CN110068636A - 一种刺猬紫檀hplc标准指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱，其具有6个特征峰，其中保留时间最长的所述特征峰的峰面积最大；以该峰面积最大的所述特征峰为参照峰，6个所述特征峰的相对保留时间tg分别为：0.376，0.416，0.548，0.685，0.837，1.000，RSD％<0.3％。本发明还公开了该图谱的构建方法和应用。本发明建立的刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱，通过对比特征峰的有无，可有效的进行刺猬紫檀真伪鉴别。

Description

一种刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及红木真伪鉴定领域，特别是涉及一种刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱及其构建方法和应用，该应用为刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱在鉴别刺猬紫檀真伪方面的应用。

背景技术

刺猬紫檀(Pterocarpus erinaceus Poir.)是一种紫檀属花梨木类数目。主要产地塞内加尔、几内亚比等热带非洲国家。是珍贵红木之一，是贵重家具及美术工艺品的原材料，由于其成材需要几十上百年的时间，加之自身材质耐用，能散发一定的香气，具有很高的市场价值和使用价值。市场所售刺猬紫檀常常会出现掺假现象，因此需要对其进行真伪鉴别。目前，珍贵红木鉴别的方法，主要是基于人工经验的传统植物学分类法即生物学显微结构检索表和计算机图像处理法，以及基于木材表面的光泽度、色度等物理指标的表观形态人工判别法，这些方法不仅费时费力，结果也具有主观不确定因素，难免出现误判。化学指纹图谱技术根据天然物质中化学物质整体信息为基础，借助数据挖掘技术和化学计量学算法进行指纹图谱构建，在天然物质的真伪鉴别上已经应用很广，特别是在中药材的质量控制、道地性和真伪鉴别方面受到国际社会的认可。目前还没有将化学指纹图谱技术应用在刺猬紫檀的真伪鉴别中。

发明内容

为解决现有技术中刺猬紫檀真伪鉴别费时费力，结果受主观不确定因素影响大的问题，本发明提供一种刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱及其构建方法，以及该刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱在鉴别刺猬紫檀真伪方面的应用。

本发明公开了一种刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱，其具有6个特征峰，其中保留时间最长的所述特征峰的峰面积最大；以该峰面积最大的所述特征峰为参照峰，6个所述特征峰的相对保留时间tg分别为：0.376，0.416，0.548，0.685，0.837，1.000，RSD％<0.3％。

进一步地，6个所述特征峰的相对峰面积分别为：0.0336，0.0547，0.0090，0.0222，0.0039，1.000，RSD<1.5。

进一步地，6个所述特征峰的保留时间分别为：31.862min、35.231min、46.415min、58.021min、63.243min、84.681min，RSD％<0.3％。

本发明还公开了一种如上所述的刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱的构建方法，其包括以下步骤：步骤一、供试品溶液的制备：称取刺猬紫檀心材部分木屑，加入甲醇、高纯水，震摇，超声提取，滤纸过滤，微孔滤膜过滤，得到所述供试品溶液；

步骤二、HPLC检测：将所述步骤一得到的供试品溶液进行HPLC检测，色谱条件为：Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；以水为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式：从0～20min，流动相B的体积百分含量由8％提高至23％，流动相A的体积百分含量由92％降低至77％；从20～33min,流动相B的体积百分含量为23％，流动相A的体积百分含量为77％；从33～43min，流动相B的体积百分含量由23％提高至30％，流动相A的体积百分含量由77％降低至70％；从43～53min,流动相B的体积百分含量30％，流动相A的体积百分含量为70％；从53～69min，流动相B的体积百分含量由30％提高至38％，流动相A的体积百分含量由70％降低至62％；从69～76min，流动相B的体积百分含量38％，流动相A的体积百分含量为62％；从76～91min，流动相B的体积百分含量由38％提高至49％，流动相A的体积百分含量由62％降低至51％；从91～92min，流动相B的体积百分含量49％，流动相A的体积百分含量为51％；从92～95min，流动相B的体积百分含量由49％降低至8％，流动相A的体积百分含量由51％提高至92％；从95～103min，流动相B的体积百分含量8％，流动相A的体积百分含量为92％；检测波长为290nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；得到HPLC检测结果。

进一步地，所述步骤一具体为：称取刺猬紫檀心材部分木屑0.2g，置于50mL离心管中，加入5mL甲醇、5mL高纯水，震摇5min，超声提取5min，滤纸过滤，再以0.2μm的微孔滤膜过滤，得到所述供试品溶液。

进一步地，称取刺猬紫檀心材部分木屑精确至小数点后三位。

进一步地，还包括步骤三、分析比较多批来源不同的刺猬紫檀的HPLC检测结果，得到由其共有特征峰构成的所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱。

进一步地，所述步骤三具体为：将所述多批来源不同的刺猬紫檀的HPLC检测结果导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，选取时间窗宽度为0.2min，以中位数生成对照谱图，经过多点校正后自动匹配，生成刺猬紫檀指纹图谱共有模式，并计算所述多批来源不同的刺猬紫檀的HPLC检测结果与该刺猬紫檀指纹图谱共有模式的相似度，使得所述相似度在0.984以上。

进一步地，还包括步骤四、所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱的精密度试验、重现性试验及稳定性试验。

进一步地，精密度试验具体为：取同一供试品溶液，连续进样6次，以6号特征峰(峰面积最大的特征峰)为参照峰，计算出1～6号共有特征峰的相对保留时间RSD值小于3％和相对峰面积的RSD值小于1，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.90，表明仪器稳定，精密度良好。特征峰的编号以保留时间从短到长进行依次排序，即从1号到6号特征峰的保留时间依次增长。

进一步地，重现性试验具体为：取同一批刺猬紫檀木屑，精密称取6份，按照步骤1供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，同时用相似度评价软件计算各HPLC指纹图谱的相似度均大于0.90，以6号峰为参照峰，计算出1～6号共有指纹峰的相对保留时间RSD值小于3％和相对峰面积的RSD值小于1，表明所述刺猬紫檀HPLC指纹图谱的构建方法重现性良好。

进一步地，稳定性试验具体为：取同一份供试品溶液，分别于0，3，6，9，15，24h进样检测，同时用相似度评价软件计算各HPLC指纹图谱的相似度均大于0.90，以6号峰为参照峰，计算出1～6号共有指纹峰的相对保留时间RSD％值小于3％和相对峰面积的RSD值小于1，表明供试品溶液在24小时内稳定。

本发明还公开了如上所述的刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱在鉴别刺猬紫檀真伪方面的应用。

进一步地，其应用方法为：疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱与所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱对比，根据其共有特征峰的有无，进行刺猬紫檀真伪鉴别。

进一步地，所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱的获得除色谱柱外，采用了如上所述的方法制备供试品溶液和进行HPLC检测；

当所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱采用Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm时，将所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱通过相似度分析软件与所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱进行多点校正和共有特征峰匹配的方式分析，对于相似度≥0.9，且与共有特征峰对应的保留时间31.862min、35.231min、46.415min、58.021min、63.243min、84.681min，分别相比相对标准偏差RSD％<0.5％，鉴定结果为刺猬紫檀，否则不是刺猬紫檀；

当所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱采用与Agilent Eclipse XDB-C18不同的其他C18色谱柱时，需要通过相对保留时间和相对峰面积作为指标进行判断是否有与所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱相同的共有特征峰，即将所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱，以其峰面积最大的峰，作为参照峰，以其对应的保留时间计算得出该样品指纹图谱相对保留时间，通过如果其含有标准指纹图谱中所有6个峰，且未知样品相对保留时间与标准指纹图谱的相对保留时间标准偏差小于2％，且未知样品相对峰面积与标准指纹图谱的相对峰面积标准偏差小于1，鉴定结果为刺猬紫檀，否则不是刺猬紫檀。

进一步地，当所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱采用Agilent EclipseXDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm时，设置刺猬紫檀真伪判断指标的方法如下：分别采用上述供试品溶剂制备方法和HPLC检测条件对正确定名的8个以上刺猬紫檀分组进行指纹图谱检测，并分别导入指纹图谱相似度分析软件，经过多点校正后自动匹配和共有特征峰匹配的方式，计算各自样品与刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱的相似度，并分成两组计算保留时间的相对标准偏差，以其最大的相似度和保留时间的相对标准偏差值确定鉴定判断指标。

进一步地，当所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱采用与Agilent EclipseXDB-C18不同的其他C18色谱柱时，设置刺猬紫檀真伪判断指标的方法如下：分别采用三种以上的色谱柱对正确定名的刺猬紫檀分组进行指纹图谱检测，并分别计算每组相对保留时间的相对标准偏差和相对峰面积的相对标准偏差，以其最大的相对标准偏差值确定鉴定判断指标。

本发明具有如下优点和用途：通过高效液相色谱(HPLC)建立刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱(模型)，并通过试验确定标准指纹图谱的精密度重现性及稳定性；对于通过木材形态学鉴定的疑似刺猬紫檀的红木，如果疑似刺猬紫檀样品的HPLC指纹图谱与建立刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱(模型)采用相同的色谱柱和色谱条件，那么可以利用指纹图谱相似度软件分析相似度，结合共有特征峰保留时间的标准偏差进行真伪判断；如果疑似刺猬紫檀样品的HPLC指纹图谱与建立刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱(模型)的色谱柱不同，其他色谱条件相同，分别计算与其面积最大峰的相对保留时间和相对面积的比值，如果其含有标准指纹图谱中所有6个峰，且未知样品相对保留时间与标准指纹图谱的相对保留时间偏差小于2％，而且与标准指纹图谱的相对峰面积偏差小于2，就可以确定该外形疑似刺猬紫檀的未知样品是刺猬紫檀，否则就不是，从而进行真伪鉴别，结果准确可靠。

附图说明

图1为刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱；

图2为8批刺猬紫檀的HPLC指纹图谱叠加图；

图3为精密度试验叠加图；

图4为重复性试验叠加图；

图5为稳定性试验叠加图；

图6为刺猬紫檀真伪鉴别流程图；

图7为疑似刺猬紫檀样品A与刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱的相似度比对图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的描述。

一.建立刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱，并通过试验确定标准指纹图谱的精密度、重现性及稳定性。

选用Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元梯度泵；MilliporeAdvantage A10超纯水系统(美国)；梅特勒-托利多AL204-IC电子分析天平(瑞士)；CBLphotoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超声波清洗器。

液相用乙腈为色谱纯；液相用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18,填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；

流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B，按照表1进行梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。

表1梯度洗脱程序

供试品溶液的制备：称取刺猬紫檀(已经通过传统木材学鉴定，被正确定名的样品)心材部分木屑0.2g(精确至0.001g)，置于50mL离心管中，加入5mL甲醇、5mL高纯水，震摇5min，超声提取5min，滤纸过滤，再以0.2μm的微孔滤膜过滤后备用。

指纹图谱的建立：测定8批刺猬紫檀HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的刺猬紫檀HPLC的标准指纹图谱，参见图1、图2。

选定该8批样品，将其导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，选取时间窗宽度为0.2min，以中位数生成对照谱图，经过多点校正后自动匹配，生成刺猬紫檀指纹图谱共有模式，并计算8批样品的指纹图谱与该共有模式的相似度。该共有模式含有共有特征峰六个，保留时间分别为31.862min、35.231min、46.415min、58.021min、63.243min、84.681min，RSD％<0.5％。8批刺猬紫檀与标准指纹图谱相似度计算结果分别为：0.998，0.995，0.984，0.999，1，0.998，0.999，0.999，8批样品的相似度在0.984以上，参见表2。以6号峰峰面积最大，以其为参照确定6个共有峰(即特征峰)为构成刺猬紫檀指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间和峰面积分别列于表3和表4，共有指纹峰的相对保留时间的RSD值均小于0.3％，由于红木立地条件的差异较大，1号峰的相对峰面积的RSD值小于0.5，2号峰的相对峰面积的RSD值小于0.8，3号峰的相对峰面积的RSD值小于0.7，4号峰的相对峰面积的RSD值小于0.5，5号峰的相对峰面积的RSD值小于1.5。6个共有峰的相对保留时间tg分别为：0.376，0.416，0.548，0.685，0.837，1.000，RSD％<0.3％。

表2 8批刺猬紫檀共有峰的相似度

表3 8批刺猬紫檀共有峰的相对保留时间

表4 8批刺猬紫檀共有峰的相对峰面积

精密度试验：取同一供试品溶液(C3)，连续进样5次，所得指纹图谱叠加图见图3。采用中药色谱指纹图谱评价分析系统2012版对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱对比，各图谱的相似度均大于0.984。以6号峰为参照峰，计算出1～6号共有指纹峰的相对保留时间的RSD值均小于3％和相对峰面积的RSD值均小于0.5，表明仪器稳定，精密度良好。结果见表5、6、7。

表5精密度试验指纹图谱相似度分析结果

表6精密度试验共有峰相对保留时间

表7精密度试验共有峰相对峰面积

重现性试验：取同一批刺猬紫檀木屑(C3)，精密称取5份，按供试品制备方法平行制备5份供试品溶液，分别进样，同法进行检测，所得指纹图谱叠加图见图4。采用相似对软件对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，5份样品的相似度均大于0.990。以6号峰为参照峰，计算出1～6号共有指纹峰的相对保留时间RSD值小于2％，由于天然红木样品的不均一性，4号峰相对峰面积的RSD值为0.9108，其他共有峰相对峰面积的RSD值均小于0.5，表明该方法共有峰保留时间重现性良好。结果见表8、9、10。

表8重现性试验指纹图谱相似度分析结果

表9重现性试验共有峰相对保留时间

表10重现性试验共有峰相对峰面积

稳定性试验：取同一份供试品溶液(C3)，分别于0，3，6，9，15，24h进样检测，所得指纹图谱叠加图见图5。采用相似对软件对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，6份样品的相似度均大于0.980。以9号峰为参照峰，计算出1～9号共有指纹峰的相对保留时间的RSD％值均小于1.5％和相对峰面积的RSD值小于0.3，表明供试品溶液在24小时内稳定。结果见表11、12、13。

表11稳定性试验指纹图谱相似度分析结果

表12稳定性试验共有峰相对保留时间

表13稳定性试验共有峰相对峰面积

二.设置疑似刺猬紫檀样品真伪的判断指标。

我们通过大量试验，即4组正确定名的刺猬紫檀，每组6个样品，进行指纹图谱的检测，确定疑似刺猬紫檀的红木样品的真伪判断指标。

供试品溶液的制备：称取正确定名的刺猬紫檀样品心材部分木屑0.2g(精确至0.001g)，置于50mL离心管中，加入5mL甲醇、5mL高纯水，震摇5min，超声提取5min，滤纸过滤，再以0.2μm的微孔滤膜过滤后备用。

使用前述与建立刺猬紫檀标准指纹图谱完全相同的流动相、梯度洗脱和仪器设备。即选用Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元梯度泵；MilliporeAdvantage A10超纯水系统(美国)；梅特勒-托利多AL204-IC电子分析天平(瑞士)；CBLphotoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超声波清洗器；液相用乙腈为色谱纯；液相用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

色谱条件：流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B，按照表1进行梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。

其中第一组和第四组色谱柱也完全采用与建立刺猬紫檀标准指纹图谱模型相同的色谱柱，Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；第二组采用与建立刺猬紫檀标准指纹图谱模型相同的色谱柱不同的其他C18色谱柱，AichromBond-1C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；第三组采用与建立刺猬紫檀标准指纹图谱模型相同的色谱柱不同的其他C18色谱柱，Agilent TC-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm。计算第一组和第四组正确定名的刺猬紫檀样品与刺猬紫檀标准指纹图谱的相似度，参见表14；计算第一组和第四组正确定名的刺猬紫檀样品与刺猬紫檀标准指纹图谱的六个共有特征峰保留时间的相对标准偏差，参见表15。并分别计算每组相对保留时间的标准偏差和相对峰面积的标准偏差，参见表16和17。

表14第一组和第四组正确定名的刺猬紫檀样品与刺猬紫檀标准指纹图谱的相似度

表15第一组和第四组正确定名的刺猬紫檀样品保留时间的相对标准偏差

表16四组正确定名的刺猬紫檀样品相对保留时间的相对标准偏差

表17四组正确定名的刺猬紫檀样品相对保留峰面积的相对标准偏差

对红木的鉴定，不能照搬中药材质量控制、道地性和真伪鉴别的指纹图谱方法。红木树种鉴定的相似度判断指标和相对保留时间、相对峰面积的标准偏差判断指标要比一般的中药材等一年生的植物的范围要宽一些，才有实用意义。作为HPLC指纹图谱，其保留时间的含义是对应样品所含的化学成分，峰面积含义是该化学成分的量，对于树木学上的刺猬紫檀的分类，其木材分布地理位置非常广泛，主要是非洲的冈比亚、加纳等国家，从鉴别角度上考虑，同一类树种含有相同的化学成分相对含有的化学成分含量来说，贡献更大，所以对于相对保留时间的相对标准偏差设定的判断标准要比相对峰面积的相对标准偏差更为严格。

1.色谱柱也完全采用与建立刺猬紫檀标准指纹图谱模型相同的色谱柱，AgilentEclipse XDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm。

将疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱通过相似度分析软件与刺猬紫檀的标准指纹图谱经行多点校正和共有特征峰匹配的方式分析，对于相似度≥0.9，且与共有特征峰对应的保留时间31.862min、35.231min、46.415min、58.021min、63.243min、84.681min，分别相比相对标准偏差RSD％<0.5％，鉴定结果为刺猬紫檀，否则不是刺猬紫檀。

2.对于采用与建立刺猬紫檀标准指纹图谱模型相同的色谱柱，Agilent EclipseXDB-C18，不同的其他C18色谱柱，获得的疑似刺猬紫檀样品的HPLC指纹图谱，需要通过相对保留时间和相对峰面积作为指标进行判断是否有与刺猬紫檀标准指纹图谱相同的共有特征峰。即将疑似刺猬紫檀的样品HPLC指纹图谱，以其峰面积最大的峰，作为参照峰，以其对应的保留时间计算得出该样品指纹图谱相对保留时间，通过如果其含有标准指纹图谱中所有6个峰，且未知样品相对保留时间与标准指纹图谱的相对保留时间偏差小于2％，且未知样品相对保留时间与标准指纹图谱的相对峰面积偏差小于1，鉴定结果为刺猬紫檀，否则不是刺猬紫檀。参见图6。

三.应用此刺猬紫檀指纹图谱对外形疑似刺猬紫檀样品A和B的进行真伪鉴别。

供试品溶液的制备：称取外形疑似刺猬紫檀的未知红木样品心材部分木屑0.2g(精确至0.001g)，置于50mL离心管中，加入5mL甲醇、5mL高纯水，震摇5min，超声提取5min，滤纸过滤，再以0.2μm的微孔滤膜过滤后备用。

使用前述与建立刺猬紫檀标准指纹图谱完全相同的流动相、梯度洗脱和仪器设备。即选用Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元梯度泵；MilliporeAdvantage A10超纯水系统(美国)；梅特勒-托利多AL204-IC电子分析天平(瑞士)；CBLphotoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超声波清洗器；液相用乙腈为色谱纯；液相用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

色谱条件：流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B，按照表1进行梯度洗脱；检测波长：290nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。以下该样品A和B分别选择不同的色谱柱进行检测，获得各自指纹图谱数据，并分别进行判断是否含有刺猬紫檀共有特征峰，参见图6。

1.样品A选择色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm，以获得HPLC指纹图谱数据。该样品的HPLC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”相似度分析软件与刺猬紫檀的标准指纹图谱经多点校正和共有特征峰匹配的方式分析，参见图7。疑似刺猬紫檀样品A与刺猬紫檀的标准相似度为0.999≥0.9，参见表18；疑似刺猬紫檀样品A与刺猬紫檀的标准共有特征峰保留时间的相对偏差<0.5，参见表19。所以该样品A鉴定结果是刺猬紫檀。

表18疑似刺猬紫檀样品A与刺猬紫檀的标准相似度分析

表19疑似刺猬紫檀样品A与刺猬紫檀的标准共有特征峰保留时间的相对偏差

2.样品B选择色谱柱选用AichromBond-1C18,填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm，以获得HPLC指纹图谱数据。以其峰面积最大的峰，作为参照峰，以其对应的保留时间计算得出该样品指纹图谱相对保留时间，见表20。样品B含有标准指纹图谱中所有共有特征峰相对保留时间分别相接近的六个峰，但是未知样品相对保留时间与标准指纹图谱的相对保留时间偏差大于2％，尽管其相对峰面积偏差小于1，鉴定结果不是刺猬紫檀。

表20刺猬紫檀样品B与刺猬紫檀的标准共有特征峰相对保留时间和相对峰面积

的相对偏差

该以上两结果与送检到国家木制品检测重点实验室的根据国标传统的结构学检测结果一致。

以上详细描述了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱，其特征在于，具有6个特征峰，其中保留时间最长的所述特征峰的峰面积最大；以该峰面积最大的所述特征峰为参照峰，6个所述特征峰的相对保留时间tg分别为：0.376，0.416，0.548，0.685，0.837，1.000，RSD％<0.3％。

2.如权利要求1所述的刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱，其特征在于，6个所述特征峰的相对峰面积分别为：0.0336，0.0547，0.0090，0.0222，0.0039，1.000，RSD<1.5。

3.一种如权利要求1所述的刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、供试品溶液的制备：称取刺猬紫檀心材部分木屑，加入甲醇、高纯水，震摇，超声提取，滤纸过滤，微孔滤膜过滤，得到所述供试品溶液；

步骤二、HPLC检测：将所述步骤一得到的供试品溶液进行HPLC检测，色谱条件为：Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；以水为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式：从0～20min，流动相B的体积百分含量由8％提高至23％，流动相A的体积百分含量由92％降低至77％；从20～33min,流动相B的体积百分含量为23％，流动相A的体积百分含量为77％；从33～43min，流动相B的体积百分含量由23％提高至30％，流动相A的体积百分含量由77％降低至70％；从43～53min,流动相B的体积百分含量30％，流动相A的体积百分含量为70％；从53～69min，流动相B的体积百分含量由30％提高至38％，流动相A的体积百分含量由70％降低至62％；从69～76min，流动相B的体积百分含量38％，流动相A的体积百分含量为62％；从76～91min，流动相B的体积百分含量由38％提高至49％，流动相A的体积百分含量由62％降低至51％；从91～92min，流动相B的体积百分含量49％，流动相A的体积百分含量为51％；从92～95min，流动相B的体积百分含量由49％降低至8％，流动相A的体积百分含量由51％提高至92％；从95～103min，流动相B的体积百分含量8％，流动相A的体积百分含量为92％；检测波长为290nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；得到HPLC检测结果。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤一具体为：称取刺猬紫檀心材部分木屑0.2g，置于50mL离心管中，加入5mL甲醇、5mL高纯水，震摇5min，超声提取5min，滤纸过滤，再以0.2μm的微孔滤膜过滤，得到所述供试品溶液。

5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括步骤三、分析比较多批来源不同的刺猬紫檀的HPLC检测结果，得到由其共有特征峰构成的所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤三具体为：将所述多批来源不同的刺猬紫檀的HPLC检测结果导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，选取时间窗宽度为0.2min，以中位数生成对照谱图，经过多点校正后自动匹配，生成刺猬紫檀指纹图谱共有模式，并计算所述多批来源不同的刺猬紫檀的HPLC检测结果与该刺猬紫檀指纹图谱共有模式的相似度，使得所述相似度在0.984以上。

7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，还包括步骤四、所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱的精密度试验、重现性试验及稳定性试验。

8.如权利要求1所述的刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱在鉴别刺猬紫檀真伪方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱与所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱对比，根据其共有特征峰的有无，进行刺猬紫檀真伪鉴别。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱的获得除色谱柱外，采用了如权利要求3或4所述的方法；

当所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱采用Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm时，将所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱通过相似度分析软件与所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱进行多点校正和共有特征峰匹配的方式分析，对于相似度≥0.9，且与共有特征峰对应的保留时间31.862min、35.231min、46.415min、58.021min、63.243min、84.681min，分别相比相对标准偏差RSD％<0.5％，鉴定结果为刺猬紫檀，否则不是刺猬紫檀；

当所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱采用与Agilent Eclipse XDB-C18不同的其他C18色谱柱时，需要通过相对保留时间和相对峰面积作为指标进行判断是否有与所述刺猬紫檀HPLC标准指纹图谱相同的共有特征峰，即将所述疑似刺猬紫檀的样品的HPLC指纹图谱，以其峰面积最大的峰，作为参照峰，以其对应的保留时间计算得出该样品指纹图谱相对保留时间，通过如果其含有标准指纹图谱中所有6个峰，且未知样品相对保留时间与标准指纹图谱的相对保留时间标准偏差小于2％，且未知样品相对峰面积与标准指纹图谱的相对峰面积标准偏差小于1，鉴定结果为刺猬紫檀，否则不是刺猬紫檀。