CN110066850A - 一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法，属于胆固醇含量检测技术领域，其检测灵敏度高、特异性强、线性范围宽，而且，该胆固醇含量检测试剂盒中的各试剂均较为稳定，易于储存。该胆固醇含量检测试剂盒，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X‑100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。

Description

一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于胆固醇含量检测技术领域，尤其涉及一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法。
背景技术
目前，国内外实验室中，通常都是采用商品化的酶法试剂盒在全自动仪器上检测血清中总胆固醇含量(total cholesterol，TC)。酶法检测血清TC的原理是以胆固醇酯酶水解胆固醇酯为游离胆固醇，以胆固醇氧化酶氧化胆固醇生成4-烯胆甾烷酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与酚类或苯胺类化合物及4-氨基安替比林或其类似物发生氧化、缩合反应，产生最大吸收波长为500～600nm的醌亚胺类化合物(Trinder反应)，在一定浓度范围内，醌亚胺类化合物的浓度与血清TC浓度呈正比，进而通过检测醌亚胺类化合物含量获得血清TC浓度。然而，现有酶法检测血清TC的灵敏度和特异性比较低，线性范围较窄，不能满足高浓度的胆固醇检测，在检测高浓度胆固醇时必须进行一定倍数的稀释，而且，天然酶不易储存、易变性。因此，如何提供一种灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定的胆固醇含量检测试剂盒及检测方法，是当前急需解决的一项技术难题。
发明内容
本发明针对上述的技术难题，提出一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法，其检测灵敏度高、特异性强、线性范围宽，而且，该胆固醇含量检测试剂盒中的各试剂均较为稳定，易于储存。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种胆固醇含量检测试剂盒，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X-100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。
作为优选，所述溶液A还包括氯化钠。
作为优选，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列为5’-AAAAA-3’。
作为优选，所述缓冲液为Hepes缓冲液或醋酸缓冲液。
作为优选，所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为7-10mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为60％-70％；所述Triton X-100异丙醇溶液中Triton X-100的体积百分比为30％-50％；所述溶液A中缓冲液的浓度为5-20mmol/L，pH为7-8；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为2-10mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为16-166μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为5-10nmol/L。
作为优选，所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为8.9mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷与水的体积比为2:1；所述Triton X-100异丙醇溶液中Triton X-100与异丙醇的体积比为2:3；所述溶液A中缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.6；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为5mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为66μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为6nmol/L。
作为优选，所述溶液A中氯化钠的浓度为30-200mmol/L。
作为优选，所述溶液A中氯化钠的浓度为150mmol/L。
本发明还提供了一种胆固醇含量检测方法，使用上述任一项技术方案所述的胆固醇含量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
血清样品预处理：向待测血清样品中加入氢氧化钾乙醇溶液以水解血清样品中的胆固醇酯；加入正己烷水溶液进行提取，并对提取液进行分离，得到血清样品提取物；用Triton X-100异丙醇溶液溶解血清样品提取物，得到预处理后的血清样品；
配制胆固醇标准溶液和加标血清样品：用溶液A配制系列浓度的胆固醇标准溶液；用溶液A将预处理后的血清样品稀释500倍，取稀释后的血清样品分别加入到系列浓度的胆固醇标准溶液中，得到系列加标血清样品；
配制检测剂：将氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合，二者反应后得到检测剂；
采用标准加入法测量胆固醇含量：将系列浓度的胆固醇标准溶液以及系列加标血清样品，分别与胆固醇氧化酶溶液混合，置于黑暗条件下温育，向各混合液中分别加入检测剂，得到系列空白标准检测样品和系列加标检测样品；对系列空白标准检测样品和系列加标检测样品分别进行荧光强度检测，分别绘制得到空白标准曲线和加标标准曲线；根据空白标准曲线和加标标准曲线，采用曲线延长法计算获得待测血清样品中胆固醇含量。
作为优选，血清样品预处理步骤中，待测血清样品、氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X-100异丙醇溶液的体积比为1:9:30:1；水解胆固醇酯时，在37℃下振荡进行，水解时间为1h；对提取液进行分离的具体步骤为：在5000rpm下对提取液离心处理5min，离心后取上清液，将上清液置于氮气气流下蒸干溶剂。
作为优选，配制系列加标血清样品时，稀释后的血清样品与胆固醇标准溶液的体积比为2:3。
作为优选，配制检测剂时，所述氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液的体积比为3:2，反应时间为30min。
作为优选，采用标准加入法测量胆固醇含量步骤中，采用标准加入法测量胆固醇含量步骤中，制备系列空白标准检测样品时加入的胆固醇标准溶液、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25，制备系列加标检测样品时加入的加标血清样品、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25；制备系列空白标准检测样品和系列加标检测样品时，在黑暗条件下温育时间为1h；系列空白标准检测样品和系列加标检测样品在进行荧光强度检测前，需室温静置1h；进行荧光强度检测的具体步骤为：在485nm激发波长下收集502-700nm的荧光光谱。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供的胆固醇含量检测试剂盒中，以氢氧化钾乙醇溶液水解胆固醇酯，以正己烷水溶液作为提取胆固醇的提取溶剂，以Triton X-100异丙醇溶液作为细胞裂解液，以胆固醇氧化酶溶液氧化胆固醇，以氧化镨与荧光标记DNA探针混合后作为检测剂，提供了一种全新的胆固醇含量检测试剂盒，基于氧化镨可淬灭荧光标记DNA探针的荧光信号，而胆固醇氧化生成的过氧化氢与氧化镨反应后可恢复荧光标记DNA探针的荧光信号的原理，通过检测恢复的荧光信号强度即可测得胆固醇含量，检测灵敏度更高、特异性更强、线性范围更宽；
2、本发明提供的胆固醇含量检测试剂盒中，采用的氧化镨为金属过氧化物纳米酶，相比于传统酶法检测试剂盒中的天然酶，其催化效率更高、更稳定，能适应更大范围的pH和温度变化，更易于储存；
3、本发明提供的胆固醇含量检测试剂盒中，添加的氯化钠能够增强荧光恢复强度，有利于提高试剂盒的检测灵敏度；
4、本发明提供的胆固醇含量检测方法，利用氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液和Triton X-100异丙醇溶液相配合对待测血清样品进行预处理，实现了对待测血清样品中胆固醇的充分提取，进而采用标准加入法，以氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合后得到的荧光淬灭的混合液作为检测剂，利用胆固醇氧化酶溶液分别对系列浓度的胆固醇标准溶液以及系列加标血清样品中的胆固醇进行氧化反应，利用反应液对检测剂的荧光进行恢复，通过检测恢复后的荧光强度测定胆固醇含量，相比于现有酶法，该胆固醇含量检测方法的检测灵敏度高，特异性强，线性范围宽。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的胆固醇含量检测方法的流程图；
图2为本发明实施例所提供的不同浓度的氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合反应后的荧光强度对比图；
图3为本发明实施例所提供的氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合反应时的荧光强度随时间变化图；
图4为本发明实施例所提供的不同缓冲液中氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合反应的荧光淬灭情况对比图；
图5为本发明实施例所提供的不同pH的Hepes缓冲液中荧光标记DNA探针的荧光信号恢复效果对比图；
图6为本发明实施例所提供的具有不同氯化钠浓度的溶液A中荧光标记DNA探针的荧光信号恢复效果对比图；
图7为本发明实施例所提供的不同种类荧光标记DNA探针的荧光淬灭和荧光恢复效果对比图；
图8为本发明实施例所提供的不同干扰物对荧光标记DNA探针的荧光恢复影响图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种胆固醇含量检测试剂盒，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X-100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。
上述胆固醇含量检测试剂盒中，氢氧化钾乙醇溶液可将胆固醇酯水解为胆固醇，正己烷水溶液作为提取胆固醇的提取溶剂，Triton X-100异丙醇溶液用于细胞裂解液，胆固醇氧化酶溶液能够氧化胆固醇生成4-烯胆甾烷酮和过氧化氢；氧化镨(Pr6O11)作为金属过氧化物酶具有酶活性，当其与荧光标记DNA探针混合后，可淬灭荧光标记DNA探针的荧光基团，而氧化镨与过氧化氢反应后可恢复荧光标记DNA探针的荧光信号，因而，氧化镨与荧光标记DNA探针混合后作为检测剂，通过检测荧光信号即可测得胆固醇含量，检测灵敏度更高、特异性更强、线性范围更宽。该胆固醇含量检测试剂盒中，采用的氧化镨(Pr6O11)为金属过氧化物纳米酶，相比于传统酶法检测试剂盒中的天然酶，其催化效率更高、更稳定，能适应更大范围的pH和温度变化，更易于储存。需要说明的是，配制胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液时，均以溶液A为溶剂，以避免在检测时出现各试剂不相溶的问题。
在一优选实施例中，所述溶液A还包括氯化钠。本优选实施例中添加的氯化钠能够增强荧光恢复强度，有利于提高检测灵敏度。
在一优选实施例中，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列为5’-AAAAA-3’。相比于其他荧光标记DNA探针，本优选实施例提供的FAM标记的腺嘌呤五聚体探针，与氧化镨相配合，用于检测胆固醇含量时，具有更好的荧光恢复强度。
在一优选实施例中，所述缓冲液为Hepes缓冲液或醋酸缓冲液。采用Hepes缓冲液或醋酸缓冲液时，氧化镨对荧光标记DNA探针的荧光信号具有较好的淬灭效果。
在一优选实施例中，所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为7-10mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为60％-70％；所述Triton X-100异丙醇溶液中Triton X-100的体积百分比为30％-50％；所述溶液A中缓冲液的浓度为5-20mmol/L，pH为7-8；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为2-10mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为16-166μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为5-10nmol/L。本优选实施例提供了上述胆固醇含量检测试剂盒中各试剂优选的浓度范围，各试剂在上述优选浓度范围内，能够获得较好的荧光恢复强度，有利于保证检测效果。各试剂最优选的参数如下：所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为8.9mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷与水的体积比为2:1；所述Triton X-100异丙醇溶液中TritonX-100与异丙醇的体积比为2:3；所述溶液A中缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.6；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为5mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为66μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为6nmol/L。
对于添加有氯化钠的溶液A，作为一种优选，所述溶液A中氯化钠的浓度为30-200mmol/L，最有选浓度为150mmol/L。采用上述优选的氯化钠浓度，更有利于增强荧光恢复强度。
如图1所示，本发明实施例还提供了一种胆固醇含量检测方法，使用上述胆固醇含量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
S1血清样品预处理：向待测血清样品中加入氢氧化钾乙醇溶液以水解血清样品中的胆固醇酯；加入正己烷水溶液进行提取，并对提取液进行分离，得到血清样品提取物；用Triton X-100异丙醇溶液溶解血清样品提取物，得到预处理后的血清样品。
S2配制胆固醇标准溶液和加标血清样品：用溶液A配制系列浓度的胆固醇标准溶液；用溶液A将预处理后的血清样品稀释500倍，取稀释后的血清样品分别加入到系列浓度的胆固醇标准溶液中，得到系列加标血清样品。
S3配制检测剂：将氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合，二者反应后得到检测剂。
S4采用标准加入法测量胆固醇含量：将系列浓度的胆固醇标准溶液以及系列加标血清样品，分别与胆固醇氧化酶溶液混合，置于黑暗条件下温育，向各混合液中分别加入检测剂，得到系列空白标准检测样品和系列加标检测样品；对系列空白标准检测样品和系列加标检测样品分别进行荧光强度检测，分别绘制得到空白标准曲线和加标标准曲线；根据空白标准曲线和加标标准曲线，采用曲线延长法计算获得待测血清样品中胆固醇含量。本步骤中，需要说明的是，标准加入法为含量检测领域常用的一种检测方法，本领域技术人员熟知如何根据空白标准曲线和加标标准曲线，采用曲线延长法计算获得待测血清样品中胆固醇含量，因而对于具体计算步骤在此不做赘述。
上述胆固醇含量检测方法中，利用氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液和Triton X-100异丙醇溶液相配合对待测血清样品进行预处理，实现了对待测血清样品中胆固醇的充分提取，进而采用标准加入法，以氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合后得到的荧光淬灭的混合液作为检测剂，利用胆固醇氧化酶溶液分别对系列浓度的胆固醇标准溶液以及系列加标血清样品中的胆固醇进行氧化反应，利用反应液对检测剂的荧光进行恢复，通过检测恢复后的荧光强度测定胆固醇含量，相比于现有酶法，该胆固醇含量检测方法的检测灵敏度高，特异性强，线性范围宽。
在一优选实施例中，血清样品预处理步骤中，待测血清样品、氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X-100异丙醇溶液的体积比为1:9:30:1；水解胆固醇酯时，在37℃下振荡进行，水解时间为1h；对提取液进行分离的具体步骤为：在5000rpm下对提取液离心处理5min，离心后取上清液，将上清液置于氮气气流下蒸干溶剂。本优选实施例提供了血清样品预处理步骤中各操作步骤的优选条件参数，采用上述优选条件参数，能够保证对待测血清样品中胆固醇的充分提取。
在一优选实施例中，配制系列加标血清样品时，稀释后的血清样品与胆固醇标准溶液的体积比为2:3。本优选实施例提供了系列加标血清样品中血清样品与胆固醇标准溶液的优选体积比，有利于保证采用标准加入法测量时获得的测量结果准确。
在一优选实施例中，配制检测剂时，所述氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液的体积比为3:2，反应时间为30min。本优选实施例提供了配制检测剂时，氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液的优选体积比和优选反应时间，有利于保证荧光标记DNA探针的大部分荧光信号被淬灭。
在一优选实施例中，采用标准加入法测量胆固醇含量步骤中，制备系列空白标准检测样品时加入的胆固醇标准溶液、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25，制备系列加标检测样品时加入的加标血清样品、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25；制备系列空白标准检测样品和系列加标检测样品时，在黑暗条件下温育时间为1h；系列空白标准检测样品和系列加标检测样品在进行荧光强度检测前，需室温静置1h；进行荧光强度检测的具体步骤为：在485nm激发波长下收集502-700nm的荧光光谱。本优选实施例提供了采用标准加入法测量胆固醇含量步骤中各操作步骤的优选条件参数，采用上述优选条件参数，能够提高检测灵敏度以及测量结果的准确性。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的胆固醇含量检测试剂盒及检测方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
一种胆固醇含量检测试剂盒，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X-100异丙醇溶液、由Hepes缓冲液和氯化钠组成的溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为8.9mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷与水的体积比为2:1；所述Triton X-100异丙醇溶液中Triton X-100与异丙醇的体积比为2:3；所述溶液A中缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为7.6，所述溶液A中氯化钠的浓度为150mmol/L；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为5mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为66μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为6nmol/L，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示。
采用上述胆固醇含量检测试剂盒对4种待测血清样品的胆固醇含量进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)血清样品预处理：取0.2mL待测血清样品，加入1.8mL氢氧化钾乙醇溶液，在37℃下振荡水解1h；然后加入6mL正己烷水溶液进行提取，在5000rpm下对提取液离心处理5min，离心后取2mL上清液置于氮气气流下蒸干溶剂，得到血清样品提取物；用0.2mL的Triton X-100异丙醇溶液溶解血清样品提取物，得到预处理后的血清样品；
(2)配制胆固醇标准溶液和加标血清样品：用溶液A配制浓度分别为2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L和10μmol/L的胆固醇标准溶液；用溶液A将预处理后的血清样品稀释500倍，取4μL稀释后的血清样品分别加入到6μL上述各浓度的胆固醇标准溶液中，得到系列加标血清样品；
(3)配制检测剂：将氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液按照体积比为3:2混合，二者反应30min后得到检测剂；
(4)采用标准加入法测量胆固醇含量：取10μL上述各浓度的胆固醇标准溶液，分别与10μL胆固醇氧化酶溶液混合，置于黑暗条件下温育1h，向各混合液中分别加入250μL检测剂，得到系列空白标准检测样品，室温静置1h后，分别在485nm激发波长下收集502-700nm的荧光光谱，绘制得到空白标准曲线；取10μL上述系列加标血清样品，分别与10μL胆固醇氧化酶溶液混合，置于黑暗条件下温育1h，向各混合液中分别加入250μL检测剂，得到系列加标检测样品，室温静置1h后，分别在485nm激发波长下收集502-700nm的荧光光谱，绘制得到加标标准曲线；根据空白标准曲线和加标标准曲线，采用曲线延长法计算获得待测血清样品中胆固醇含量，检测结果如表1所示。
表1实施例1对4种待测血清样品的检测结果
样品编号 胆固醇标准含量(μmol/L) 胆固醇检测含量(μmol/L) 回收率(％)
1 4.40 4.35 98.86
2 6.90 6.85 99.28
3 11.50 11.32 98.43
4 12.30 12.46 101.30
实施例2
本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒与实施例1的区别在于：溶液A为醋酸缓冲液。
采用本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒对上述4种待测血清样品的胆固醇含量进行检测的方法与实施例1相同，检测结果如表2所示。
表2实施例2对4种待测血清样品的检测结果
样品编号 胆固醇标准含量(μmol/L) 胆固醇检测含量(μmol/L) 回收率(％)
1 4.40 3.71 84.32
2 6.90 5.84 84.64
3 11.50 9.65 83.91
4 12.30 10.47 85.12
实施例3
本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒与实施例1的区别在于：溶液仅包括Hepes缓冲液，未添加氯化钠。
采用本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒对上述4种待测血清样品的胆固醇含量进行检测的方法与实施例1相同，检测结果如表2所示。
样品编号 胆固醇标准含量(μmol/L) 胆固醇检测含量(μmol/L) 回收率(％)
1 4.40 4.21 95.68
2 6.90 6.47 93.77
3 11.50 11.01 95.74
4 12.30 11.85 96.34
实施例4
本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒与实施例1的区别在于：所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为7mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为60％；所述TritonX-100异丙醇溶液中Triton X-100的体积百分比为30％；所述溶液A中缓冲液的浓度为5mmol/L，pH为7，所述溶液A中氯化钠的浓度为30mmol/L；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为2mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为16μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为5nmol/L。
采用本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒对上述4种待测血清样品的胆固醇含量进行检测的方法与实施例1相同，检测结果如表3所示。
表3实施例3对4种待测血清样品的检测结果
样品编号 胆固醇标准含量(μmol/L) 胆固醇检测含量(μmol/L) 回收率(％)
1 4.40 3.39 77.05
2 6.90 5.34 77.39
3 11.50 9.05 78.70
4 12.30 9.77 79.43
实施例5
本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒与实施例1的区别在于：所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为8mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为65％；所述TritonX-100异丙醇溶液中Triton X-100的体积百分比为35％；所述溶液A中缓冲液的浓度为7mmol/L，pH为7.5，所述溶液A中氯化钠的浓度为90mmol/L；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为4mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为33μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为5.5nmol/L。
样品编号 胆固醇标准含量(μmol/L) 胆固醇检测含量(μmol/L) 回收率(％)
1 4.40 4.16 94.55
2 6.90 6.47 93.77
3 11.50 10.83 94.17
4 12.30 11.79 95.85
实施例6
本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒与实施例1的区别在于：所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为9.5mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为68％；所述TritonX-100异丙醇溶液中Triton X-100的体积百分比为45％；所述溶液A中缓冲液的浓度为15mmol/L，pH为7.8，所述溶液A中氯化钠的浓度为180mmol/L；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为8mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为116 mol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为8nmol/L。
样品编号 胆固醇标准含量(μmol/L) 胆固醇检测含量(μmol/L) 回收率(％)
1 4.40 4.02 91.36
2 6.90 6.23 90.29
3 11.50 10.57 91.91
4 12.30 11.32 92.03
实施例7
本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒与实施例1的区别在于：所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为10mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为70％；所述TritonX-100异丙醇溶液中Triton X-100的体积百分比为50％；所述溶液A中缓冲液的浓度为20mmol/L，pH为8，所述溶液A中氯化钠的浓度为200mmol/L；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为10mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为166μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为10nmol/L。
采用本实施例提供的胆固醇含量检测试剂盒对上述4种待测血清样品的胆固醇含量进行检测的方法与实施例1相同，检测结果如表4所示。
表4实施例4对4种待测血清样品的检测结果
样品编号 胆固醇标准含量(μmol/L) 胆固醇检测含量(μmol/L) 回收率(％)
1 4.40 3.48 79.09
2 6.90 5.45 78.99
3 11.50 9.18 79.83
4 12.30 9.85 80.08
为了进一步充分说明本发明中多个条件参数对检测结果的显著影响，下面提供如下单因素条件考察实验数据。由于本发明中对胆固醇的检测是通过检测胆固醇氧化生成的过氧化氢含量而实现的，因而，下面实验中采用过氧化氢溶液代替待测血清样品。
氧化镨溶液浓度影响实验
以荧光标记DNA探针的原始荧光信号强度为对比，将不同浓度(16μmol/L、33μmol/L、66μmol/L、166μmol/L)的氧化镨溶液与6nmol/L的荧光标记DNA探针溶液按照体积比为3:2混合反应30min后，检测荧光淬灭结果如图2所示。其中，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示。
由图2可见，氧化镨溶液浓度越高，对荧光标记DNA探针荧光信号的淬灭作用越强，当氧化镨溶液浓度达到166μmol/L时，荧光淬灭效率高于95％，当继续增加氧化镨溶液浓度时，由于氧化镨颗粒之间会聚集发生沉降，严重影响检测灵敏度。
氧化镨与荧光标记DNA探针反应时间影响实验
采用66μmol/L的氧化镨溶液与6nmol/L的荧光标记DNA探针溶液按照体积比为3:2混合，检测荧光强度随时间的变化情况，检测结果如图3所示。其中，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示。
由图3可见，随着氧化镨与荧光标记DNA探针反应时间逐渐延长荧光强度逐渐下降，当反应5min后荧光强度已基本达到稳定，反应30min可保证二者反应充分且荧光强度稳定。
缓冲液种类影响实验
检测氧化镨与荧光标记DNA探针在不同缓冲液(Hepes缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液和醋酸缓冲液)中的荧光淬灭情况，结果如图4所示。其中，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示；所述氧化镨溶液浓度为66μmol/L，荧光标记DNA探针溶液浓度为6nmol/L，二者按照体积比为3:2混合，应时间为30min。
由图4可见，氧化镨与荧光标记DNA探针在Hepes缓冲液和醋酸缓冲液中，大部分荧光都能够被淬灭，而在柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液中，仅有少量荧光被淬灭。
缓冲液pH值影响实验
将66μmol/L的氧化镨溶液与6nmol/L的荧光标记DNA探针溶液按照体积比为3:2混合后加入到不同pH(pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝7.6、pH＝8)的缓冲液中，并分别加入等量过氧化氢溶液以恢复荧光信号，检测恢复的荧光强度，结果如图5所示。其中，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示；所述缓冲液为Hepes缓冲液。
由图5可见，当缓冲液pH＝7～8时，荧光信号恢复较明显，pH＝7.6时具有最优的恢复效果。
溶液A中氯化钠浓度影响实验
采用Hepes缓冲液配制具有不同氯化钠浓度(0mmol/L、30mmol/L、60mmol/L、90mmol/L、150mmol/L、200mmol/L)的溶液A，将66μmol/L的氧化镨溶液与6nmol/L的荧光标记DNA探针溶液按照体积比为3:2混合后分别加入到上述不同溶液A中，并分别加入等量过氧化氢溶液以恢复荧光信号，检测恢复的荧光强度，结果如图6所示。其中，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示。
由图6可见，添加有氯化钠的溶液A能够显著增强荧光信号强度，而且，随着氯化钠浓度的增高，恢复的荧光信号强度逐渐增强，当氯化钠浓度达到150mmol/L，恢复的荧光信号强度基本不再增加。
荧光标记DNA探针种类影响实验
配制不同种类(5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，简记为A5，腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示；5’端用FAM标记的胸腺嘧啶五聚体，简记为T5，胸腺嘧啶五聚体的序列如SEQ ID No.2所示；5’端用FAM标记的胞嘧啶五聚体，简记为C5，胞嘧啶五聚体的序列如SEQ ID No.3所示；5’端用FAM标记的鸟嘌呤五聚体，简记为G5，鸟嘌呤五聚体的序列如SEQID No.4所示；5’端用FAM标记的腺嘌呤十五聚体，简记为A15，腺嘌呤十五聚体的序列如SEQID No.5所示；5’端用FAM标记的腺嘌呤三十聚体，简记为A30，腺嘌呤三十聚体的序列如SEQID No.6所示；5’端用FAM标记的腺嘌呤四十五聚体，简记为A45，腺嘌呤四十五聚体的序列如SEQ ID No.7所示)的荧光标记DNA探针溶液，分别与氧化镨溶液混合反应，检测荧光淬灭情况，分别添加等量过氧化氢溶液以恢复荧光信号，检测恢复的荧光强度，结果如图7所示。其中，氧化镨溶液浓度为66μmol/L，荧光标记DNA探针溶液浓度为6nmol/L，二者按照体积比为3:2混合，应时间为30min。
由图7可见，相比于其他几种荧光标记DNA探针，FAM标记的腺嘌呤五聚体具有最优的荧光恢复效果，且荧光信号较强。
干扰实验
采用66μmol/L的氧化镨溶液与6nmol/L的荧光标记DNA探针溶液按照体积比为3:2混合反应30min，分别添加10μmol/L过氧化氢溶液、20μmol/L半胱氨酸、20μmol/L赖氨酸、20μmol/L组氨酸、20μmol/L丝氨酸、20μmol/L谷氨酸、20μmol/L葡萄糖、20μmol/L多巴胺后，分别检测恢复的荧光强度，结果如图8所示。其中，所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为6nmol/L，所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列如SEQ ID No.1所示。
由图8可见，半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酸、葡萄糖、多巴胺对荧光信号恢复影响极小。
序列表
<110> 中国石油大学（华东）
<120> 一种胆固醇含量检测试剂盒及检测方法
<160> 7
<210> 1
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaaa
<210> 2
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttttt
<210> 3
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccccc
<210> 4
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggggg
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaaaaaaaa aaaaa
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa

Claims (10)

1.一种胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X-100异丙醇溶液、溶液A、胆固醇氧化酶溶液、氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液；其中，所述溶液A包含缓冲液。
2.根据权利要求1所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述溶液A还包括氯化钠。
3.根据权利要求1或2所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述荧光标记DNA探针为5’端用FAM标记的腺嘌呤五聚体，所述腺嘌呤五聚体的序列为5’-AAAAA-3’。
4.根据权利要求1或2所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为Hepes缓冲液或醋酸缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述氢氧化钾乙醇溶液的浓度为7-10mmol/L；所述正己烷水溶液中正己烷的体积百分比为60％-70％；所述Triton X-100异丙醇溶液中Triton X-100的体积百分比为30％-50％；所述溶液A中缓冲液的浓度为5-20mmol/L，pH为7-8；所述胆固醇氧化酶溶液的浓度为2-10mg/mL；所述氧化镨溶液的浓度为16-166μmol/L；所述荧光标记DNA探针溶液的浓度为5-10nmol/L。
6.根据权利要求5所述的胆固醇含量检测试剂盒，其特征在于：所述溶液A中氯化钠的浓度为30-200mmol/L。
7.一种胆固醇含量检测方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项所述的胆固醇含量检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
血清样品预处理：向待测血清样品中加入氢氧化钾乙醇溶液以水解血清样品中的胆固醇酯；加入正己烷水溶液进行提取，并对提取液进行分离，得到血清样品提取物；用TritonX-100异丙醇溶液溶解血清样品提取物，得到预处理后的血清样品；
配制胆固醇标准溶液和加标血清样品：用溶液A配制系列浓度的胆固醇标准溶液；用溶液A将预处理后的血清样品稀释500倍，取稀释后的血清样品分别加入到系列浓度的胆固醇标准溶液中，得到系列加标血清样品；
配制检测剂：将氧化镨溶液与荧光标记DNA探针溶液混合，二者反应后得到检测剂；
采用标准加入法测量胆固醇含量：将系列浓度的胆固醇标准溶液以及系列加标血清样品，分别与胆固醇氧化酶溶液混合，置于黑暗条件下温育，向各混合液中分别加入检测剂，得到系列空白标准检测样品和系列加标检测样品；对系列空白标准检测样品和系列加标检测样品分别进行荧光强度检测，分别绘制得到空白标准曲线和加标标准曲线；根据空白标准曲线和加标标准曲线，采用曲线延长法计算获得待测血清样品中胆固醇含量。
8.根据权利要求7所述的胆固醇含量检测方法，其特征在于：血清样品预处理步骤中，待测血清样品、氢氧化钾乙醇溶液、正己烷水溶液、Triton X-100异丙醇溶液的体积比为1:9:30:1；水解胆固醇酯时，在37℃下振荡进行，水解时间为1h；对提取液进行分离的具体步骤为：在5000rpm下对提取液离心处理5min，离心后取上清液，将上清液置于氮气气流下蒸干溶剂。
9.根据权利要求7所述的胆固醇含量检测方法，其特征在于：配制系列加标血清样品时，稀释后的血清样品与胆固醇标准溶液的体积比为2:3；配制检测剂时，所述氧化镨溶液和荧光标记DNA探针溶液的体积比为3:2，反应时间为30min。
10.根据权利要求7所述的胆固醇含量检测方法，其特征在于：采用标准加入法测量胆固醇含量步骤中，制备系列空白标准检测样品时加入的胆固醇标准溶液、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25，制备系列加标检测样品时加入的加标血清样品、胆固醇氧化酶溶液和检测剂的体积比为1:1:25；制备系列空白标准检测样品和系列加标检测样品时，在黑暗条件下温育时间为1h；系列空白标准检测样品和系列加标检测样品在进行荧光强度检测前，需室温静置1h；进行荧光强度检测的具体步骤为：在485nm激发波长下收集502-700nm的荧光光谱。
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