CN110072529A - 包含环索奈德的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含环索奈德或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于抑制癌症干细胞生长的组合物、包含所述组合物的用于抑制癌症转移或用于治疗或预防癌症的药学组合物、食品组合物等。本发明的环索奈德抑制乳腺癌及肺癌细胞的生长，并抑制乳腺癌及肺癌干细胞的形成。并且，确认了抑制被周知为在乳腺癌及肺癌干细胞中特征性表达的包括Nanog、C‑myc、Oct4、Sox2、Snail及CD44在内的自我更新基因的表达，并且抑制被周知为参与乳腺癌干细胞的乳腺球的形成与肺癌干细胞的肿瘤球的形成的白细胞介素‑6(IL‑6)及白细胞介素‑8(IL‑8)的生产，而且抑制信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路。因此，所述化合物抑制乳腺癌、肺癌等的癌症干细胞的生长以及它们的癌症的生长，可有效利用于乳腺癌、肺癌等的癌症的治疗。

Description

包含环索奈德的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物
技术领域
本发明涉及包含环索奈德或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物、包含所述组合物的用于抑制癌症转移或用于治疗或预防癌症的药学组合物、食品组合物等。
背景技术
由于癌症治疗无法有效地靶向治疗肿瘤内的细胞群，而是延续着肿瘤的复发及转移，因此兴起了对癌症干细胞的关注。细胞毒性抗癌药物大多靶向快速增殖的细胞，具有缓慢增殖的特征的癌症干细胞可以在细胞毒性抗癌疗法中存活下来。基底细胞表型(basalcell phenotype)乳腺癌被认为起源于分化过程的早期乳腺祖细胞(earliest mammaryprogenitor cell)，并已知预后不良好，对现有的抗癌疗法表现出耐性，对癌症干细胞的靶向治疗失败这可谓是支持抗癌治疗的失败原因的最好的示例。
根据癌症干细胞假设，研究了诸多治疗方法，其中广为人知的方法为利用癌症干细胞的自我更新(self-renewal)途径的方法。这种治疗的重点在于，应保持正常干细胞的自我更新的同时，仅靶向癌症干细胞的自我更新。作为一例，Notch信号由所谓的分泌酶(secretase)的酶来进行，当将对其的抑制剂，即分泌酶抑制剂(secretase inhibitor)用于过表达Notch1的乳腺癌时，可具有肿瘤抑制效果。最近的一报告指出，以靶向Hedgehog信号体系时也具有抗癌效果，即，当向移植肿瘤(tumor xenograft)的动物给药作为Hedgehog抑制剂的环巴胺(cyclopamine)时，肿瘤戏剧性地缩小。
另一方面，乳腺癌是在女性中常见的癌症，并已知是女性癌症患者的主要死亡原因(al A,Bray F，Center MM，Ferlay J，Ward E and Forman D.Globalcancerstatistics.CA Cancer J Clin.2011；61(2)；69-90)。在早期乳腺癌中，结合综合化学疗法(polychemotherapy)、他莫昔芬的广泛的乳腺X光检查及辅助疗法降低了乳腺癌的死亡率，但乳腺癌仍然因复发及转移而被周知为最危险的疾病。最初在髓细胞性白血病中确认了癌症干细胞(Cancer stem cell，CSCs)，之后在多种实体癌中被发现，如乳腺癌、脑癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌及前列腺癌等。所述癌症干细胞还被称为肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells)及癌症干细胞样细胞(cancer stem-like cell)。并且，表明包括乳腺癌在内的多种癌症类型源自作为肿瘤的亚组的癌症干细胞(CSCs)。已知这些组通过自我更新(self-renewal)及分化来诱发肿瘤体积的变化。已知Wnt(wing less)、Shh(Sonichedgehog)、信号转导及转录活化因子3(Stat3)、核因子-κB(NF-κB)、Wnt/β-catenin、TGF-β及Notch信号传导通路对癌症干细胞(CSCs)的自我更新(self-renewal)是关键的。
癌症干细胞表现出对化学疗法和放射线治疗的抗药性及辐射抗性，并诱发癌症的复发及转移。因此，癌症干细胞的靶向治疗对癌症治疗是必不可少的。已知癌症干细胞表达包含Oct4、C-myc、Nanog及乙醛脱氢酶-1(Aldehyde dehydrogenase-1，ALDH)的特定蛋白质。所述乙醛脱氢酶-1(ALDH)为一种氧化基因毒性的醛的酶，其的酶活性被广泛用于白血病、头颈癌、膀胱癌、骨癌、结肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌及宫颈癌的癌症干细胞(CSC，cancer stem cells)标志物。已知乙醛脱氢酶-1(ALDH)为癌症干细胞的治疗靶标。并且，已知在临床样本中表达CD44+/CD24-的乳腺癌群中形成肿瘤的能力优异(Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，Morrison SJ and Clarke MF.Prospectiveidentification of tumorigenic breast cancer cells.Proc Natl Acad Sci U SA.2003；100(7):3983-3988)。
信号转导及转录活化因子3(Stat3，Signal transducers and acti vators oftranscription 3)主要在癌症干细胞(CSCs)中被激活，乳腺球(mammosphere)的形成与JAK1-STAT3通路相关。所分泌的白细胞介素-6(IL-6)使JAK1-STAT3通路激活，并使Oct4基因的表达增加。已知IL-6/JAK1/STAT3信号传导通路对于非癌症干细胞(NSCCs，Non-CSCs)向癌症干细胞(CSCs)的转换是重要的。已知当阻断信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路时，抑制源自乳腺癌细胞的CD44+/CD24-干细胞样(stem cell-like)细胞的生长。核因子-κB(NF-κB，Nucle ar factor-κB)转录因子在包括结肠癌、乳腺癌及肝癌的肿瘤细胞中在结构上(规定地)激活，并由IκB激酶(IKK)复合物进行调节。已知作为核因子-κB(NF-κB)的抑制剂的吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrroli dinedithiocarbamate，PDTC)用于抑制乳腺癌干细胞样细胞。
已知所述乳腺癌干细胞可通过如CD44high/CD24low、ESA+(上皮特异性抗原)及乙醛脱氢酶-1(ALDH)等的生物标志物的表达来确认。已知癌症化学疗法使用于表达CD44+/CD24的癌细胞的比例及乳腺球形成增加。癌症干细胞(CSCs)过表达特定的ABC转运蛋白(ABCtransporters)以保护癌症干细胞(CSCs)免受毒素的侵害。ABC泵用于分离侧群(SP，sidepopulation)，并且可通过ABCG2转运蛋白特异性(ABCG2 transporter-specific Hoechst33342dyes)来进行分类。与肿瘤细胞(tumor cells)相比，乳腺癌症干细胞(CSCs)产生低水平活性氧(ROS)，因此乳腺癌干细胞样细胞(breast cancerstem-likes cells)具有抗辐射性。已知由于活性氧簇(ROSs)为电离辐射诱导的细胞凋亡的主要介质，因此癌症干细胞(CSCs)的DNA损伤小于非干细胞癌细胞(non-stem cancer cells)(Diehn M，Cho RW，LoboNA，Kalisky T，Dorie MJ，Kulp AN，Qian D，Lam JS，Ailles LE，Wong M，Joshua B，KaplanMJ，Wapnir I，Dirbas FM，Somlo G，Garberoglio C，et al.Association of reactiveoxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.Nature.2009；458(7239):780-783)。
已知乳腺癌细胞株MCF-7具有细胞的部分菌落，其具有与在体外(in vitro)无粘附也无细胞凋亡并能够以椭圆形生长的干细胞相似的能力。当通过悬浮培养来人工制备无基底的条件时，具有干细胞的性质的多个细胞相互粘附来形成球形的细胞团，这种细胞团被称为神经球(neurosphere)。将这种概念适用于人类的乳腺干细胞的即为“乳腺球(mammosphere)”。乳腺球中存在比普通人乳腺细胞多8倍的前体细胞并可持续性地继代培养，在多次的继代培养之后，并具有100％的细胞均成长为双效(bi-potent)前体。乳腺球可分化为作为成人乳腺细胞的乳腺上皮细胞(mammary gland epitherlial cell)、导管上皮细胞(ductal epithelialcell)、肺泡上皮细胞(alveolar epitherlial cell)，并且观察到基质胶(Matrigel)内以三维结构形成复杂的功能性乳腺结构体。乳腺球可具有干细胞的最显著特征之一的自我复制的性质，因此可从一个乳腺球获得大量的多个乳腺球或乳腺干细胞。并且，据报道，由于确认到与造血干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞等相比许多表达基因重复，因此乳腺球为实际的乳腺干细胞。这种癌症干细胞的自我更新能力的标准分析方法为分析体内(in vivo)的移植(transplantation)及体外(in vitro)的乳腺球的形成。
并且，不仅乳腺癌细胞株，在包括肺癌在内的多种癌细胞株中具有干细胞的性质的多个细胞可相互粘附形成球形的细胞团，并将其称为肿瘤球(tumorsphere)。所述肿瘤球是指通过一个癌症干细胞或癌前体细胞的增殖而发展的肿瘤球。
另一方面，肺癌为全球癌症相关死亡的主要原因，并分类为非小细胞型肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌(SCLC)两种主要亚型。非小细胞型肺癌(NSCLC)占肺癌患者的85％，小细胞肺癌(SCLC)占15％。所述非小细胞型肺癌(NSCLC)分为腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌三种亚型。吸烟为肺癌的主要危险因素。肺癌可以用化学疗法及放射治疗，但会产生耐药性。肺癌的5年生存率低，小细胞肺癌的1年生存率为40％，5年生存率为5％以下。但是，肺癌中对所述放射线及抗癌化学疗法的的耐药机制尚不明确。癌症干细胞具有对根除大量肿瘤的化学疗法及放射线治疗的抗药性及抗辐射特性，最终因此而诱发癌症的复发及转移。因此，靶向CSC的治疗对肺癌治疗是必不可少的。
迄今为止，对癌症干细胞的研究存在诸多限制，对于肿瘤的形成或维持方面的作用尚未阐明。为了在不损伤正常干细胞的情况下有效进行仅靶向癌症干细胞的治疗，需要一些知识来对癌症干细胞的维持及调节重要的分子生物学特征或其调节通路进行理解。
发明内容
技术问题
迄今为止，直接靶向癌症干细胞的抗癌药物或源自天然产物的提取物的研究几乎很少。在现有技术中，通过抑制癌症干细胞的直接性靶基因的实验来进行了抑制癌症干细胞或抑制癌症干细胞的上游信号传导蛋白来抑制癌症干细胞的研究。但是，就诸多肿瘤患者而言，因肿瘤基因的变异或蛋白质变异而使这种靶向实验面临许多困难。
解决问题的手段
本发明的目的在于，提供由化学式1表示的包含环索奈德或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物。
本发明的再一目的在于，提供包含所述用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于治疗或预防癌症的药学组合物。
本发明的另一目的在于，提供包含所述用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于抑制癌症转移的药学组合物。
本发明的还一目的在于，提供包含所述用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于改善或预防癌症的食品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包含所述用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于改善或预防癌症转移的食品组合物。
本发明的又一目的在于，提供包括向个体给药由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐的步骤的抑制癌症干细胞的生长的方法。
本发明的又一目的在于，提供包括向个体给药由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐的步骤的用于抑制癌症转移的方法。
本发明的又一目的在于，提供包括向个体给药由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐的步骤的癌症的预防或治疗方法。
本发明的又一目的在于，提供由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐在制备用于抑制癌症干细胞的生长的药物中的用途。
本发明的又一目的在于，提供由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐在制备用于抑制癌症转移的药物中的用途。
本发明的又一目的在于，提供所述由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
发明效果
本发明的环索奈德抑制乳腺癌及肺癌细胞的生长，并抑制了乳腺癌及肺癌干细胞的形成。并且，确认了抑制已知在乳腺癌及肺癌干细胞中特征性表达的如Nanog、C-myc、Oct4、Sox2、Snail、CD44等的自我更新基因的表达，抑制了已知参与乳腺癌干细胞的乳腺球的形成及肺癌干细胞的肿瘤球的形成的白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-8(IL-8)的生产，还抑制信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路。因此，所述化合物抑制乳腺癌、肺癌等的癌症干细胞的生长以及它们的癌症的生长，因此可有效利用于乳腺癌、肺癌等的癌症治疗中。
附图说明
图1中表示环索奈德在乳腺癌细胞株中抑制多种癌症特征。具体而言，图1的A及B部分表示环索奈德的化学结构及对环索奈德的MCF-7及MDA-MB-231细胞的生存率。在MCF-7及MDA-MB-231细胞中增加环索奈德的浓度并处理了48小时。通过MTS分析来测定了环索奈德的抗增殖效果。
图1的C、D、E部分表示环索奈德对乳腺癌细胞的细胞凋亡的影响。在MDA-MB-231细胞中处理环索奈德24小时，利用膜联蛋白V-PI染色试剂盒通过流式细胞仪(FACS)分析了凋亡细胞。在MDA-MB-231细胞中的caspase3/7活性通过Caspase-Gloss3/7试剂盒来进行了分析。通过荧光染色法分析了凋亡细胞(apoptotic cells),在乳腺癌中，细胞核用Hoechst33258来进行了染色(放大×100)。
图1的F部分表示环索奈德对人乳腺癌细胞的迁移潜力的效果。MDA-MB-231细胞的伤口治愈根据是否处理环索奈德来拍摄了0小时、18小时。
图1的G部分表示环索奈德对人乳腺癌细胞的菌落形成的效果。将所述解离的1000个MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，并以所示浓度的环索奈德及二甲基亚砜(DMSO)处理了7天。记录了菌落的代表性图像。所示的数据表示3个独立的实验的平均±SD。*p＜0.05vs.二甲基亚砜(DMSO)处理的对照组。
图2表示环索奈德在异种移植模型中对肿瘤生长的效果。将300万个细胞注射到免疫缺陷NOD-SCID雌性裸鼠的乳房脂肪垫中。
图2的A部分表示环索奈德在生产MCF-7细胞的免疫缺陷裸鼠中对肿瘤生长的效果。所使用的药物剂量为10mg/kg。
图2的B部分表示环索奈德对肿瘤的重量的效果。在治疗之后测定了肿瘤重量。
在图2的C部分中，利用卡尺每周测定肿瘤体积2次，并以(宽度×长度2)/2计算。在实验期间监测了肿瘤生长曲线。
*与对照组相比，p＜0.05。在治疗7周结束时捕获了代表性图像，其结果表示为空白(vehicle)处理的对照组、环索奈德处理的小鼠。
图3表示环索奈德对乳腺球的形成的效果。在乳腺球形成条件下培养了MCF-7及MDA-MB-231细胞7天。
图3的A部分表示环索奈德对源自MCF-7细胞的乳腺球形成的效果。第一乳腺球与环索奈德(5μM及10μM)或二甲基亚砜(DMSO)共同培养。
图3的B部分表示环索奈德对源自MDA-MB-231细胞的乳腺球形成的效果。所述乳腺球与环索奈德(10μM)或二甲基亚砜(DMSO)共同培养。在培养MCF-7及MDA-MBB-231细胞7天期间用环索奈德及二甲基亚砜(DMSO)进行了处理。用10倍比率显微镜获得了图像，并且为代表性乳腺球(比例尺＝100μm)。
图3的C部分表示泼尼松及地塞米松(20μM至80μM)对源自MCF-7及MDA-MB231细胞的乳腺球形成的效果。
图4表示环索奈德在乳腺癌细胞株中对癌症干细胞标志物的表达的效果。
图4的A部分表示环索奈德在MDA-MB-231细胞中对CD44+/CD24-细胞数量的效果。根据是否进行环索奈德处理来在MDA-MB-231细胞中测定了CD44+/CD24-细胞的比例。为了流式细胞仪(FACS)的分析而获得了100000个细胞。设门基于对照组抗体。
图4的B部分表示环索奈德对乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性细胞群的效果。用环索奈德(10μM)或二甲基亚砜(DMSO)处理MDA-MB-231细胞2天之后，进行了ALDEFLUOR分析及流式细胞仪(FACS)分析。右侧面板(panel)为阴性对照组且表示作为乙醛脱氢酶-1(ALDH)抑制剂的DEAB处理的乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性细胞，左侧面板表示DEAB未处理的乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性细胞。乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性群标记在盒中。
图5表示环索奈德在乳腺球中对信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路的效果。
图5的A部分表示环索奈德在乳腺球中对信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路的效果。在乳腺球利用对pSTAT3、STAT3、P65及核纤层蛋白B的抗体测定了信号转导及转录活化因子3(STAT3)及NF-kB的核蛋白表达及激活。环索奈德在乳腺球中使核pSTAT3蛋白的水平降低。
图5的B部分表示经由环索奈德处理的源自MDA-MB-231细胞的乳腺球核裂解物(lysates)的电泳迁移率实验(EMSA，电泳迁移率实验)分析。核裂解物用？M的生物素标记探针(biotin-labeled Stat3 probe)培养，并通过6％的PAGE来进行了分离。
通道1：单独探针；通道2：探针+核提取物；通道3：探针+环索奈德处理的核提取物；通道4：自身竞争；通道5：与突变信号转导及转录活化因子3(STAT3)探针共同培养的核提取物。所述环索奈德在乳腺球核裂解物中降低了DNA/STAT3相互作用。
图5的C部分表示环索奈德或二甲基亚砜(DMSO)处理的肿瘤的人炎性细胞因子分析。所述炎性细胞因子利用美国贝克顿迪金森公司(BD)的细胞计数珠阵列(CBA，cytometric bead array)人炎性细胞因子试剂盒(human inflammatory cytokines kit)来进行了测定。利用白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-1β(IL-1β)及TNF抗体进行了细胞计数珠阵列(CBA)分析。
图6表示环索奈德在乳腺癌中对癌症干细胞负荷的效果。
在图6的A部分中，作为CSC标志物的Nanog、Sox2、C-myc、Oct4及CD44基因的转录表达水平利用CSC标志物特异性引物在环索奈德及二甲基亚砜(DMSO)处理的乳腺球中通过实时聚合酶链式反应(realtime RT-PCR)进行了分析。β-肌动蛋白用作内部对照组。
图6的B部分表示环索奈德对乳腺球生长的效果。环索奈德抑制乳腺球的生长。环索奈德及二甲基亚砜(DMSO)处理2天的乳腺球分离为单细胞，并以同等细胞数涂敷于6cm培养皿中。涂敷24小时之后，对细胞进行了计数。在第二天及第三天计数细胞三次，并以平均值作图。所述数据表示3个独立的实验的平均±SD。*p＜0.05vs.二甲基亚砜(DMSO)处理的对照组。
图7表示环索奈德在肺癌细胞株中抑制多种癌症特征。图7的A部分表示环索奈德的对A549肺癌细胞的生存率。A549细胞中增加环索奈德的浓度并处理了48小时。环索奈德的抗增殖效果通过MTS分析来进行了测定。
图7的B部分表示通过荧光染色法来分析了凋亡细胞(apoptotic cells)并在肺癌中利用Hoechst 33258对核进行了染色(放大×100)。
图7的C部分表示环索奈德对肺癌细胞的细胞凋亡的影响。在A549细胞中处理环索奈德24小时，并利用膜联蛋白V-PI染色试剂盒通过流式细胞仪(FACS)来分析了凋亡细胞。
在图7的D部分中，A549细胞中通过Caspase-Gloss 3/7试剂盒来分析了caspase3/7活性。
图7的E部分表示环索奈德对人肺癌细胞的迁移潜力的效果。A549细胞的伤口治愈根据是否处理环索奈德来拍摄了0小时、18小时。
图7的F部分表示环索奈德对人肺癌细胞的菌落形成的效果。将所述解离的1000个A549细胞接种于6孔板中，并以所示浓度的环索奈德及二甲基亚砜(DMSO)处理了7天。记录了菌落的代表性图像。所示的数据表示3个独立的实验的平均±SD。*p＜0.05vs.二甲基亚砜(DMSO)处理的对照组。
图8表示环索奈德在移植有肺癌细胞的异种移植模型中对肿瘤生长的效果。500万个细胞注射到免疫缺陷NOD-SCID雄性裸鼠的皮下组织中。
图8的A部分表示环索奈德在生产A549细胞的免疫缺陷裸鼠中对肿瘤生长的效果。所使用的药物剂量为10mg/kg。
图8的B部分表示环索奈德对肿瘤的重量的效果。在治疗之后测定了肿瘤重量。
在图8的C部分中，利用卡尺每周测定肿瘤体积2次，并以(宽度×长度2)/2计算。在实验期间监测了肿瘤生长曲线。
*与对照组相比，p＜0.05。在治疗14周结束时捕获了代表性图像，其结果表示为空白(vehicle)处理的对照组、环索奈德处理的小鼠。
图9表示环索奈德对肿瘤球形成的效果。在肿瘤球形成条件下培养了A549细胞7天。
图9的A部分表示环索奈德对源自A549细胞的肿瘤球形成的效果。第一肿瘤球与环索奈德(5μM及10μM)或二甲基亚砜(DMSO)共同培养了7天。
图9的B部分表示环索奈德对作为源自A549细胞的肿瘤球形成的激活型的异丁酰基环索奈德的效果。
图9的C部分表示作为糖皮质激素(Glucocorticoids)的泼尼松及地塞米松对源自A549细胞的肿瘤球形成的效果。第一肿瘤球与泼尼松及地塞米松(40μM及80μM)或二甲基亚砜(DMSO)共同培养了7天。
通过10倍倍率显微镜获得了图像，并且为具代表性的肿瘤球(比例尺＝100μm)。
图10表示环索奈德对乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性细胞群的效果。A549细胞利用环索奈德或二甲基亚砜(DMSO)处理2天之后，进行了ALDE FLUOR分析及流式细胞仪(FACS)分析。下端面板表示作为乙醛脱氢酶-1(ALDH)抑制剂的DEAB处理的乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性细胞，上端面板表示DEAB未处理的乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性细胞。乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性群标记在盒中。
图11表示环索奈德在肺癌中对癌症干细胞负荷(load)的效果。
在图11的A部分中，作为CSC标志物的nanog、sox2、c-myc及snail基因的转录表达水平利用CSC标志物特异性引物在环索奈德及二甲基亚砜(DMSO)处理的肿瘤球中通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)进行了分析。β-肌动蛋白用作内部对照组。
图11的B部分表示环索奈德对肿瘤球生长的效果。环索奈德抑制肿瘤球的生长。环索奈德及二甲基亚砜(DMSO)处理2天的肿瘤球分离为单细胞，并以同等细胞数涂敷于6cm培养皿中。涂敷24小时之后，对细胞进行了计数。在第一天、第二天及第三天计数细胞三次，并以平均值作图。所述数据表示3个独立的实验的平均±SD。*p＜0.05vs.二甲基亚砜(DMSO)处理的对照组。
图12表示环索奈德在肿瘤球中对细胞外白细胞介素-8(IL-8)的蛋白质水平的效果。
表示环索奈德或二甲基亚砜(DMSO)处理的肿瘤的人炎性细胞因子分析。所述炎性细胞因子利用美国贝克顿迪金森公司(BD)的细胞计数珠阵列(CBA，cytometric beadarray)人炎性细胞因子试剂盒(human inf lammatory cytokines kit)来进行了测定。利用白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-1β(IL-1β)及TNF抗体进行了细胞计数珠阵列(CBA)分析。
具体实施方式
本发明人已确认，利用作为抑制癌症干细胞的候选物的多种化合物来确认是否抑制癌症干细胞的生长，其中，环索奈德(ciclesonide)选择性地抑制乳腺癌干细胞及肺癌干细胞。环索奈德被周知为由美国食品药品监督管理局(FDA)批准的哮喘治疗剂，但由本发明人首次确认了抑制乳腺癌干细胞的生长，并且与MCF-7大量细胞相比，在源自乳腺癌的乳腺球中选择性地抑制信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路。并且，确认了利用小鼠异种移植模型有效地抑制肿瘤的生长。由此，环索奈德靶向癌症干细胞(CSCs)，从而抑制包括乳腺癌及肺癌在内的癌症干细胞的生长，并且可利用于包括乳腺癌及肺癌在内的癌症治疗，并完成了本发明。
为了实现所述目的，本发明提供包含由以下化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物。
化学式1
在本发明中，所述环索奈德(ciclesonide)被周知为哮喘治疗剂，但由本发明人首次确认了抑制乳腺癌及肺癌干细胞的生长。
在本发明中，术语“癌症”通常表示或说明具有非调节的细胞生长的特征的哺乳动物的生理学状态。所谓“癌症”是指细胞的正常性分裂、分化及凋亡的调节功能发生问题，异常性地过多增殖，导致侵袭于周围组织及器官中并形成团块，并且使现有结构破坏或变形。
在本发明中，术语“癌症干细胞”是具有可分化成多种癌细胞的能力的未分化细胞，所述癌症可以为包括结肠癌及直肠癌在内的大肠癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、脑肿瘤、头颈癌、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、小肠癌、肛肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、淋巴肉芽肿病、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、骨癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、中枢神经系统(central nervous system；CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤或垂体腺瘤。虽不限定于此，但所述癌症干细胞可以为乳腺癌或肺癌的干细胞。
在本发明中，术语“乳腺癌干细胞”是指具有可分化成乳腺癌细胞的能力的未分化细胞。
在本发明中，术语“肺癌干细胞”是指具有可分化成肺癌细胞的能力的未分化细胞。
在本发明中，术语“乳腺癌干细胞生长抑制”为涵盖乳腺癌干细胞维持(maintenance)抑制、乳腺癌干细胞恶化(malignance)抑制、乳腺癌干细胞迁移及乳腺癌干细胞侵袭活性(invasive)抑制的意思。
在本发明中，术语“肺癌干细胞生长抑制”为涵盖肺癌干细胞维持(maintenance)抑制、肺癌干细胞恶化(malignance)抑制、肺癌干细胞迁移及肺癌干细胞侵袭活性(invasive)抑制的意思。
在本发明一实施例中，为了确认环索奈德是否可抑制乳腺癌干细胞的生长，在源自MCF-7及MDA-MB-231细胞的第一乳腺球(mammosphere)中处理了环索奈德，其结果，确认了环索奈德抑制源自乳腺癌细胞株的第一乳腺球的形成，具体而言，不仅确认了作为乳腺癌细胞的源自MCF-7及MDA-MB-231细胞的乳腺球的数量减少至90％，还确认了乳腺球的大小也减小的结果(图3的A部分及B部分)。然而，确认了属于相同糖皮质激素(Glucocorticoids)的泼尼松(prednisone)及地塞米松(dexamethasone)在80μM的高浓度下也无法抑制乳腺癌干细胞的生长(图3的C部分)。
并且，在本发明的另一实施例中，为了确认环索奈德是否可抑制肺癌干细胞的生长，在源自A549细胞的第一肿瘤球(tumorsphere)中处理了环索奈德，其结果，确认了环索奈德抑制源自肺癌细胞株的第一肿瘤球的形成，具体而言，不仅确认了作为肺癌细胞的源自A549细胞的肿瘤球的数量减少至90％，还确认了肿瘤球的大小也减小的结果(图9的A部分)。并且，处理了作为环索奈德的激活型的异丁酰基环索奈德(isobutyrylciclesonide)的结果，确认了在5μM及10μM中表现出肺癌干细胞抑制活性。但是，属于相同糖皮质激素(Glucocorticoids)的泼尼松及地塞米松在80μM中也未呈现出肺癌干细胞抑制活性(图9的C部分)。
由此，本发明的所述化合物可用于(i)抑制源自乳腺癌的乳腺球(mammosphere)的形成或(ii)抑制源自乳腺癌的乳腺球的增殖或(iii)抑制源自肺癌的肿瘤球(tumorsphere)的形成或(iv)抑制源自肺癌的肿瘤球的增殖。
在本发明一实施例中，所述乳腺癌干细胞可表达选自Nanog、C-myc、Oct4、Sox2及CD44中的一种以上的自我更新(self-renewal)基因，所述肺癌干细胞可表达选自Nanog、Sox2、C-myc及Snail中的一种以上的自我更新(self-renewal)基因。
在本发明一实施例中，确认了环索奈德抑制被周知为在乳腺癌干细胞中特征性表达的自我更新基因的表达，如Nanog、C-myc、Oct4、Sox2、CD44等(图6的A部分)，并确认了参与乳腺癌干细胞的乳腺球形成，并且抑制信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路(图5的A部分及B部分)。并且，确认了抑制被周知为参与乳腺癌干细胞的乳腺球形成的白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-8(IL-8)的生产抑制(图5的C部分)。由此，确认了所述化合物可抑制乳腺癌干细胞的生长。
并且，确认了环索奈德抑制被周知为在肺癌干细胞中特征性表达的自我更新基因的表达，如nanog、sox2、c-myc、snail等(图11A)，并确认了抑制被周知为参与肺癌干细胞的肿瘤球形成的白细胞介素-8(IL-8)的生产(图12)。由此，确认了所述化合物可抑制肺癌干细胞的生长。
本发明的所述组合物可用于药学组合物或食品组合物。
当本发明的所述组合物有效利用于药学组合物时，可包含所述环索奈德或其药学上可接受的盐。
在本发明中所使用的术语“其药学上可接受的盐”是指具有所述化合物所需的生物学和/或生理学活性且最小限度地表现出无需的毒理学效果的所有盐。意味着由本发明所属技术领域中常规方法制备的盐，这种制备方法为本领域普通技术人员所公知的。具体而言，所述其药学上可接受的盐包含由药理学或生理学上可接受的无机酸和有机酸及碱诱导的盐，但不限定于此。
例如，药剂学上可接受的碱加成盐可由无机碱及有机碱制备。由无机碱诱导的盐可包含但不限于钠、钾、锂、铵、钙及镁盐。由有机盐诱导的盐可包含但不限于伯胺、仲胺及叔胺；包含天然产生的取代胺的取代胺；以及环胺的盐，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、氨丁三醇(tromethamine)、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、水杨酸胺(hydrabamine)、胆碱(choline)、甜菜碱(betaine)、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱(theobromine)、嘌呤、哌嗪、哌啶和/或N-乙基哌啶。并且，其他羧酸衍生物，例如，包含羧酸酰胺(carboxamides)、低级烷基羧酸酰胺、二(低级烷基)羧酸酰胺等的羧酸酰胺。
例如，药学上可接受的酸加盐可由无机酸及有机酸制备。由无机酸诱导的盐包含盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。由有机酸诱导的盐可包含乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸(malic acid)、丙二酸、琥珀酸、马来酸(maleic acid)、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸(cinnamic acid)、扁桃酸(mandelic acid)、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和/或水杨酸等，但可不限定于此。
在本发明中，所述药学组合物可包含药学上可接受的载体(carrier)或添加剂。在本发明中，所述“药学上可接受的”为不抑制有效成分的活性的情况下适用(处方)对象不具有可适应的所述毒性的意思。所述“载体”被定义为使向细胞或组织内的化合物的附加变得容易的化合物。
本发明的环索奈德可单独给药或与任一种方便的载体等混合给药，这种给药剂型可以为单次给药或重复给药剂型。所述药学组合物可以为固体制剂或液态制剂。固体制剂具有散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、栓剂等，但不限定于此。固体制剂中可包含载体、香料、粘结剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂、填充剂等，但不限定于此。作为液态制剂，具有如水、丙二醇溶液等的溶液剂、悬浮液剂、乳剂等，但不限定于此，可添加适当的着色剂、香料、稳定剂、粘稠剂等来制备。例如，散剂可通过单纯混合作为本发明的有效成分的环索奈德及乳糖、淀粉、微晶纤维素等药剂学上可接受的适当的载体来制备。颗粒剂可通过混合本发明的所述环索奈德、药学上可接受的适当的载以及聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素等的药学上可接受的适当的粘结剂之后，适用利用水、乙醇、异丙醇等的溶剂的湿法造粒方法或利用压缩力的干法造粒方法来制备。并且，片剂可通过使所述颗粒剂与硬脂酸镁等的药学上可接受的适当的润滑剂混合之后，利用压片机进行压片来制备。
本发明的环索奈德可根据需要治疗的疾病及个体的状态，利用口服制剂、注射剂(例如，肌内注射、腹腔注射、静脉注射、输注(infusion)、皮下注射、植入)、吸入剂、滴鼻剂、阴道栓剂、直肠给药剂、泻下剂、经皮给药剂、外用制剂等来进行给药，但不限定于此。通常根据给药途径使用，并且可配制成作为非毒性的且包含药学上可接受的载体、添加剂、赋形剂的适当的给药单元剂型。
本发明的药学组合物可每天给药约0.0001mg/kg至约10g/kg，并且可每日给药约0.001mg/kg至约1g/kg的剂量。然而，所述剂量可根据所述混合物的提纯程度、患者的状态(年龄、性别、体重等)、治疗状态的严重程度等而不同。根据需要，为了便利可将每日总剂量一天分为多次来给药。
当本发明的组合物用作药学组合物时，所述组合物内的环索奈德的含量可根据疾病的症状、症状的发展程度、患者的状态等来适当调节可表现出抗炎活性的有效量，例如，以整体组合物总重量为基准，所述环索奈德的量可以为0.0001重量百分比以上，具体地，可以为0.001重量百分比以上且80重量百分比以下，具体地，可以为50重量百分比以下，但不限定于此。
并且，确认了本发明的所述环索奈德抑制源自乳腺癌细胞的乳腺球的生长(增殖)，并且可用作用于抑制乳腺癌干细胞的生长的食品组合物。并且，确认了所述环索奈德抑制源自肺癌细胞的肿瘤球的生长(增殖)，并且可用作用于抑制肺癌干细胞的生长的食品组合物。
当本发明的所述组合物用作食品组合物时，可包含可接受的食品辅助添加剂，还可包含通常用于食品的制备的适当载体、赋形剂及稀释剂。
在本发明中，食品是指含有一种或一种以上的营养素的天然产物或加工品，具体而言，是指经某种程度的加工工序后成为可直接食用的状态，作为通常的含义，包括所有各种食品、功能性食品、饮料、食品添加剂及饮料添加剂的含义。作为所述食品的示例，包括各种食品类、饮料、口香糖、茶、维生素复合物、功能性食品等。额外地，本发明的食品中包括特殊营养食品(例如，粗制乳类、婴幼儿食品等)、食肉加工品、鱼肉制品、豆腐类、凉粉类、面类(例如，拉面类、面条类等)、健康辅助食品、调味食品(例如，酱油、大酱、辣椒酱、混合酱等)、酱汁类、糕点类(例如，快餐类)、肉加工品(例如，发酵油、奶酪等)、其他加工食品、泡菜、腌制食品(各种泡菜类、酱菜等)、饮料(例如，水果、蔬菜类饮料、豆油类、发酵饮料类、冰淇淋类等)、天然调味料(例如，拉面汤汁等)、维生素复合物、酒精饮料、酒类及其他的保健品类，但不限定于此。所述功能性食品、饮料、食品添加剂或饮料添加剂可利用常规制备方法来制备。
所述“功能性食品”是指利用物理、生物化学、生物工学技术等向食品赋予附加价值的食品组以使对特定目的起到作用及表达相应食品的功能或者经过设计及加工以对身体充分表达食品组成所具有的生物防御节律、疾病预防及恢复等相关的体内调节功能的食品，具体地，可以为健康功能食品。
在本发明中使用的术语“健康功能食品”是指利用具有对人体有用的功能性的原料或成分来制备及加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液态及丸等形态的食品。在这里，所谓“功能”是指对人体的结构及功能获得有用于调节营养素或如生理学作用等的保健用途的效果。本发明的健康功能食品可通过本领域中常规使用的方法来制备，在所述制备时，可通过添加本领域中通常添加的原料及成分来制备。并且，当所述健康功能食品的剂型被认定为健康功能食品的剂型时，可无限制地进行制备。本发明的食品用组合物可制备成多种形态的剂型，不同于普通药物,由于以食品为原料，因此存在不具有长期服用药物时有可能发生的副作用等优点，携带性优秀，因此本发明的健康功能食品可作为用于增强乳腺癌及肺癌干细胞生长抑制的效果辅助剂来进行摄取。
并且，所述功能性食品中可包含食品学上可接受的食品辅助添加剂，还可包含功能性食品的制备中通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂。
并且，在所述食品组合物中，所述环索奈德的量可以为食品组合物总重量的0.00001重量百分比以上，具体地，可以为0.1重量百分比以上且80重量百分比以下，具体地，可以为50重量百分比以下，更具体地，可包含40重量百分比以下，当所述食品为饮料时，以总食品体积100ml为基准，能够以0.001g以上的比例包含，具体地，能够以0.01g以上且50g以下的比例包含，具体地，能够以10g以下的比例，更具体地，能够以2g以下的比例包含，但不限定于此。
在本发明的食品组合物中，除了其有效成分之外，可包含甜味剂、风味剂、生理活性成分、矿物质等。甜味剂能够以食品具有适当的甜味的量来使用，并且可以为天然的或合成的。具体地，在使用天然甜味剂的情况下，作为天然甜味剂，可例举有玉米糖浆固形物、蜂蜜、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖等的糖甜味剂。风味剂可用作增强味道或香气的方面，可使用天然的和合成的。具体地，为使用天然的情况。当使用天然的风味剂时，除了风味之外还可兼顾增强营养的目的。作为天然风味剂，可以为由苹果、柠檬、柑橘、葡萄、草莓、桃子等获得或者可以为由绿茶叶、蒲公英、竹叶、肉桂、菊花叶、茉莉花等获得。并且，可使用由人参(红参)、竹笋、芦荟叶汁、银杏等获得的。天然风味剂可以为液态浓缩液或固态的提取物。根据情况，可使用合成风味剂，合成风味剂可利用酯类、醇类、醛类、萜类等。作为生理活性物质，可使用如儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素等的儿茶素类或视黄醇、抗坏血酸、生育酚、钙化醇、硫胺素、核黄素等的维生素类等。作为矿物质，可利用钙、镁、铬、钴、铜、氟化物、锗、碘、铁、锂、镁、锰、钼、磷、钾、硒、硅、钠、硫、钒、锌等。
并且，除了所述甜味剂等之外，本发明的食品组合物可根据需要包含防腐剂、乳化剂、酸味剂、增稠剂等。
优选地，这些防腐剂、乳化剂等在它们可实现添加的用途的条件下添加极少量来使用。所谓极少量是指在以数据来表现的情况下以食品组合物总重量为基准时处于0.0005重量百分比至约0.5重量百分比的范围。作为可使用的防腐剂，可例举有山梨酸钙、山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钙、苯甲酸钠、苯甲酸钾、乙二胺四乙酸(EDTA)等。作为可使用的乳化剂，可例举有金合欢胶、羧甲基纤维素、黄原胶、果胶等。作为可使用的酸味剂，盐酸、苹果酸、富马酸、己二酸、磷酸、葡萄糖酸、酒石酸、抗坏血酸、乙酸、磷酸等。除了增强味道的目的之外，这种酸味剂还能够以抑制微生物的增殖的目的以食品组合物具有适当酸度的方式添加。作为可使用的增稠剂，可例举有悬浮剂、沉淀剂、凝胶形成剂、溶胀剂等。
本发明以再一方案提供包含所述用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于治疗或预防癌症的药学组合物。
在本发明一实施例中，在MCF-7细胞株及MDA-MB-231细胞株中处理环索奈德的情况下，确认了乳腺癌细胞株的生长得以抑制(图1的A部分及B部分)。并且，通过环索奈德的处理，确认了MDA-MB-231细胞中形成细胞凋亡小体(apoptotic bodies)(图1的E部分)。
在本发明的另一实施例中，在A549细胞中处理环索奈德的情况下，确认了肺癌细胞株的生长得以抑制(图7的A部分)。并且，通过环索奈德的处理，确认了A549细胞中形成细胞凋亡小体(apoptotic bodies)(图7的B部分)。
由此，本发明的组合物可利用于乳腺癌或肺癌的治疗或预防用药学组合物。
并且，在本发明一实施例中，确认了环索奈德抑制剂在乳腺癌细胞中使表达CD44high/CD24low的母群减少(图4的A部分)，并且使乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性乳腺癌细胞的比例减少(图4的B部分)。并且，确认了使乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性肺癌细胞的比例减少(图10)。由此，所述组合物可抑制用于表达CD44high/CD24low的乳腺癌细胞的生长，可抑制乙醛脱氢酶(ALDH)阳性的乳腺癌细胞的生长，并且可抑制乙醛脱氢酶(ALDH)阳性的肺癌细胞的生长。
本发明以另一方案提供包含所属用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于抑制癌症转移的药学组合物。
所述癌症区分为存在与发生部位的原发癌及从所述产生部位扩散到身体的其他部位的转移性癌症。所述“癌症转移”是指恶性肿瘤扩散到远离发病器官的其他组织的状态。癌细胞通过血液循环或淋巴循环来扩散形成，大致沿着血液循环移向其他器官之后生成新的肿瘤。不同于此，癌细胞还可直接迁移至相邻器官而形成。在本发明中，癌症转移包括通过癌细胞直接转移并渗透至相邻组织的侵袭(invasion)的癌细胞的扩散以及癌细胞沿着血流迁移以物理性地从不与原发癌相邻的器官形成新的肿瘤的转移(metastasis)。另一方面，在所述癌症转移中，细胞的迁移为必须的。因此，显而易见的是，阻断这种癌细胞的迁移为预防癌症转移的第一方法。
在本发明中，所述癌症不限定于此，但可以为乳腺癌或肺癌。在本发明中，对于术语“癌症”、“癌症干细胞”、“癌症干细胞生长抑制”、“药学组合物”的说明如上文中所述。
在本发明一实施例中，确认了环索奈德浓度依赖性地抑制MDA-MB-231细胞的迁移及菌落的形成(图1的F部分及G部分)。
并且，在本发明的再一实施例中，确认了所述环索奈德抑制A549细胞的迁移及菌落的形成(图7的E部分及F部分)。
由此，所述本发明的组合物通过抑制癌细胞的迁移来抑制癌症转移，因此可有效利用于癌症的转移抑制用药学组合物。
本发明以还一方案提供包含所述用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于改善或预防癌症的食品组合物。
在本发明中，对于术语“癌症”、“癌症干细胞”、“癌症干细胞生长抑制”、“食品组合物”的说明如上文中所述。在本发明一实施例中，在MCF-7细胞株及MDA-MB-231细胞株中处理环索奈德的情况下，确认了乳腺癌细胞株的生长得以抑制，在另一实施例中，当在A549细胞株中处理环索奈德时，确认了肺癌细胞株的生长得以抑制，从而可用作用于改善或预防癌症的食品组合物。在本发明中，所述癌症可以为乳腺癌或肺癌，但不限定于此。
本发明以又一方案提供包含所述用于抑制癌症干细胞的生长的组合物的用于改善或预防癌症转移的食品组合物。
在本发明中，对于术语“癌症转移”、“癌症干细胞”、“癌症干细胞生长抑制”、“食品组合物”的说明如上文中所述。在本发明一实施例中，确认了环索奈德浓度依赖性地抑制MDA-MB-231细胞的迁移及菌落的形成，在另一实施例中确认了环索奈德抑制A549细胞的迁移及菌落的形成，从而可用作用于改善或预防癌症转移的食品组合物。在本发明中，所述癌症可以为乳腺癌或肺癌，但不限定于此。
本发明以又一方案提供包括向个体给药由以下化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐的步骤的抑制癌症干细胞的生长的方法。
化学式1
在本发明中，对于术语“环索奈德”、“癌症”、“癌症干细胞”、“癌症干细胞生长抑制”的说明如上文中所述。
在本发明中，术语“个体”是指包括发生癌症转移或发生癌症的人类在内的所有动物。包括哺乳动物，如牛、猪、羊、鸡、狗、人类等、鸟类等，包括但不受限于通过本发明的所述组合物的给药来抑制癌症干细胞的生长，并由此癌症得以治疗的个体。
本发明的再一目的在于，提供包括向个体给药所述由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐的步骤的抑制癌症转移的方法。
在本发明中，对于术语“环索奈德“、“癌症“、“个体“、“癌症转移“的说明如上文中所述。
本发明的另一目的在于，提供包括向个体给药所述由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐的步骤的癌症的治疗或预防方法。
在本发明中，对于术语“环索奈德”、“癌症”、“个体”、“治疗”、“预防”的说明如上文中所述。
本发明的还一目的在于，提供所述由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐在制备用于抑制癌症干细胞的生长的药物中的用途。
在本发明中，对于术语“环索奈德”、“癌症”、“癌症干细胞”、“癌症干细胞生长抑制”的说明如上文中所述。
本发明的又一目的在于，提供所述由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐在制备用于抑制癌症转移的药物中的用途。
在本发明中，对于术语“环索奈德”、“癌症”、“癌症转移”的说明如上文中所述。
本发明的又一目的在于，提供所述由化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐在制备用于癌症的预防或治疗的药物中的用途。
在本发明中，对于术语“环索奈德”、“癌症”、“治疗”、“预防“的说明如上文中所述。
本发明的实施方式
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。然而，以下实施例仅用于例示本发明，本发明的内容并不限定于以下实施例。
A：实验材料及方法
实施例1：实验材料
包括非常低的粘附集群板块的6孔培养板从康宁(图克斯伯里，马萨诸塞州，美国)公司获得。环索奈德购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.，圣路易斯，密苏里州，美国)。细胞生存率利用CellTiter水溶液细胞增殖检测试剂盒(aqueousone solutioncell proliferation assay kit，普洛麦格(Promega)公司出品，麦迪逊，威斯康星州，美国)来测定。ALDEFLUORTM Kit购自加拿大干细胞技术有限公司(STEMC ELL TechnologiesInc，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大)。
实施例2-1：人乳腺癌细胞培养及乳腺球(mammospheres)形成
人乳腺癌细胞，MCF-7从美国菌种保存中心(American Type Culture Collection(ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)获取。MCF-7细胞及MDA-MB-231在包含10％的胎牛血清(FBS；美国海克隆(Hyclone)公司出品)、100U/mL青霉素及100μg/ml链霉素(美国海克隆(Hyclone)公司出品)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified EssentialMedium(DMEM)；Hyclone，洛根，犹他州，美国)中培养。所述MCF-7细胞在含有5％的CO2的加湿的培养箱中维持在37℃温度。细胞以1×106细胞的密度接种在10cm的培养皿中。为了建立第一乳腺球，悬浮有单细胞的MCF-7细胞以每孔3.5-4×104的细胞数量接种于包含2ml的完整的MammoCultTM培养基(complete MammoCultTM medium，加拿大干细胞技术有限公司(STEMCELL Technologies Inc)，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大)的超低附着6孔板(ultra-low attachment 6-well plates)。所述完整的MammoCultTM培养基以4μg/ml的肝素、0.48μg/mL的氢化可的松、100U/ml青霉素及100μg/mL的链霉素进行了补充。所述细胞在37℃温度且5％CO2培养箱培养了7天。
实施例2-2：人肺癌细胞培养及肿瘤球(tumorsphere)形成
人肺癌细胞、A549在与实施例2-1的乳腺癌细胞相同的培养条件下进行了培养。为了建立第一肿瘤球，悬浮有单细胞的A549细胞以每孔5×104的细胞数量接种于包含2ml的癌干优质培养基(Cancer Stem Premeium medium，富利瀚生物科技(ProMabBiotechnologies Inc)，里士满，加利福尼亚州，美国)的超低附着6孔板。所述细胞在37℃温度且5％CO2培养箱培养了10天。
实施例3-1：乳腺癌乳腺球的自动计算
培养了第10天时，将细胞培养板配置于扫描仪(爱普生(Epson)PerfectionV700PHOTO，韩国爱普生公司，首尔，韩国)中，并获得了乳腺球的8位灰度图像。低分辨率(300dpi)下图像利用NICE软件程序获得，并从ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/ mlclarke/NICE下载。为了计算，选择行与列的优选数字(例如，在6孔板的情况下，2x3)，并生成感兴趣区(ROIs)，在选择NICE程序(program)的椭圆形设置之后，每个ROIs通过移动所提供的ROI形状以及调节大小来进行了定义(define)。所述图像的背景信号利用阈值算法来进行了否定，并自动计算所选图像。对应于每孔乳腺球的数量/每孔接种的总细胞数量x100，所述乳腺球形成分析确定了乳腺球的形成效率(MFE，％)。
实施例3-2：肺癌肿瘤球(tumorsphere)的自动计算
以与所述实施例3-1相同的方法计算了肺癌肿瘤球，对应于每孔肿瘤球的数量/每孔接种的总细胞数量x100，所述肿瘤球形成分析确定了肿瘤球的形成效率(TFE，％)。
实施例4：胱天蛋白酶-3/7(Caspase-3/7)分析
乳腺癌细胞和肺癌细胞以不同的环索奈德的浓度处理了24小时。胱天蛋白酶-3/7活性遵循了制造商对Caspase-Glo3/7kit(普罗米加，威斯康星州，美国)的说明。将Caspase-Glo3/7试剂100μL添加至癌细胞培养96孔中。用平板密封覆盖平板并在室温下培养了1小时，利用读板光度计(plate-reading luminometer，Explorer，普罗米加，威斯康星州，美国)进行了测定。
实施例5：CD44及CD24表达流式细胞术分析(Flow cytometric analysis)
通过流式细胞仪(FACS)分析测定了MCF-7细胞中的CD44及CD24的表达。利用1X胰蛋白酶/EDTA来分离及收获细胞之后，使百万个细胞悬浮，用FITC缀合的抗-人CD44及PE缀合的抗-人CD24抗体(贝克顿迪金森公司(BD Pharmingen)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)标记，在4℃温度下培养了30分钟。接着，所述细胞用1X PBS清洗3次，并用流式细胞术分析(flow cytometry，Accuri C6，贝克顿迪金森公司(BD)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行了分析。
实施例6：膜联蛋白(Annexin)V/PI染色分析
癌细胞在6孔板中培养，在乳腺癌的情况下，与环索奈德20μM一同培养，在肺癌的情况下，与环索奈德10μM及20μM或二甲基亚砜(DMSO)一同培养了24小时。根据制造商的说明，凋亡细胞用PI及FITC-Annexin V双重染色。所述样品利用流式细胞术分析(Flowcytometry，Accuri C6，贝克顿迪金森公司(BD)，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行了分析。
实施例7：通过荧光染色法的细胞凋亡分析
将MDA-MB-231细胞在环索奈德20μM或将A549细胞在环索奈德30μM中处理了24小时，细胞在赫斯特(Hoechst)33258溶液(10mg/ml)中，在37℃温度下培养了30分钟。然后，用荧光显微镜观察了细胞。
实施例8：克隆源性分析
将MDA-MB-231或A549细胞以低密度接种于6孔板，在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中以不同的环索奈德浓度处理于MDA-MB-231，并以10μM的环索奈德在A549细胞中进行了处理。24小时之后，培养基替换为新的培养基，并培养了7天以使其生长。计算了所生长的菌落。
实施例9：划痕迁移分析
将MDA-MB-231或A549细胞接种于6孔板并生长成90％融合状态。利用灭菌白色微量移液器尖端，在细胞层中作出划痕。用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基清洗之后，乳腺癌或肺癌用环索奈德或二甲基亚砜(DMSO)进行了处理。在18小时时，用40倍光学显微镜对受伤地区(wounded areas)进行了拍摄。
实施例10-1：乳腺癌细胞增殖分析
利用CellTiter水溶液细胞增殖检测试剂盒测定了MCF-7及MDA-MB-231细胞的增殖速度。在环索奈德0μM、5μM、10μM、20μM、40μM及80μM的存在下，将MCF-7细胞及MDA-MB-231细胞在96-孔板中培养了48小时。根据制造商的协议，利用96孔板读数器(DynexRevelat ion，Dynex Ltd.，Billingshurst，UK)在490nm确定了吸光度。通过测定三组确定每个数据。
实施例10-2：肺癌细胞增殖分析
使用A549细胞来作为肺癌细胞，除了以0μM、10μM、20μM、40μM、80μM及100μM的浓度处理环索奈德之外，以与实施例10-1相同的方法进行。
实施例11：蛋白质印迹法
从环索奈德处理的MCF-7及MDA-MB-231乳腺球分离的蛋白质在10％SDS-PAGE上进行分离，并移至聚偏二氟乙烯膜(密理博(Millipore)公司出品，贝德福德，马萨诸塞州，美国)。在室温下，将所述膜封闭在含5％脱脂乳的PBS-吐温(Tween)20(0.1％，v/v)30分钟。所述印迹在4℃温度下过夜培养成含有一抗的封闭溶液。所用的一抗如下：信号转导及转录活化因子3(Stat3)、p65、Lamin B及phospho-Stat3(Cell Sig naling，Beverly，MA，美国)。β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology)用作了内参照。用PBS-吐温20(0.1％，v/v)清洗之后，所述印迹用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)偶联的二抗培养，并用化学发光检测试剂盒(圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)出品)致敏。
实施例12：ALDEFLUOR分析
ALDEFLUOR分析系统提供对于基于乙醛脱氢酶(ALDH)的活性的癌症干细胞(CSCs)的识别、评价及分离的新型接近法。将活性试剂BODIPY-氨基乙醛添加至乳腺癌细胞或肺癌细胞中，借助乙醛脱氢酶(ALDH)转换为荧光的BODIPY-氨基乙酸。作为ALDH抑制剂的二乙氨基苯甲醛(dieth ylaminobenzaldehyde，DEAB)用作阴性对照组。MCF-7细胞或A549细胞中用10μM或20μM的环索奈德处理24小时，ALDH阳性细胞的比例用ALDEFLUOR分析法进行了分析。ALDH阳性及阴性细胞利用C6 Accuri流式细胞术分析(贝克顿迪金森公司(BDBioscience)出品)进行了分类。
实施例13-1：产生乳腺癌细胞的免疫缺陷NOD-SCID(BALB/cSIc(nu/nu))雌性(female)裸鼠的化学疗法
总共12只的产生乳腺癌细胞的NOD-SCID(BALB/cSIc(nu/nu))雌性裸鼠分为两组。作为阴性对照组的6只小鼠未受到化学疗法。对照组小鼠的肿瘤的体积每3天测定，并利用式(宽度×长度2)/2来进行了计算。其他6只裸鼠以10mg/kg/天(day)的最佳剂量并利用注射工序受到了试验药物来作为现有化学疗法。
实施例13-2：产生肺癌细胞的免疫缺陷NOD-SCID(BALB/cSIc(nu/nu))雄性(male)裸鼠的化学疗法
总共12只的产生肺癌的NOD-SCID(BALB/cSIc(nu/nu)雄性裸鼠分为2组。作为阴性对照组的6只小鼠未受到化学疗法。对照组小鼠的肿瘤的体积每3天测定，并利用式(宽度×长度2)/2来进行了计算。其他6只裸鼠以10mg/kg/天的最佳剂量并利用注射工序受到了试验药物来作为现有化学疗法。
实施例14：实时聚合酶链式反应(realtime RT-PCR)
根据制造商的说明，利用SYBR Green作为双链DNA特异性染料，通过一步法SYBRPrimeScript逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(One Step SYBR PrimeScript RT-PCRkit，宝日公司(Takara)，东京，日本)测定了转录物的水平。一步法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)在每反应20μL的最终体积中，包含对于1μg的总核糖核酸(total RNA)、10μl的2X一步法SYBR PrimeScript逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)缓冲液IV、1μl的PrimeScript一步酶混合物II(PrimeScript 1step Enzyme Mix II)、CD44、NANOG、OCT4、C-myc、Sox2、Snail及β-actin的10μM的聚合酶链反应(PCR)正向引物及聚合酶链反应(PCR)反向引物来进行。
所述正向、反向引物如下。
CD44正向引物(forward primer)：AGAAGGTGTGGGCAGAAGAA(序列号1),
CD44反向引物(reverse primer)：AAATGCACCATTTCCTGAGA(序列号2),
NANOG正向引物(forward primer)：ATGCCTCACACGGAGACTGT(序列号3),
NANOG反向引物(reverse primer)：AAGTGGGTTGTTTGCCTTTG(序列号4),
OCT4正向引物(forward primer)：AGCAAAACCCGGAGGAGT(序列号5),
OCT4反向引物(reverse primer)：CCACATCGGCCTGTGTATATC(序列号6),
SOX2正向引物(forward primer)：TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA(序列号7),
SOX2反向引物(reverse primer)：CTGGGGCTCAAACTTCTCTC(序列号8),
C-myc正向引物(forward primer)：AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC(序列号9),
C-myc反向引物(reverse primer)：GTCGTTTCCGCAACAAGTCCTCTTC(序列号10),
β-actin正向引物(forward primer)：TGTTACCAACTGGGACGACA(序列号11),
β-actin反向引物(reverse primer)：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA(序列号12)，
Snail正向引物(forward primer)：ACCACTATGCCGCGCTCTT(序列号15)，
Snail反向引物(reverse primer)：GGTCGTAGGGCTGCTGGAA(序列号16)。
靶基因的信使核糖核酸(mRNA)的相对表达量利用比较CT法进行了计算。至少3个独立的聚合酶链式反应(PCR)步骤根据统计分析进行。聚合酶链式反应(PCR)产物通过内部对照组(internal control)利用β-肌动蛋白基因来进行了标准化。
实施例15：人炎性细胞因子分析
炎性细胞因子根据制造商的说明，利用贝克顿迪金森公司(BD)出品的细胞计数珠阵列(cytometric bead array，CBA)人炎症细胞因子试剂盒(human inflammatorycytokines kit)来测定(贝克顿迪金森公司(BD)，圣地亚哥，CA,美国)。
对所混合的捕获珠子(capture beads)进行涡旋，将珠子(beads)50μl添加至分析管中。将人炎性细胞因子标准50μl和所培养的肿瘤球溶液加入分析管中之后，混合了细胞因子PE溶液。3小时之后，清洗所述混合的溶液，并利用流式细胞术分析(flow cytometry)进行了分析(Accuri C6，贝克顿迪金森公司(BD)，SanDiego，加利福尼亚州，美国)。
实施例16：电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobility shift assays，EMSA)
电泳迁移率变动分析(EMSA)根据制造商的说明，并利用Lightshift的chemiluminscet EMSA试剂盒(赛默飞世尔(Thermoscientific)公司出品，伊利诺斯州，美国)进行了检测。Stat3探针(Stat3probe)的生物素-顶部及下部探针(5′-CTTCATTTCCCGGAAATCCCTA-Biotin3′，序列号13及5′-TAGGGATTTCCGGGAAATGAAG-Biotin3′，序列号14)退火，并用生物素末端标记了所述双链寡核苷酸。从MCF-7、MDA-MB-231及A549细胞的核提取物如参考文献中所示来制备(Choi HS，Hwang CK，Kim CS，Song KY，Law PY，WeiLN and Loh HH.Transcriptional regulati on of mouse mu opioid receptor gene：Sp3isoforms(M1，M2)func tion as repressors in neuronal cells to regulate themu opioid receptor gene.Mol Pharmacol.2005；67(5):1674-1683)。
生物素标记的DNA探针在室温下包含1μg/μL poly[dI-dC])的最终体积20μL的EMSA缓冲液中培养了环索奈德处理的核蛋白质20分钟。所述反应混合物在4℃温度0.5×TBE(45mM的Trisborate及1mM的EDTA)中在4％的聚丙烯酰胺非改性凝胶中进行了电泳，并利用化学发光核酸检测试剂盒(赛默飞世尔(Thermoscientific)公司出品，伊利诺斯州，美国)进行了可视化。
实施例17：统计分析
所有数据以平均±标准偏差(SD)来表示。数据利用student’s t-test进行了分析。低于0.05的p值被视为统计学上具有显著性(GraphP ad Prism 5Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。
对乳腺癌干细胞及乳腺癌的效果分析
实验例1：环索奈德(ciclesonide)诱导人乳腺癌细胞的细胞凋亡并抑制增殖的效果
为了研究作为图1A中所示的环索奈德的人乳腺癌细胞株的MCF-7及MDA-MB-231中抗增殖效果，按照各个浓度处理环索奈德之后，进行了MTS分析。其结果，确认了环索奈德处理48小时之后，在MCF-7及MDA-MB-231细胞株中，环索奈德10μM以上的浓度中浓度依赖性地抑制乳腺癌细胞株的生长(图1的A部分及B部分)。
接着，确认了A-MB-231细胞中凋亡的乳腺癌细胞数量(膜联蛋白V+)分别通过环索奈德20μM处理而增加(图1的C部分)。
接着，在DA-MB-231细胞中进行了半胱天冬酶3/7的荧光分析，其结果，确认了在环索奈德40μM及80μM中诱导半胱天冬酶3/7的活性(图1的D部分)。并且，通过环索奈德处理，确认了MDA-MB-231细胞中细胞凋亡小体(apoptotic bodies)的形成(图1的E部分)。并且，环索奈德抑制了MDA-MB-231细胞的迁移及菌落的形成(图1的F部分及G部分)。这些结果意味着环索奈德有效抑制多种癌症(增殖、迁移、细胞凋亡及菌落形成)。
实验例2：环索奈德在异种移植模型中抑制肿瘤生长的效果
在图1中确认了环索奈德在试验管中抑制乳腺癌细胞的增殖。接着，研究了环索奈德在异种移植肿瘤模型(xenograft tumor model)中是否抑制肿瘤诱发。在环索奈德给药组中，肿瘤体积小于未处理环索奈德的对照组(图2的A部分及C部分)。并且，在环索奈德处理组中，肿瘤重量也小于未处理环索奈德的对照组(图2的B部分)。但是，环索奈德处理组中的小鼠的体重与对照组相似(图2的A部分)。这种结果意味着环索奈德在异种移植模型中有效抑制肿瘤的发生。
实验例3：环索奈德抑制乳腺癌干细胞的效果
为了评价环索奈德是否抑制乳腺球的形成，在源自MCF-7及MDA-MB-231细胞的第一乳腺球(mammosphere)中处理了不同浓度的环索奈德。如图3中所示，环索奈德抑制了源自乳腺癌细胞株的第一乳腺球的形成。乳腺球的数量减少至90％，乳腺球的大小也得以减小(图3的A部分及B部分)。
接着，利用现在多用于药物的作为糖皮质激素(Glucocorticoids)的泼尼松(prednisone)和地塞米松(dexamethasone)的比较实验的结果确认，不同于在10μM浓度环索奈德显著抑制乳腺癌干细胞的生长的情况，属于相同的糖皮质激素(Glucocorticoids)的泼尼松(prednisone)和地塞米松(dexamethasone)在80μM的高浓度下也不抑制乳腺癌干细胞的生长(图3的C部分)。
因此，可知，不同于以往的类固醇，环索奈德有效抑制乳腺癌干细胞。
实验例4：环索奈德使表达CD44high/CD24low的群及乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性乳腺癌细胞的比例减少的效果
在MCF-7细胞中处理了环索奈德24小时，在乳腺癌细胞中表达CD44high/CD24low的亚群(subpopulation)中研究了所述环索奈德抑制剂的效果。其结果，所述环索奈德抑制剂使在乳腺癌细胞中表达CD44high/CD24low的群减少(图4的A部分)。为了研究在MCF-7细胞中处理环索奈德24小时并在乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性乳腺癌细胞的比例中的环索奈德抑制剂的效果，进行了ALDEFLUOR分析。其结果，确认了环索奈德使乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性乳腺癌细胞的比例减小(图4的B部分)。
实验例5：环索奈德在乳腺球中抑制信号转导及转录活化因子3(STAT3)信号传导通路的效果
为了研究环索奈德的细胞功能，在环索奈德处理下，在源自MCF-7细胞的乳腺球中研究了信号转导及转录活化因子3(STAT3)的磷酸化状态。其结果，相对于对照组，环索奈德使核信号转导及转录活化因子3(STAT3)蛋白的磷酸化减少(图5的A部分)。
并且，利用与信号转导及转录活化因子3(STAT3)以高亲和力相结合的生物素标记的SIE结合探针，来分析了环索奈德处理的核提取物和Stat3 DNA的结合。如图5的B部分所示，环索奈德抑制了生物素标记的SIE探针与Stat3之间的结合(图5的B部分，通道3)。pStat3/生物素标记的SIE探针的特异性利用未标记的多余自身竞争者(unlabeled excessself-competitor)(图5的B部分，通道4)和突变的SIE竞争者(mutated-Stat competitor)(图5的B部分，通道5)来进行了确认。通过这些数据可知，信号转导及转录活化因子3(Stat3)信号传导途径对于调节乳腺球的生长和自我更新的方面上是重要的。
实验例6：对于源自MDA-MB-231细胞的乳腺球的增殖和白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)生产的环索奈德的效果
已知，所分泌的白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)对乳腺球的形成起到重要作用(Sansone P，Storci G，Tavolari S，Guarnieri T，Giovannini C，Taffurelli M，Ceccarelli C，Santini D，Paterini P，Marcu KB，Chieco P and Bonafe M.IL-6triggersmalignant features in mammospheres from human ductal breastcarcinoma and normal mammary gland.J Clin Invest.2007；117(12):3988-4002)。对此，为了确认所分泌的白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的生产量，利用流式细胞仪(flow cytometer)进行了炎性细胞因子分析。
其结果，如炎性细胞因子分析数据中所示，通过环索奈德处理，所分泌的白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的生产水平降低。内部对照组利用了未处理环索奈德的MDA-MB-231乳腺球培养液(图5的C部分)。
实验例7：环索奈德抑制癌症干细胞(CSCs)的自我更新基因表达及乳腺球的增殖的效果
为了确认环索奈德是否抑制自我更新基因的表达，通过实时聚合酶链式反应(realtime RT-PCR)研究了自我更新基因表达。其结果，环索奈德在乳腺癌细胞中使如Nanog、Sox2、Oct4、C-myc及CD44等的自我更新基因的表达降低(图6的A部分)。
接着，为了确认环索奈德是否抑制乳腺球的增殖，在乳腺球中处理了环索奈德，并计算了乳腺球的细胞数量。其结果，环索奈德诱导了乳腺球的细胞凋亡，环索奈德处理的乳腺球中所观察到的细胞数量较少。通过这些结果可知，环索奈德使乳腺球增殖大大降低(图6的B部分)。
对肺癌干细胞及肺癌的效果分析
实验例8：环索奈德的诱导人肺癌细胞的细胞凋亡并抑制增殖的效果
为了研究作为人肺癌细胞株的A549细胞中的环索奈德的抗增殖效果，将图7的A部分中所示的环索奈德按照各个浓度进行处理之后，进行了MTS分析。其结果，环索奈德处理48小时之后，在A549细胞株中，在环索奈德40μM以上的情况下确认了浓度依赖性地抑制肺癌细胞株的生长(图7的A部分)。
并且，通过环索奈德处理，确认了A549细胞中的细胞凋亡小体(apoptoticbodies)的形成(图7的B部分)。
接着，确认了A549细胞中所凋亡的肺癌细胞数量(膜联蛋白V+)通过环索奈德10μM及20μM的处理而增加(图7的C部分)。并且，在A549细胞中进行了半胱天冬酶3/7的荧光分析，其结果，确认了环索奈德80μM中诱导半胱天冬酶3/7的活性(图7的D部分)。并且，环索奈德抑制了A549细胞的迁移和菌落形成(图7的E部分及F部分)。这些结果意味着环索奈德有效抑制多种癌症特征(增殖、迁移、细胞凋亡及菌落形成)。
实验例9：环索奈德在异种移植模型中抑制肿瘤生长的效果
在图7中确认了环索奈德在试验管中抑制肺癌细胞的增殖。接着，利用肺癌细胞来形成肿瘤以制备了异种移植肿瘤模型(xenograft tumor model)，并处理环索奈德来在每周测定肿瘤的大小以验证了效果。其结果，环索奈德给药组中的肿瘤体积小于未处理环索奈德的对照组(图8的A部分及C部分)。并且，环索奈德处理组中的肿瘤重量也小于未处理环索奈德的对照组(图8的B部分)。但是，环索奈德处理组中的小鼠的体重与对照组相似。这些结果意味着环索奈德在异种移植模型中有效抑制肿瘤的产生。即，意味着环索奈德在减少肿瘤大小及重量的方面上表现出优异的效果，并且环索奈德在肺癌治疗中呈现效果。
实验例10：环索奈德抑制肺癌干细胞的效果
为了评价环索奈德是否可抑制肿瘤球(tumorsphere)的形成，在源自A549细胞的第一肿瘤球(tumorsphere)中处理了不同浓度的环索奈德。如图9的A部分所示，环索奈德抑制了作为肺癌细胞株的源自A549细胞的第一肿瘤球的形成。肿瘤球的数量减少至～90％，肿瘤球的大小也明显减小(图9的A部分)。
并且，处理作为环索奈德的激活型的异丁酰基环索奈德(isobutyrylciclesonide)的结果确认，在5μM和10μM中表现出肺癌干细胞抑制活性。
但是，属于糖皮质激素(Glucocorticoids)的泼尼松龙及地塞米松在80μM中也未表现出肺癌干细胞抑制活性(图9的C部分)。
因此，可知环索奈德和作为激活型的异丁酰基环索奈德(isobutyrylciclesonide)比以往类固醇更有效地抑制源自肺癌的癌干细胞，并确认了所有糖皮质激素(Glucocorticoids)不抑制肺癌干细胞的生长。
实验例11：环索奈德使乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性肺癌细胞的比例减少的效果
接着，分析了在肺癌细胞中处理作为乙醛脱氢酶-1(ALDH)抑制剂的DEAB及处理环索奈德的作为肺癌干细胞标志物的乙醛脱氢酶-1(ALDH)。
A549细胞中处理了环索奈德24小时，为了研究乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性肺癌细胞的比例中的环索奈德抑制剂的效果，进行了ALDEFLUOR分析。其结果，确认了环索奈德使乙醛脱氢酶-1(ALDH)阳性肺癌细胞的比例减少(图10)。
实验例12：环索奈德的癌症干细胞(CSCs)标志物的表达及肿瘤球的增殖的抑制效果
为了确认环索奈德是否抑制作为癌症干细胞标志物的自我更新基因的表达，通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)来研究了自我更新基因表达。其结果，确认了通过环索奈德处理，与未处理环索奈德的组相比，nanog、sox2、c-myc及snail的基因表达减少(图11的A部分)。
接着，为了确认环索奈德是否抑制肿瘤球的增殖，在肿瘤球中处理了环索奈德，并计算了肿瘤球的细胞数量。环索奈德处理后，分析了肿瘤球(tumosphere)的生存癌细胞数量1天、2天、3天，最终在环索奈德处理组中抑制了肿瘤球的生长，但在非处理组中肿瘤球依旧生长(图11的B部分)。因此，可知环索奈德使肿瘤球增殖大大降低(图11的B部分)。
实验例13：环索奈德的肿瘤球中的白细胞介素-8(IL-8)的分泌抑制效果
众所周知，所分泌的白细胞介素-8(IL-8)在肿瘤球形成中起到重要作用(Ginestier C，Liu S，Diebel ME，Korkaya H，Luo M，Brown M，Wicinski J，Cabaud O，Charafe-Jauffret E，Birnbaum D，Guan JL，Dontugand Wicha MS.CXCR1blockadeselectively targets human breast cancer stem cells体外(in vitro)andinxenografts.J Clin Invest.2010；120(2):485-497)。
对此，为了确认所分泌的白细胞介素-8(IL-8)的生产量，利用流式细胞仪(flowcytometer)进行了炎性细胞因子分析。炎性细胞因子利用贝克顿迪金森公司(BD)出品的细胞计数珠阵列(cytometric bead array，CBA)人炎症细胞因子试剂盒(humaninflammatory cytokines kit)来测定。细胞计数珠阵列(CBA)分析利用白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-1β(IL-1β)及TNF抗体来进行。其结果，如图12的炎性细胞因子分析数据中所示，通过环索奈德处理，作为炎性细胞因子的白细胞介素-8(IL-8)的生产水平得以减少。图12的下图为以图形示出的白细胞介素-8(IL-8)生产量。因此，可知环索奈德抑制癌症干细胞维持中所必需的白细胞介素-8(IL-8)的分泌，从而抑制肺癌干细胞。
通过多个所述实验例确认到，本发明的环索奈德不仅抑制乳腺癌及肺癌的增殖，还抑制乳腺癌及肺癌的干细胞的生长，因此可知可以用于抑制乳腺癌、肺癌以及它们的干细胞的生长的用途。
本发明所属技术领域的普通技术人员可从以上说明中理解本发明在不变更其技术思想或必要特征的情况下能够以其他具体形态来实施。与此相关地，应理解，以上所描述的多个实施例在所有方面上为示例性的而非限定性的。本发明的范围应被解释为由下文中的发明要求保护范围的含义、范围以及其等同概念导出的所有变更或改变的形态涵盖于本发明的范围中，而不是所述详细说明。
<110> 济州大学校产学协力团
<120> 包含环索奈德的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物
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<223> OCT4正向引物
<400> 5
agcaaaaccc ggaggagt 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OCT4反向引物
<400> 6
ccacatcggc ctgtgtatat c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX2正向引物
<400> 7
ttgctgcctc tttaagacta gga 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SOX2反向引物
<400> 8
ctggggctca aacttctctc 20
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cmyc正向引物
<400> 9
aatgaaaagg cccccaaggt agttatcc 28
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cmyc反向引物
<400> 10
gtcgtttccg caacaagtcc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白正向引物
<400> 11
tgttaccaac tgggacgaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白反向引物
<400> 12
ggggtgttga aggtctcaaa 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号转导及转录活化因子3探针的生物素上链
<400> 13
cttcatttcc cggaaatccc ta 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号转导及转录活化因子3探针的生物素下链
<400> 14
tagggatttc cgggaaatga ag 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Snail正向引物
<400> 15
accactatgc cgcgctctt 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Snail反向引物
<400> 16
ggtcgtaggg ctgctggaa 19

Claims (14)

1.一种用于抑制癌症干细胞的生长的组合物，其特征在于，包含由以下化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分：
化学式1：
2.根据权利要求1所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物，其特征在于，所述癌症干细胞为乳腺癌或肺癌的干细胞。
3.根据权利要求1所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物，其特征在于，所述化合物为环索奈德。
4.根据权利要求1所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物，其特征在于，所述化合物用于(i)抑制源自乳腺癌的乳腺球的形成或(ii)抑制源自乳腺癌的乳腺球的增殖或(iii)抑制源自肺癌的肿瘤球的形成或(iv)抑制源自肺癌的肿瘤球的增殖。
5.根据权利要求2所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物，其特征在于，所述乳腺癌干细胞表达选自Nanog、C-myc、Oct4、Sox2及CD44中的一种以上的自我更新基因或者所述肺癌干细胞表达选自Nanog、Sox2、C-myc及Snail中的一种以上的自我更新基因。
6.一种用于治疗或预防癌症的药学组合物，其特征在于，包含权利要求1至5中任一项所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物。
7.根据权利要求6所述的用于治疗或预防癌症的药学组合物，其特征在于，所述癌症为乳腺癌或肺癌。
8.根据权利要求6所述的用于治疗或预防癌症的药学组合物，其特征在于，所述用于治疗或预防癌症的组合物抑制用于表达CD44high/CD24low的乳腺癌细胞的生长。
9.根据权利要求6所述的用于治疗或预防癌症的药学组合物，其特征在于，所述用于治疗或预防癌症的组合物抑制乙醛脱氢酶阳性的乳腺癌细胞的生长或者抑制乙醛脱氢酶阳性的肺癌细胞的生长。
10.一种用于抑制癌症转移的药学组合物，其特征在于，包含权利要求1至5中任一项所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物。
11.根据权利要求10所述的用于抑制癌症转移的药学组合物，其特征在于，所述癌症为乳腺癌或肺癌。
12.一种用于改善或预防癌症的食品组合物，其特征在于，包含权利要求1至5中任一项所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物。
13.一种用于改善或预防癌症转移的食品组合物，其特征在于，包含权利要求1至5中任一项所述的用于抑制癌症干细胞的生长的组合物。
14.一种抑制癌症干细胞的生长的方法，其特征在于，包括向个体给药由以下化学式1表示的环索奈德或其药学上可接受的盐：
化学式1：
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