6周一次，持续至少另外6-36周，然后每12-24周加强一次，至少再持续一年)。考虑了其他合适的给药方案组合。
在一些实施方式中，每种治疗的长度(DNA疫苗，PD-1途径抑制剂和ADT)和提供治疗的时间段持续至少一部分时间。在一些实施方式中，一种或多种治疗在相同的时间段内给予。例如，DNA疫苗，PD-1途径抑制剂可以在数月至数年的过程中以不同剂量和不同时间给予，而ADT可以通过已知方案在数月或数年的相同时间段的一些或全部内给予。
在一些实施方式中，DNA疫苗和PD-1途径抑制剂在ADT开始前以多剂量给予，并在ADT给予期间继续。在一些实施方式中，治疗组合如下给予：
疫苗和PD-1途径抑制剂每2-4周(例如2周)给药持续至少8至16周，然后每4周给予疫苗和PD-1途径抑制剂再持续至少8至16周，然后每12周(或每3个月)给予疫苗和PD-1途径抑制剂再持续至少24周；并且在疫苗开始和PD-1途径抑制剂开始给药后第10周和第14周之间开始给予ADT，并且每12周给予ADT持续至少4个额外治疗时间(即持续至少48周)。
在一个优选的实施方式中，疫苗是针对雄激素受体的DNA疫苗，并且PD-1途径抑制剂是抗PD-1抗体，并且ADT是亮丙瑞林贮库22.5mg肌内给药或戈舍瑞林10.8mg皮下给药。合适的剂量方案如图16所示，其中DNA疫苗和PD-1途径抑制剂在前12周每2周给予一次，然后每4周给予再持续12周，随后每12周给予再持续至少24-48周。在该剂量方案中，在初始疫苗/PD-1抑制剂治疗后12周，24周，36周和48周给予ADT。该方案可以延长至至少一年或更长时间以治疗肿瘤。
在一些实施方式中，本公开提供提高患有前列腺癌的对象中雄激素剥夺疗法的功效的方法，包括向对象给予有效量的重组DNA疫苗，所述重组DNA疫苗包含与转录调节元件操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码雄激素受体或雄激素受体的片段，其中该方法抑制，延迟或减少前列腺癌的生长。在一些实施方式中，该方法还包括向对象给予有效量的PD-途径抑制剂。
该对象可能先前已被诊断为患有前列腺癌。在一些实施方式中，前列腺癌可以处于任何阶段，例如，早期前列腺癌或新诊断的前列腺癌。在一些实施方式中，前列腺癌可以是转移性前列腺癌。在另一个实施方式中，前列腺癌是去势抗性前列腺癌(mCRPC)。
一些实施方式提供用于治疗前列腺癌的药盒。该药盒包含雄激素剥夺疗法和引发抗雄激素受体免疫应答的疫苗(例如DNA疫苗)。还可提供关于给予ADT和重组DNA疫苗的剂量和方案的一套说明书。在一些实施方式中，雄激素受体疗法由一种或多种通过干扰AR表达或信号传导靶向AR途径的药物组成。上面讨论了合适的疫苗和药物。
在另一个实施方式中，所述药盒包含雄激素剥夺疗法，引发抗雄激素受体免疫应答的疫苗(例如DNA疫苗)和PD-1途径抑制剂(例如PD-1抗体)。可以提供关于每种治疗的剂量和方案的一套说明书。
在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本发明。本公开中引用的每篇出版物，专利和专利公开均通过引用全文并入本文。
实施例1
雄激素剥夺增加雄激素受体(AR)表达并增强肿瘤细胞对AR特异性T细胞应答的易感性
该实施例证明，雄激素剥夺导致肿瘤细胞(22Rv1细胞)中全长AR表达增加，无论剥夺持续短期还是长时间。AR肽特异性CD8+ T细胞与表达HLA-A2的肿瘤细胞的共培养导致细胞因子表达、细胞毒性测定和T细胞活化的增加。
材料和方法
细胞培养
从ATCC获得22Rv1，LNCaP，PC3和DU145细胞，并通过DDC医学公司(DDC Medical)确认它们的种类和无支原体污染。将细胞在含有200U/mL青霉素/链霉素，1mM丙酮酸钠，和0.1mMβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中培养。该基础培养基补充有10％完全FCS(RPMI/FCS)或10％活性炭处理的血清(RPMI/CSS)以产生雄激素剥夺的培养基。通过将葡聚糖包被的炭与热灭活的FCS一起孵育并在4℃孵育过夜，然后离心和无菌过滤，然后通过Testosterone AccuBind ELISA(Monobind)分析睾酮，产生活性炭处理的血清。
雄激素受体酶联免疫吸附试验(ELISA)
收集培养的前列腺癌细胞，制备细胞裂解物，并使用PathScan雄激素受体(AR)ELISA按照制造商的说明书(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))分析蛋白质表达。简而言之，将微孔条(预包被抗AR抗体)用2mg/mL蛋白质裂解物一式三份包被，并在4℃孵育过夜。第二天，使用检测抗体，然后使用HRP连接的二抗和TMB底物显色来检测AR。产生使用纯化的AR LBD蛋白(英杰公司(Invitrogen))的标准曲线，并用于获得每mg细胞裂解物的相对AR浓度。
雄激素受体定量实时PCR
收集培养的前列腺癌细胞，使用Qiagen RNeasy RNA纯化系统制备RNA，使用常规浓度的RNA使用iScript cDNA合成药盒(伯乐公司(BioRad))合成cDNA，并作为使用SsoFastqPCR超混合物(伯乐公司)的qPCR反应的模板。使用Bio-Rad MyiQ热循环仪进行反应，使用60℃的退火温度和40个循环。引物组：
AR-FL_Fwd(ACATCAAGGAACTCGATCGTATCATTGC)(SEQ ID NO：7)；
AR-FL_Rev(TTGGGCACTTGCACAGAGAT)(SEQ ID NO：8)；
AR-V7_Fwd(CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC)(SEQ ID NO：13)；
AR-V7_Rev(TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT)(SEQ ID NO：14)；
β-肌动蛋白_Fwd(TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT)(SEQ ID NO：15)；
β-肌动蛋白_Rev(CTTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG)(SEQ ID NO：16)。
通过2-ΔCt方法相对于β-肌动蛋白作为对照基因分析结果，并且使用如[6]所公开的2-ΔΔCt方法计算FCS处理的细胞的诱导倍数。
表达HLA-A2的22Rv1细胞的产生和验证
将在RPMI/FCS或RPMI/CSS中培养超过6个月的22Rv1细胞以50个细胞/孔的浓度稀释到96孔平底板中，并用编码人HLA-A2复合物的慢病毒转染。扩增细胞，用HLA-A2-FITC(白乐津公司(Biolegend))染色，并分选HLA-A2+事件(FACSAria细胞分选仪，BD生物科学公司(BDBiosciences))。扩增HLA-A2+22Rv1/FCS和22Rv1/CSS细胞，如上所述验证AR蛋白和mRNA表达，并通过流式细胞术评估HLA-A2和PD-L1表达。
小鼠免疫学分析
对于小鼠免疫学研究，HHDII-DR1杂合小鼠在右后腹侧皮下免疫与200μl完全弗氏佐剂(西格玛公司(Sigma))一起给予的100μg的AR811肽，如公开的(Olson等，CancerImmunol，Immunother.(2011)，33：639-647)。七天后，收集脾细胞，用AR811肽再刺激6天，并将细胞用于细胞内细胞因子染色测定和细胞毒性测定。对于细胞内细胞因子染色，用仅培养基、2000个22Rv1/FCS细胞、2000个22Rv1/CSS细胞或PMA/离子霉素阳性对照刺激200,000个脾细胞持续18小时。用莫能菌素(GolgiStop，2μM，BD生物科学公司)在37℃/5％CO2下处理细胞4小时。然后用荧光标记的CD3，CD4，CD8和CD69抗体对细胞染色，固定和透化后，使用荧光标记的IFNγ和TNFα抗体(BD生物科学公司)或相应的同种型对照进行细胞内染色。随后使用LSR II流式细胞仪(BD生物科学公司)分析细胞，并通过门选CD3+CD8+脾细胞并分析该群体的IFNγ和/或TNFα表达，以及表面CD69表达来分析事件。如先前所述(Smith等，Canc.Res.(2011)，71：6785-6795)进行细胞毒性测定。简言之，将再刺激的脾细胞与22Rv1/FCS或22Rv1/CSS靶细胞系一起培养4-6小时，之后使用Cytotox 96 Assay kid(普洛麦格公司(Promega))的变体计算LDH释放。从所有值中减去仅由介质贡献的光密度(OD)信号。所有样品条件一式三份进行评估，显示标准误差。
人免疫学分析
对于人免疫学研究，如先前所述(Olson等，Cancer Immunol，Immunother.(2011)，33：639-647)产生人T细胞培养物。简言之，来自HLA-A2+前列腺癌患者的PBMC样品用经辐照的肽脉冲的抗原呈递细胞(自体DC，PBMC或淋巴母细胞B细胞系)培养。24小时后，用10U/mLIL-2处理细胞，每周用经辐照的肽脉冲的APC再刺激，并且在2-8次体外刺激后，使用细胞毒性测定法测试培养物的溶细胞活性。随后将AR805肽特异性T细胞用于细胞内细胞因子染色测定和细胞毒性测定。对于细胞内细胞因子染色，如上进行测定，但使用荧光标记的抗体用于细胞内IFNγ，TNFα，IL-2和颗粒酶B(GrB)，或相应的同种型对照。随后使用LSR II流式细胞仪分析细胞，并通过门选CD3+CD8+ T细胞并分析该群体的IFNγ，TNFα，IL-2和/或GrB的表达，以及表面CD69和CD107a表达分析事件。如上文和先前所述(Smith等，Canc.Res.(2011)，71：6785-6795)进行细胞毒性测定。
结果
雄激素剥夺在体外增加一些前列腺癌细胞系中的AR蛋白表达。DU145，PC3，LNCaP和22Rv1细胞在充满雄激素(FCS；补充有完全FCS的培养基)或雄激素剥夺(CSS；活性炭处理的血清)条件下培养1，3，5或7天或至少三个月(LT；长期)。收集蛋白质裂解物并通过ELISA分析AR蛋白表达，如图1A-D所示。*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
雄激素剥夺诱导AR-V7mRNA表达的瞬时增加和全长AR mRNA的持续过表达。将22Rv1细胞在雄激素充足或雄激素剥夺的条件下培养1，3，5或7天或至少3个月。分离RNA并用于合成cDNA，并将eDNA用作qRT-PCR反应的模板，用于全长AR(图2A和2C，左图)或AR-V7(图2B和2D，右图)表达。上图：相对表达(标准化为β-肌动蛋白对照)。下图：在长期FCS培养的22rv1细胞上的表达诱导倍数。*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
与雄激素充足条件下培养的细胞相比，ARLBD肽特异性T细胞具有增加的T细胞活化水平，Th1多功能细胞因子表达，和对雄激素剥夺的前列腺癌细胞的细胞毒性。22Rv1细胞在雄激素充足(FCS)或雄激素剥夺(CSS)条件下培养超过6个月，用编码HLA-A2的慢病毒转染，并通过流式细胞术分选表达HLA-A2的细胞。随后通过ELISA评估22Rv1/FCS和22Rv1/CSS细胞系(或非HLA-A2转染的22Rv1对照)的AR蛋白表达(图3A)，通过qRT-PCR评估RNA表达(图3B)，通过流式细胞术评估HLA-A2表达(图3C)和PD-L1表达(图3D)(蓝色：22Rv1/FCS；红色：22Rv1/CSS；黑色：野生型22Rv1；灰色：IgG染色的22Rv1)。*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
当暴露于雄激素剥夺的22Rv1细胞时，AR811肽免疫的小鼠具有增加的细胞因子表达，T细胞活化和细胞毒性。评估来自AR811肽免疫的HHDII-DR1杂合小鼠的脾细胞针对表达HLA-A2的22Rv1/FCS或22Rv1/CSS细胞的免疫应答。图4A-B显示用22Rv1/FCS(图4A)或22Rv1/CSS(图4B)培养的脾细胞的细胞内细胞因子染色。图4C描绘了用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的脾细胞的CD69表达(插图中定量的平均荧光强度-*表示通过斯氏t检验的p＜0.05)。图4D描绘了用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的脾细胞的细胞毒性。
当暴露于雄激素剥夺的22Rv1前列腺癌细胞时，显示人AR805肽特异性T细胞具有增加的T细胞活化水平，Th1多功能细胞因子表达，和细胞毒性。评估AR805肽特异性T细胞(先前从HLA-A2+前列腺癌患者的外周血培养(Smith等，Canc.Res.(2011)，71：6785-6795)对表达HLA-A2的22Rv1/FCS或22Rv1/CSS细胞的免疫应答。图5A显示了用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的脾细胞的CD69表达(在相邻条形图中定量-*表示通过斯氏t检验p＜0.05)。图5B显示用22Rv1/CSS(右图)或22Rv1/FCS(左图)细胞培养的T细胞的细胞内细胞因子染色(TNFα的IFNγ)。图5C显示发现表达零(蓝色)，一个(绿色)，两个(黄色)，三个(橙色)或四个(红色)Th1相关分子(IFNγ，TNFα，IL-2和/或颗粒酶B)的CD8+ T细胞的频率。图5D显示用22Rv1/FCS(红色)或22Rv1/CSS(蓝色)细胞培养后CD8+ T细胞的颗粒酶B表达(在相邻条形图中定量-*表示通过斯氏t检验p＜0.05)。图5E显示表达表面脱粒标记物CD107a的CD8+ T细胞的频率。图5F显示用22Rv1/CSS(蓝色)或22Rv1/FCS(红色)细胞培养的T细胞的细胞毒性。
因此，雄激素剥夺增加雄激素受体表达并导致前列腺肿瘤细胞对AR特异性T细胞的易感性增加。
实施例2
评估编码AR-LBD的DNA疫苗与雄激素剥夺疗法的组合的I期临床试验
图6A描绘了临床试验。最近(在1-6个月内)开始雄激素剥夺疗法(ADT)的患有转移性前列腺癌的男性参加了评估编码AR LBD的DNA疫苗(pTVG-AR)的安全性和免疫原性的临床试验。该试验寻求利用通过将ADT与pTVG-AR相结合来靶向针对ADT(过表达AR)抗性的最常见机制之一，理想地导致延迟发展成去势抗性疾病(CRPC)的时间(蓝色虚线)。图6B描绘了该研究的不同ARMS。患者接受6次每两周进行的免疫接种，然后每季度接受加强免疫，或每10周两次每两周进行的免疫，单独或与GM-CSF组合。免疫接种持续18个月或持续至疾病进展。主要终点是安全性和ARLBD特异性免疫。该试验的次要目标包括评估哪种免疫方案能够最好地引发长期ARLBD特异性T细胞应答，GM-CSF产生免疫应答的效果，以及确定PSA进展的中位时间和18个月PSA无进展生存期。
实施例3
AD治疗后在人和小鼠前列腺组织中出现AR过表达，并增强其被AR特异性T细胞识别。
雄激素剥夺的22Rv1人前列腺癌细胞和去势抗性的MycCaP小鼠前列腺癌细胞在ADT处理后具有增加的AR表达(图7A和7B)。我们还显示这发生在体内MycCaP前列腺癌模型中，因为使用GnRH拮抗剂地加瑞克的化学去势导致肿瘤中AR表达增加(图7C)。这种增加的AR表达还使这些肿瘤细胞被AR特异性CD8+ T细胞更好地识别，因为当与雄激素剥夺的肿瘤细胞一起培养时，T细胞具有更高水平的活化，细胞因子表达和细胞毒性(图7D)。
简言之，收集在雄激素充足(FCS)或雄激素剥夺(CSS)条件下培养的人22Rv1前列腺癌细胞(图7A)，或在未处理(MycCaP/AS)或去势(MycCaP/CR)小鼠中连续传代的小鼠MycCaP细胞(图7B)，并通过qPCR(左图)，ELISA(中图)和细胞内染色(ICS，右图)分析AR表达。图7C，用MycCaP/AS肿瘤细胞攻击FVB小鼠，并给予地加瑞克或假处理。在生长时，收集肿瘤并通过细胞内流式细胞术分析AR表达(实例直方图，其中样品用IgG或AR-细胞内抗体染色；在右图中定量)。图7D，AR特异性CD8+ T细胞与22Rv1/FCS或22Rv1/CSS细胞一起培养，并通过CD69表达(左图)，IFNγ和TNFα细胞因子表达(中图)，和细胞毒性(右图)评估T细胞活化。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
实施例4
具有AR定向免疫的AD增加抗肿瘤免疫应答并延迟肿瘤复发
该实验证明AD与AR定向免疫的组合增加了抗肿瘤免疫应答。用地加瑞克(ADT处理)处理随后用pTVG-AR DNA疫苗每周一次免疫的MycCaP荷瘤FVB小鼠与对照相比具有增强的针对雄激素剥夺的肿瘤细胞的免疫应答和前列腺癌再生延迟(图8)。简言之，向雄性FVB小鼠(n＝8)植入MycCaP肿瘤，用地加瑞克(或假手术)治疗，并每周用pTVG-AR或对照pTVG4免疫。图8A，通过细胞内细胞因子染色收集并针对MycCaP/CR肿瘤细胞的免疫应答分析的脾细胞(左图)并且测量来自pTVG-AR免疫小鼠的AR肽刺激的脾细胞裂解MycCap/AS对比MycCap/CR肿瘤细胞的能力(右图)。图8B描绘了跟踪肿瘤体积的小鼠。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。图8C描绘了对照(假)，地加瑞克+pTVG4和地加瑞克+pTVG-AR在攻击后的肿瘤体积。
实施例5
雄激素剥夺后前列腺癌细胞中雄激素受体表达增加，增加雄激素受体特异性T细胞的识别
该实施例再次证明雄激素剥夺在体内和体外增加人和鼠前列腺肿瘤细胞中的AR表达，其随时间持续存在。增加的AR表达与AR特异性T细胞的识别和溶细胞活性增加有关。此外，ADT结合疫苗接种，使用编码AR的配体结合结构域的DNA疫苗，导致改善的抗肿瘤应答，如通过两种鼠前列腺癌模型(Myc-CaP和前列腺特异性PTEN缺陷小鼠)中肿瘤体积和去势抗性前列腺肿瘤的出现延迟而测量所示。该数据支持，通过特异性靶向抗性的主要机制(AR的过度表达)，将ADT与AR定向免疫疗法相结合比ADT与其他免疫治疗方法相结合具有益处。
实施例5的材料和方法
小鼠和细胞系
人前列腺癌细胞从ATCC获得并在含有200U/mL青霉素/链霉素，1mM丙酮酸钠，和0.1mM β-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中培养。DDC医学公司(俄亥俄州费尔菲尔德(Fairfield，OH))证实细胞种类和支原体测试。先前已经描述了Myc-CaP/AS或Myc-CaP/CR细胞(最初由Charles Sawyers生成的Myc-CaP亲本系的雄激素敏感和去势抗性变体)和培养条件(22)。针对雄激素充足或雄激素剥夺的条件，将人和小鼠细胞系维持在10％完全胎牛血清(FCS)或活性炭处理的血清(CSS)中。
使用Myc-CaP肿瘤细胞的肿瘤研究在野生型雄性FVB小鼠(杰克逊实验室公司(Jackson Laboratory)，缅因州巴港)中进行。如已描述的那样，通过将Pten floxed(loxp/loxp)动物与Probasin-Cre(PB-Cre4+)杂交产生PTEN敲除小鼠(23)。通过PCR筛选小鼠的floxed或野生型PTEN等位基因(正向引物：CAA GCA CTC TGC GAA CTG AG；反向引物：AAGTTT TTG AAG GCA AGA TGC)和PB-Cre转基因(正向引物：CTG AAG AAT GGG ACA GGC ATTG；反向引物：CAT CAC TCG TTG CAT CGA CC)。将小鼠维持在无菌条件下，并且所有实验均在IACUC批准的方案下进行。
肿瘤研究
用106个Myc-CaP/AS肿瘤细胞皮下接种FVB小鼠，并且每天跟踪是否存在可触知肿瘤。一旦肿瘤可触知，每四周用地加瑞克(25mg/kg)或载剂假处理经皮下处理小鼠。对于免疫研究，将地加瑞克处理的动物随机分配进行免疫：在接受地加瑞克后一天开始每周用100μg pTVG4或pTVG-AR免疫。每周测量肿瘤生长至少三次，并按照我们已公开的(19)计算肿瘤体积。在处死时，收集肿瘤和脾脏。对于使用PTEN缺陷小鼠的研究，动物在20周龄(+/-两周)开始接受地加瑞克(25mg/kg)，然后在ADT后一天开始每两周用100μg pTVG4或pTVG-AR免疫。在收集组织之前，处理动物直至40周龄(+/-两周)。
雄激素受体酶联免疫吸附试验(ELISA)
收集培养的前列腺癌细胞，制备细胞裂解物，并使用PathScan雄激素受体(AR)ELISA按照制造商的说明书(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)，马萨诸塞州丹弗斯)分析蛋白质表达。简而言之，将微孔条(预包被抗AR抗体)用2mg/mL蛋白质裂解物一式三份包被，并孵育过夜。使用检测抗体，然后使用HRP连接的二抗和TMB底物显色来检测AR。产生使用纯化的AR LBD蛋白(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的标准曲线，并用于确定每mg细胞裂解物的相对AR浓度。
流式细胞术
对于雄激素受体细胞内染色，经解离的肿瘤样品的细胞用活/死GhostDye 780活/死染色(Tonbo生物科学公司，加利福尼亚州圣迭戈)和CD45(克隆30-F11，Tonbo生物科学公司)染色，并用针对雄激素受体配体结合结构域(克隆EP670Y，阿柏堪穆公司(Abcam)，英国剑桥)和氨基末端结构域(克隆D6F11，细胞信号传导技术公司)抗体，或同种型对照进行细胞内染色。对于HLA-A2和PD-L1表达，细胞用HLA-ABC(克隆W6/32，eBioscience，加利福尼亚州圣迭戈)和PD-L1(克隆MIH-5，eBioscience)抗体染色。
雄激素受体定量实时PCR
收集前列腺肿瘤细胞(细胞系或解离的肿瘤)，制备RNA(RNeasy RNA纯化系统；凯杰公司(Qiagen)，德国希尔登)，用于合成cDNA(iScript cDNA合成药盒；伯乐公司，加利福尼亚州赫尔克里斯)，并用作使用SsoFast qPCR超混合物(伯乐公司)的qPCR反应的模板。使用Bio-Rad MyiQ热循环仪进行反应，使用60℃的退火温度和40个循环。引物组：
全长人雄激素受体
正向：ACATCAAGGAACTCGATCGTATCATTGC，SEQ ID NO7；
反向：TTGGGCACTTGCACAGAGAT，SEQ ID NO：8，
AR-V7
正向：CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC，SEQ ID NO：13；
反向：TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT，SEQ ID NO：14，
全长小鼠AR
正向：GGACCATGTTTTACCCATCG，SEQ ID NO：17；
反向：ATCTGGTCATCCACATGCAA，SEQ ID NO：18，
小鼠AR-V2
正向：GGACCATGTTTTACCCATCG，SEQ ID NO：17；
反向：TTGTTGTGGCAGCAGAGTTC，SEQ ID NO：19，
小鼠AR-V4
正向：GGACCATGTTTTACCCATCG，SEQ ID NO：17；
反向：AAGTGGGGAACCACAGCAT，SEQ ID NO：20，和
β-肌动蛋白
正向：TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT，SEQ ID NO：15；
反向：CTTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG，SEQ ID NO：16)(24-26)。
结果通过2-ΔCt方法分析，相对于β-肌动蛋白作为对照基因，如公开的那样(26)。
免疫测定
为了研究免疫应答，如前所述收集人T细胞系或脾细胞(20)，并用于细胞内细胞因子染色测定和细胞毒性测定。对于细胞内细胞因子染色，用仅培养基，ARLBD肽库(15聚体肽库，重叠11个残基，并覆盖AR LBD的整个序列；LifeTein，新泽西州萨默塞特)，肿瘤细胞，或PMA/离子霉素阳性对照刺激细胞18小时。使用可固定的活/死标记物(Tonbo生物科学公司)以及细胞外和细胞内抗体对细胞进行染色。人抗体：CD3(克隆UCHT1，BD生物科学公司)，CD4(克隆RPA-T4，BD生物科学公司)，CD8(克隆RPA-T8，eBioscience)，CD69(克隆FN50，BD生物科学公司)，CD107a(克隆H4-A3，BD)生物科学公司)，IL2(克隆MQ1-17H12，eBioscience)，IFNγ(克隆4S.B3，白乐津公司，加利福尼亚州圣迭戈)，TNFα(克隆MAb11，BD生物科学公司)，GrB(克隆GB11，BD生物科学公司)。小鼠抗体：CD3(克隆17A2，BD生物科学公司)，CD4(克隆GK1.5，BD生物科学公司)，CD8(克隆53-6.7，BD生物科学公司)，CD45(克隆30-F11，BD生物科学公司)，CD69(克隆H1.2F3，eBioscience)，IFNγ(克隆XMG1.2，BD生物科学公司)，TNFα(克隆MP6-XT22，BD生物科学公司)。随后使用LSR II或Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)分析细胞，并通过门选CD3+CD4+或CD3+CD8+细胞并分析该群体的CD69，CD107a，IFNγ，TNFα，IL2和/或GrB的表达分析事件。如前所述进行细胞毒性测定(20)。简言之，用ARLBD肽库再刺激脾细胞5天，并与肿瘤细胞系一起培养，之后使用Cytotox 96试验药盒(普罗麦格公司，威斯康星州麦迪逊)计算LDH释放，如先前公开的(19)。
免疫组化
如已描述的那样，通过免疫组化对石蜡包埋的MycCaP肿瘤进行CD3表达染色(20)。用一抗(CD3：克隆SP7，阿柏堪穆公司)染色切片，使用LSAB+System-HRP(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，美国加利福尼亚州圣克拉拉)和金属增强DAB底物药盒DAB金属浓度(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)显色，使用Olympus BX51荧光显微镜(奥林巴斯公司(Olympus)，伊利诺伊州隆巴德)与SPOT RT分析软件(SPOT成像方案公司(SPOT Imaging Solutions)，密歇根州斯特灵海茨)组合成像，并通过每10x视野中CD3+细胞的频率进行定量，由盲法研究者对每只动物的每个肿瘤切片计算至少5个视野。
正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像
所有小鼠静脉内给予5-8MBq的124I-CLR1404，然后在注射后96小时进行微正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(PET/CT)扫描。在扫描期间，用2％异氟烷吸入气体混合1L/分钟的纯氧(27)来麻醉小鼠。用西门子Inveon Hybrid microPET/CT(西门子医疗方案公司(Siemens Medical Solutions)，田纳西州诺克斯维尔)在俯卧位扫描小鼠。收集每只小鼠4千万个计数用于PET扫描以获得足够的信噪比。将PET数据直方图编码为一个静态帧，随后使用三维的有序子集期望最大化(OSEM)，然后是最大后验算法重建，并且基于NEMA NU 4图像质量参数应用CT衰减和散射校正(28)。
所有PET和CT图像都是共同注册的。使用由西门子Inveon研究工作站(西门子医疗方案公司)提供的通用分析工具分析图像数据。数据是相同的窗口/水平，并根据每只动物的衰变校正注射活动进行缩放。基于PET和CT图像，在每个肿瘤周围绘制感兴趣的参考体积(VOI)，并在肌肉和肝脏上绘制单独的背景组织VOI。调整参考肿瘤VOI内的VOI阈值以包括大于最大信号的百分之六十的所有信号。数据报告为通过组织VOI的质量(％ID/g组织)标准化的注射剂量百分比，假设所有组织密度类似于水(1g/mL)。然后将数据在治疗前和治疗后组内平均，并标准化至背景组织值。
结果
雄激素剥夺增加雄激素受体表达并增强对雄激素剥夺的前列腺肿瘤细胞系的AR特异性T细胞应答
在该实施例中，一组六个前列腺细胞系(两个永生化前列腺上皮细胞系，两个雄激素非依赖性前列腺癌细胞系，和两个雄激素依赖性前列腺癌细胞系)在雄激素剥夺培养基中培养短期(一至七天)或长期(超过6个月)并分析AR表达。通过定量ELISA(图11A)，以及使用针对配体结合结构域和氨基酸-末端结构域的抗体进行细胞内染色(图11B，AR分子的幅度和频率分别在图11C和11D中定量)，发现雄激素剥夺导致雄激素依赖性前列腺肿瘤细胞中AR蛋白表达增加。对22Rv1细胞(已知表达AR-V7，AR-V7是一种LBD损失剪接变体)的分析表明，雄激素剥夺导致全长AR的表达稳定增加以及AR-V7的瞬时增加(图11E)，没有可检测到的AR-V1，AR567es或其他剪接变体的表达)。然而，与全长AR转录物相比，AR-V7表达水平明显较低。
为了确定雄激素剥夺后AR表达的这种增加是否导致增强的针对这些肿瘤细胞的AR特异性T细胞效应功能，首先转染22Rv1细胞以表达HLA-A2作为模型MHC分子，并且其中一个受AR限制表位先前已被鉴定(19)。在产生该细胞系后，在这些表达HLA-A2的细胞系中证实了在亲本细胞系中观察到的雄激素剥夺后增加的AR蛋白和RNA表达(图11F-G)。然后将这些22Rv1/FCS和22Rv1/CSS细胞与对HLA-A2限制性AR805表位特异的T细胞系一起孵育。与在雄激素充足条件下培养的22Rv1细胞刺激的T细胞相比，用22Rv1/CSS细胞系培养的T细胞显示具有更高水平的T细胞活化(通过CD69表达测量-图12A)，以及Th1细胞因子的表达增加(图12B)，包括具有多功能细胞因子表达的CD8+ T细胞(图12C)。与22Rv1/CSS细胞的共培养还导致颗粒酶B(图12D)，脱粒标志物CD107a(图12E)的更高表达，以及与22Rv1/FCS细胞共培养物相比增加的细胞毒性(图12F)。使用来自用另一种HLA-A2限制性表位AR811直接免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞的类似研究，在与雄激素剥夺的表达HLA-A2的22Rv1细胞培养时增加的细胞因子表达，T细胞活化和细胞毒性方面重复这些结果(图12G)。T细胞识别和细胞毒性的这些差异可能不是由于MHC I类和PD-L1表达的改变，因为22Rv1/CSS和22Rv1/FCS细胞表达相同水平的HLA-A2和PD-L1(图11H-I)。
雄激素剥夺在体外和体内增加Myc-CaP肿瘤细胞中的AR表达
我们以前使用TRAMP小鼠模型来研究靶向AR的疫苗对肿瘤发展和进展的影响(20)。然而，先前已报道TRAMP小鼠和许多其他鼠前列腺肿瘤模型的雄激素剥夺导致AR丧失和神经内分泌肿瘤的发展(29)。因此，我们试图评估更能代表人类前列腺癌的其他模型，这些模型在雄激素剥夺后继续表达AR。一种这样的模型是Myc-CaP细胞系，其模拟人类疾病，因为它在去势后维持AR表达(22)。为证实这一点，研究了雄激素敏感的Myc-CaP细胞(Myc-CaP/AS，由未经处理的FVB小鼠产生)和去势抗性的Myc-CaP细胞(Myc-CaP/CR，由Myc-CaP/AS细胞系通过去势小鼠连续传代产生)。与在人前列腺癌细胞系中观察到的相似，与Myc-CaP/AS细胞系相比，通过定量ELISA(图13A)和细胞内染色(图13B)发现Myc-CaP/CR细胞系具有增加的全长AR表达。虽然RNA转录物的分析显示鼠AR剪接变体mAR-V2和mAR-V4的增加，但这些剪接变体的表达类似地比全长AR低数倍(图13C)。为了研究体内AR的表达，用Myc-CaP/AS细胞接种FVB小鼠，然后通过给予GnRH拮抗剂(地加瑞克)进行假处理或去势。跟踪动物的肿瘤生长(图13D)，收集复发的肿瘤，并通过细胞内染色分析CD45-细胞的AR表达。发现在雄激素剥夺后复发的肿瘤在具有可检测的AR表达的CD45-细胞的频率以及这些细胞内AR表达的幅度方面都具有增加的AR表达(图13E)。
用pTVG-AR免疫延迟雄激素剥夺后去势抗性前列腺肿瘤的生长
该实施例还证明雄激素剥夺与AR靶向疫苗接种组合通过特异性靶向过表达AR的细胞延迟去势抗性肿瘤的生长。给小鼠植入Myc-CaP/AS肿瘤，对已建立肿瘤的小鼠给予假处理或地加瑞克。然后将用地加瑞克处理的小鼠随机地用编码AR LBD的DNA疫苗(pTVG-AR)或空载体对照(pTVG4)进行免疫。与用地加瑞克和对照疫苗处理相比，发现用地加瑞克和pTVG-AR的组合治疗延迟了肿瘤生长(图14A-B)。此外，当评估动物对Myc-CaP/AS或Myc-CaP/CR细胞系的免疫应答的证据时，发现用pTVG-AR免疫的动物在细胞因子表达(图14C)以及细胞毒性(图14D)方面对去势抗性细胞系都具有增强的免疫应答。在平行研究中，我们发现用pTVG-AR对携带Myc-CaP/AS的小鼠的免疫导致肿瘤浸润CD3+T细胞的频率增加，并且当接种疫苗与地加瑞克处理相结合时，该频率进一步增加(图14E)。
雄激素剥夺增加PTEN缺陷肿瘤中的AR表达，并且用pTVG-AR免疫与ADT联合，减少去势抗性肿瘤的生长
作为人前列腺癌的另外的相关模型，该实施例使用PbCre PTENfl/fl小鼠，其中Cre重组酶的前列腺特异性表达驱动PTEN肿瘤抑制的缺失和原发性前列腺肿瘤的形成。PTEN-CaP8细胞系(衍生自这些原发性肿瘤之一)类似地在雄激素充足或雄激素剥夺培养基中培养。如图15A-B所示，雄激素剥夺导致AR蛋白表达显著增加，类似于上述人前列腺癌细胞系和Myc-CaP细胞系。然后对20周龄的PbCre+PTENfl/fl小鼠给予假处理，或地加瑞克与pTVG-AR疫苗或载体对照的组合。为了非侵入性地监测肿瘤生长，以及在治疗前使动物随机化，我们利用microPET/CT成像，采用新型放射性示踪剂124I-CLR1404，它是迄今为止已在＞95％的恶性模型中显示选择性肿瘤摄取的放射性碘化烷基磷酸胆碱(APC)类似物(30)。静脉内给予动物124I-CLR1404，随后在治疗完成和开始前一周内扫描PET/CT(图15C)，并分析成像结果的平均和最大肿瘤摄取。肿瘤预处理的分析显示平均和最大肿瘤摄取之间没有差异(图15D-E)。虽然一些具有大肿瘤的动物在最后一次成像之前死亡，并且因此并非所有动物都经历了处理后成像，但是显示雄激素剥夺导致124I-CLR1404平均值和最大肿瘤摄取减少，分别如图15F和图15G所示。在接受ADT和对照疫苗的动物与接受ADT和AR靶向疫苗的动物之间，在处理后未检测到％ID/g平均或％ID/g最大的显著差异。然而，如在尸检期间测量的，与接受地加瑞克和pTVG4的动物相比，用地加瑞克和pTVG-AR处理的动物具有显著更小的肿瘤体积，如通过泌尿生殖器复合体重量所确定的(图15H)。
讨论
该实施例证明雄激素剥夺导致体外和体内全长AR表达随时间持续增加，并且这种增加的AR表达与这些细胞是AR特异性T细胞的更好靶标相关。此外，编码AR LBD的DNA疫苗当与ADT组合时增强了优先识别和裂解去势抗性前列腺癌细胞的免疫应答，并且延迟了去势抗性疾病的复发。当与ADT特异性组合时，通过靶向驱动去势抗性肿瘤生长的主要抗性机制，靶向AR的疫苗可优于其他抗原特异性疫苗。
总之，该实施例显示在ADT后前列腺癌细胞中AR表达增加导致AR特异性T细胞的识别和裂解增强。体内ADT和AR特异性免疫的组合增强了抗肿瘤T细胞免疫，并且延迟了去势抗性肿瘤的复发。这些研究提供了将ADT与AR靶向免疫相结合的基本原理，该方法正在I期临床试验(NCT02411786)中进行评估。
实施例6
免疫引发肿瘤中的PD-L1表达，并且PD-1/PD-L1阻断可以增加DNA疫苗接种的抗肿瘤功效。
使用不同的肿瘤抗原系统，我们发现DNA疫苗接种可以引发肿瘤中的PD-L1表达，这是由于引发的肿瘤特异性T细胞分泌IFNγ。具体地，我们已经报道表达模型抗原的肿瘤在用编码该抗原的DNA疫苗免疫后具有增加的PD-L1表达(Rekoske，B.T.，H.A.Smith，B.M.Olson，B.B.Maricque，and D.G.McNeel.(2015).“PD-1或PD-L1阻断在SSX2表位修饰的DNA疫苗免疫后恢复抗肿瘤功效(PD-1or PD-L1Blockade Restores Antitumor EfficacyFollowing SSX2Epitope-Modified DNA Vaccine Immunization).”Cancer ImmunolRes.3：946-55)。如果免疫经修改以引发具有更高PD-1表达的CD8+ T细胞，则这导致较差的抗肿瘤应答。将疫苗接种与抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗相结合，可以在一些动物中产生更强的抗肿瘤应答并根除肿瘤(Rekoske，B.T.，H.A.Smith，B.M.Olson，B.B.Maricque，andD.G.McNeel.(2015).“PD-1或PD-L1阻断在SSX2表位修饰的DNA疫苗免疫后恢复抗肿瘤功效(PD-1or PD-L1 Blockade Restores Antitumor Efficacy Following SSX2Epitope-Modified DNA Vaccine Immunization).”Cancer Immunol Res.3：946-55)。我们最近发现，在使用从用编码前列腺酸性磷酸酶(PAP)的DNA疫苗治疗的晚期前列腺癌患者收集的冷冻保存的血液样品免疫人后也发生这种情况。
使用体外和体内方法，我们发现当与PD-1阻断组合时，检测到对PAP的免疫应答，和/或对PAP的免疫应答增强(图9A，B)。此外，我们在DNA疫苗接种后检测到PD-L1在循环肿瘤细胞中的表达增加，并且我们发现更高的表达与持久性抗原特异性IFNγ分泌性T细胞免疫应答的发展相关(图9C)。我们在用西普利塞-T治疗的患者的血液样本中观察到类似的结果，该疫苗是FDA批准的靶向相同PAP抗原的前列腺癌疫苗(数据未显示)。总之，这些数据提供了支持将抗肿瘤疫苗与PD-1途径抑制剂相结合的证据。简言之，图9A显示先前用PAP靶向疫苗免疫的患者的PBMC在PD-1阻断抗体(或IgG对照)存在下用PAP体外培养72小时，并通过ELISA测量PBMC的IFNγ(左图)或颗粒酶B分泌(右图)。图9B显示将获自免疫后患者的PBMC与PAP蛋白和PD-1阻断抗体(或IgG对照)注射到NOD/SCID小鼠的足垫中，24小时后，测量足垫肿胀。图9C，用靶向PAP的DNA疫苗免疫后，对来自具有持久性PAP特异性Th1-偏向免疫应答的患者(R)与无应答者(NR)的循环肿瘤细胞测量PD-L1表达。显示了治疗后样品的PD-L1MFI与治疗前样品相比的比率。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
最近的初步数据还表明，与AR靶向疫苗组合靶向PD-1/PD-L1途径是规避这种肿瘤介导的免疫抑制手段的理论组合。在用AD处理并用pTVG-AR免疫的MycCaP荷瘤动物中(如图8所示)，发现CD8+ T细胞具有升高的PD-1表达(图10A)。另外，在免疫后产生抗原特异性免疫应答后在其他模型中观察到，一些复发肿瘤具有升高的PD-L1表达(图10B)。与单独用pTVG-AR免疫相比，当AR靶向免疫与PD-1阻断抗体组合时，该治疗显著延迟了肿瘤生长(图10C)。此外，将ADT与AR定向免疫和PD-1阻断相结合进一步延迟了肿瘤生长(图10D)。总之，这些发现表明PD-1途径抑制剂将是靶向对ADT和AR定向免疫组合的抗性的有效手段，并且可以预防(或显著延迟)致死性、去势抗性形式的前列腺癌的形成。
简言之，将FVB小鼠皮下植入MycCaP肿瘤细胞，后一天用地加瑞克治疗，后一天用pTVG4(载体对照)或pTVG-AR免疫。在肿瘤生长时，分析动物在脾CD8+ T细胞上的PD-1表达(图10A)和在CD45-肿瘤细胞上的PD-L1表达(图10B)。对于图10C，向FVB小鼠(n＝5)植入MycCaP肿瘤，并且后一天用pTVG-AR免疫接种(每周重复一次)，不进行去势，并且接种疫苗后每天用PD-1阻断抗体或对照处理，并跟踪肿瘤生长。对于图10D，用地加瑞克，pTVG-AR，和抗PD-1(n＝5)或IgG对照(n＝9)处理MycCaP荷瘤的FVB小鼠，然后跟踪肿瘤生长。在所有组中，*表示通过斯氏t检验p＜0.05。
实施例7
使用AR靶向疫苗联合雄激素剥夺和T细胞检查点阻断的临床试验设计
将开展一项开放标签的随机试验临床试验，涉及最多有50名新诊断的前列腺癌患者。患者被随机分配到以下三个治疗组中的一个。
研究目标：该试验的主要临床目标是每个研究组的安全性和病理学完全应答率。主要目标包括评估新诊断的前列腺癌患者中组合雄激素剥夺单独或联合pTVG-AR DNA疫苗(有或没有彭美罗珠单抗)的安全性；并且在根治性前列腺切除术之前确定用组合雄激素剥夺(LHRH激动剂，醋酸阿比特龙和阿帕他酰胺)或与pTVG-AR(有或没有彭美罗珠单抗)治疗的前列腺癌患者的病理学完全应答率。
次要目标包括确定一年PSA无进展生存率；确定用pTVG-AR治疗(有或没有彭美罗珠单抗)是否引起持续性系统性AR特异性Th1偏向性T细胞应答，并确定用pTVG-AR治疗(有或没有彭美罗珠单抗)是否引起前列腺组织浸润CD8+ T细胞增加。
对象群体：符合条件的对象是新诊断的前列腺癌患者，他们计划进行根治性前列腺切除术作为前提治疗。对象不需要是HLA-A2阳性，但是进行血清学分型以鉴定患者的表位特异性T细胞分析。在我们机构的先前试验中，我们发现约50％的患者表达HLA-A2，因此我们预计约50％的患者可用于这些分析。
试验设计：这将是一项随机，开放标签，多机构的试验性试验，旨在评估编码AR的DNA疫苗与rhGM-CSF佐剂在含有或不含彭美罗珠单抗的情况下的免疫学和临床效果。研究组的定义如下：
第1组：亮丙瑞林储库(或等效物)22.5mg肌肉注射，第1天，第85天
醋酸阿比特龙1000mg，每天口服，从第1天开始直到手术前一天
泼尼松5mg，每天口服，从第1天开始至手术后一周，然后逐渐减量
阿帕他胺240mg，每天口服，从第1天开始直到手术前一天
第2组：亮丙瑞林储库(或等效物)22.5mg肌肉注射，第1天，第85天
醋酸阿比特龙1000mg，每天口服，从第1天开始直到手术前一天
泼尼松5mg，每天口服，从第1天开始至手术后一周，然后逐渐减量
阿帕他胺240mg，每天口服，从第1天开始直到手术前一天
每两周皮内给予pTVG-AR(100μg)和rhGM-CSF(208μg)，6次，第1天开始
第3组：亮丙瑞林储库(或等效物)22.5mg肌肉注射，第1天，第85天
醋酸阿比特龙1000mg，每天口服，从第1天开始直到手术前一天
泼尼松5mg，每天口服，从第1天开始至手术后一周，然后逐渐减量
阿帕他胺240mg，每天口服，从第1天开始直到手术前一天
每三周皮内给予pTVG-AR(100μg)和rhGM-CSF(208μg)，8次，第1天开始
每3周给予彭美罗珠单抗2mg/kg，静脉注射30分钟，8次，第1天开始，每次剂量在pTVG-AR疫苗接种后
共有50名符合条件的患者(第1组10名，第2组20名，第3组20名)将被随机分组。跟踪所有对象的不良事件；如果归因于研究治疗的不良事件超过耐受性限制(＞33％等级＞2毒性，或＞10％等级＞3毒性)，则将停止进一步增加。
效果测量：符合此项试验条件的患者在入组时将不会有转移性疾病。
病理学评估：通过活组织检查预处理在前列腺切除术时获得的前列腺组织将由单一病理学家(Jiaoti Huang博士，MD PhD或指定人员)按照标准临床病理学检验进行评估和评分。在前列腺切除术时不存在可识别的前列腺癌将用于定义病理学完全应答。
血清PSA评估：在没有残留/复发疾病的情况下，预计前列腺切除术后血清PSA检测不到。因此，PSA进展将被定义为在前列腺切除术后3个月后的任何时间点的可检测的PSA(高于临床实验室的检测下限)，并且至少2周后通过二次读数确认。
安全性：在治疗期间的每次就诊时观察所有对象进行症状评估。定期进行实验室分析以获得不良事件的证据。这些临床实验室研究包括全血细胞计数，肌酐，肝功能检查，PSA，血清醛缩酶(肌肉相关毒性评估)和抗核抗体。不良事件按NCI通用术语标准的当前版本(4.0)评分。毒性事件的数量和严重程度以表格形式进行描述性分析。
免疫学监测：在免疫前，治疗3个月后，在前列腺切除术时，和在前列腺切除术后3个月，6个月，和12个月时，通过外周血抽取(最多210mL)或白细胞分离术(50-100mL)收集血液用于免疫学监测。从肝素化血液中，将使用标准技术通过Ficoll-Paque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。PBMC将直接用于分析，并且使用在抽血时收集的90％自体血清或90％胎牛血清和10％DMSO在液氮中冷冻保存残余物质。从红顶管制备血清并以等分试样储存在-80℃下用于抗体分析。IFNγ和颗粒酶B ELISPOT分析，以及抗原特异性抗体的ELISA检测将是主要的分析方法。测试的主要抗原将是AR(实验)，PSA(阴性对照)和破伤风类毒素(阳性对照)。初步免疫分析将在手术后6个月的时间点进行，并与治疗前时间点进行比较，对于可评估免疫应答(主要终点)的患者，来自该时间点的血液(PBMC和血清)必须可用于分析。然而，免疫监测将在二级分析中指出的其他时间点进行，以评估免疫的动力学测量，并评估是否引发和/或维持特定表型的持久免疫应答。可以在样品收集(新鲜)和/或分批时进行测定，并且可以将来自在不同时间点收集的多个冷冻保存的样品进行同时测定。可以使用对AR和其他人组织抗原的效应和调节T细胞应答的其他方法。
通过ELISPOT定量评估AR特异性CD8+ T细胞效应免疫AR特异性IFNγ-和颗粒酶B分泌T细胞前体频率定量：ELISPOT将被用作优选方法，因为它允许分析低频事件(LOD约1∶100,000个细胞)并且还允许同时分析冷冻保存的批次样本[22]。IFNγ和颗粒酶B将是评估的优选分析物，因为它们与炎性/组织破坏性(Th1型，溶细胞性)免疫应答特异性相关。具体而言，将来自不同时间点的对象的冷冻保存的PBMC解冻，静置，然后转移至96孔硝酸纤维素微量滴定板(ELISPOT)，该板预先包被有对IFNγ或颗粒酶B特异的单克隆捕获抗体。每孔105个细胞将在仅培养基(RPMI 1640，补充有L谷氨酰胺，青霉素/链霉素，β-巯基乙醇和10％人AB血清)(无抗原)，2μg/ml AR蛋白，2μg/ml PSA蛋白(阴性对照)，2μg/ml特异于AR或对照的肽文库，250ng/ml破伤风类毒素，或2.5μg/ml PHA(阳性促有丝分裂对照)存在下培养24-48小时。然后用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤平板，并在室温下用含有5μg/ml针对IFN+或颗粒酶B的生物素化检测抗体的50μl/孔PBS孵育2.5小时。孵育后，将用PBS洗涤孔，并进一步与100ul/孔链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(伯乐公司，加利福尼亚州赫尔克里斯)一起孵育，然后用100μl/孔BCIP/NBT比色底物(伯乐公司)显色。通过在冷自来水下冲洗板来停止比色反应，并且在用ELISPOT自动读板器计数斑点之前使孔完全干燥。
报告和应答定义：结果将如先前报告的那样呈现为每106个细胞(频率)的斑点形成单位(sfu)的平均值(+/-标准偏差)，通过从无抗原对照孔获得的斑点的平均数量减去来自从8孔重复测定标准化至106个起始PBMC的实验孔中获得的平均数来计算[23]。比较实验孔与对照(无抗原)，使用双样品t-检验孔，p＜0.05(双侧)定义为显著的抗原特异性T细胞应答。然后将由免疫产生的显著的抗原特异性应答定义为在手术后6个月时间点(或评估的其他治疗后时间点)可检测到的AR特异性应答显著高于仅培养基(如上)，至少比平均基线值高3倍，并且频率＞10/106个PBMC。
抗原特异性抗体免疫的评估：用于检测抗体对AR的应答的酶联免疫吸附测定(ELISA)：将使用类似之前描述的间接方法通过ELISA评估是否存在对AR(或其他抗原)的共存的体液免疫应答。具体地，Immulon-4ELISA板(Dynex技术公司)将在0.1M NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 9.6)中用2μg/ml纯化的AR LBD蛋白(研究诊断公司(Research Diagnostics，Inc.)或其他抗原或商业来源)4℃包被过夜。在室温下用PBS/1％BSA封闭1小时后，用PBS+0.05％Tween-20(PBS-Tween)洗涤孔，然后用1∶25，1∶50，1∶100和1∶200稀释的人血清孵育1小时。洗涤后，然后将板依次与过氧化物酶偶联的抗人IgG检测抗体(安玛西亚公司(Amersham))，然后过氧化物酶TMB底物(Kierkegaard和Perry实验室公司)孵育。用1N H2SO4终止显色反应，并在450nm下测量光密度。如前所述[61]将确定AR特异性IgG抗体的抗体滴度。
报告和应答定义：这些不是严格的定量分析。将以图形方式报告IgG应答，展示血清稀释曲线，并通过滴度-定义为可检测到在阴性对照的平均值±3标准偏差之上的IgG应答的最高血清稀释度。由免疫产生的阳性IgG应答将被定义为这样的抗原特异性(抗AR)IgG滴度，该滴度比在治疗后6个月时间点(或其他评估的治疗后时间点)可检测到的基线滴度高至少4倍。
组织病理学评估：可以从所有对象获得在治疗前和在前列腺切除术时获得的组织活检。这些研究的目的首先是确定单独使用雄激素剥夺(第1组)治疗是否会导致CD8+ T细胞增加，以及是否通过使用AR靶向疫苗(第2组)进一步提供和用彭美罗珠单抗进一步提高(第3组)。这将通过标准免疫组织化学和定量流式细胞术(当可行时用新鲜组织)确定。作为一种探索性方法，CD8+ T细胞相对于其他群体的频率也将通过冷冻或石蜡包埋的组织样品的mRNA分析来确定。作为进一步的探索方法，特定CD8+ T细胞群的频率将通过使用冷冻组织样品的TCR测序(Adaptive生物科技公司(Adaptive Biotechnologies，华盛顿州西雅图)来确定。
组织病理学评估的次要目标是确定用pTVG-AR免疫是否影响肿瘤中的PD-L1表达(可能通过引发肿瘤抗原特异性T细胞分泌IFNγ)，以及治疗是否增加T细胞(PD-1，CTLA-4，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3)或肿瘤(例如HVEM，磷脂酰丝氨酸，PD-L2)上其他T细胞调节配体的表达。因此，在治疗前和12周后获得的活检标本将用对CD3，CD4，CD8，FoxP3，PD-1，CTLA-4，TIM3，BTLA，VISTA，LAG-3，PD-L1，PD-L2，磷脂酰丝氨酸，HVEM和可能的其他标志物特异性的抗体染色。染色和定量将由对治疗组不知情的病理学家进行检验，以确定每个视野的CD8+ T细胞，CD4+FoxP3+(Treg)：CD8+ T细胞比率，PD-L1表达，以及这些表达或表达一种调节受体(或表达一种或多种调节配体的肿瘤细胞)的CD8+T细胞的表达是否从治疗前到前列腺切除术时间点发生改变。
在威斯康星大学，样品将被运送到UWCCC TRIP(病理学转化研究计划)实验室进行福尔马林固定，石蜡包埋，切片，H&E染色，并最终用于如上所述的IHC分析。
实施例8
与实施例7类似，使用疫苗，ADT和PD-1途径阻断的组合治疗的合适剂量方案示于图16。合适的测试参数显示在时间线下，并将如实施例7中所述进行。
本公开中引用的每篇出版物，专利和专利公开均通过引用全文并入本文。本发明不受限于前述实施例，但涵盖落在权利要求范围内的全部修改形式和变化形式。
实施例5的参考文献，各自通过引用全文并入
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该说明书包括以计算机可读形式同时提交的序列表。该序列表通过引用纳入本文。
Claims (32)
1.一种在患有前列腺癌的对象中引发抗肿瘤应答的方法，包括：
a.向所述对象给予雄激素剥夺疗法(ADT)；和
b.向对象给予重组DNA疫苗，所述重组DNA疫苗包含与转录调节元件操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码雄激素受体或雄激素受体的片段，
其中所述重组DNA疫苗以有效引发针对前列腺癌的增加的抗肿瘤应答的量给予，其中所述ADT和重组DNA疫苗的组合治疗抑制，延迟或减少前列腺癌的生长。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA疫苗包含编码雄激素受体配体结合片段的片段的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA疫苗每两周至每三个月给予。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA疫苗给予持续至少6周。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA疫苗给予持续至少10周。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述DNA疫苗以每两周给予持续约6周至约10周，并随后以每季度给予持续至少一年。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述DNA疫苗给予持续至少18个月。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疫苗以约10mcg至1mg的剂量给予。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ADT和重组疫苗同时给予。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中ADT在给予重组疫苗之前给予。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中ADT在给予至少一剂量的重组疫苗之后给予。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述雄激素剥夺疗法包括给予有效量的至少一种靶向雄激素受体途径的药物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述至少一种靶向雄激素受体途径的药物选自：LHRH(或GnRH)类似物，LHRH(或GnRH)拮抗剂，AR拮抗剂，雄激素合成抑制剂，AR降解剂，及其组合。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA疫苗与佐剂共同给予。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述佐剂是GM-CSF。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA疫苗在有或没有电穿孔的情况下，经皮内、肌内、皮下、静脉内或动脉内给予。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA疫苗包括pTVG-ARLBD。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA疫苗包括选自以下的多核苷酸：(i)哺乳动物雄激素受体，(ii)包含配体结合结构域的雄激素受体片段，(iii)由SEQ IDNO：9限定的配体结合结构域片段，(iv)由SEQ ID NO：10限定的配体结合结构域片段，(v)由SEQ ID NO：11限定的配体结合结构域片段，和(vi)由SEQ ID NO：12限定的配体结合结构域片段，从而所述DNA疫苗在对象中引发针对雄激素受体的免疫应答。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向对象给予有效量的PD-途径抑制剂。
20.一种提高患有前列腺癌的对象中雄激素剥夺疗法的功效的方法，包括向对象给予有效量的重组DNA疫苗，所述重组DNA疫苗包含与转录调节元件操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码雄激素受体或雄激素受体的片段，其中所述方法抑制、延迟或减少前列腺癌的生长。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述DNA疫苗包括pTVG-ARLBD。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述DNA疫苗包括选自以下的多核苷酸：(i)哺乳动物雄激素受体，(ii)包含配体结合结构域的雄激素受体片段，(iii)由SEQ ID NO：9限定的配体结合结构域片段，(iv)由SEQ ID NO：10限定的配体结合结构域片段，(v)由SEQ ID NO：11限定的配体结合结构域片段，和(vi)由SEQ ID NO：12限定的配体结合结构域片段，从而所述DNA疫苗在对象中引发针对雄激素受体的免疫反应。
23.如权利要求中20-22任一项所述的方法，其中所述方法还包括向对象给予有效量的PD-途径抑制剂。
24.如权利要求中19或23所述的方法，其中所述PD-途径抑制剂是抗-PD-1阻断抗体或抗-PD-L1抗体。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前列腺癌是复发和/或转移前列腺癌。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前列腺癌是去势抗性前列腺癌(mCRPC)。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述前列腺癌是新诊断的前列腺癌。
28.一种用于治疗前列腺癌的药盒，包括雄激素剥夺疗法和引发抗雄激素受体免疫应答的重组DNA疫苗。
29.如权利要求27所述的药盒，其中所述重组DNA疫苗包含与转录调节元件操作性连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码雄激素受体或雄激素受体的片段。
30.如权利要求27或28所述的药盒，其中所述雄激素受体疗法由一种或多种通过干扰AR表达或信号传导而靶向AR途径的药物组成。
31.如权利要求28-30中任一项所述的药盒，其中所述重组DNA疫苗是pTVG-ARLBD。
32.如权利要求28-31中任一项所述的药盒，其中所述药盒还包含PD-1途径抑制剂。
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