CN110054587A - 一种具有AIE特征的pH荧光化合物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有AIE特征的荧光探针化合物(I)及其制备与应用。所述荧光探针AIE特征检测原理为：化合物(I)在溶液中几乎不发光，而在聚集状态或固体薄膜下发光大大增强。本发明提供了一种新的具有聚集诱导发射(AIE)特征检测细胞pH值的荧光探针化合物，为研究细胞中pH的生理作用，提供了一种有效的研究工具。

Description

一种具有AIE特征的pH荧光化合物及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种具有AIE特征的pH荧光化合物及其制备与应用。
(二)背景技术
体内pH的平衡对于人体执行多种关键功能如酶催化，细胞内吞作用和肌肉收缩至关重要。对于各种细胞，亚细胞器和细胞间基质以及体液内的pH，分布范围从碱性到高酸性不等。体内pH平衡的破坏与许多健康问题有关，包括癌症、消化性溃疡、阿尔茨海默氏病、溶酶体贮积症和代谢性疾病。因此，精确测量体内的pH值，尤其是细胞内pH值，对于理解各种pH依赖性生理和病理过程都具有重要意义。
具有AIE特征的化合物具有聚集态下高效发光的特点，从根本上克服了聚集导致荧光猝灭的难题，引起了广泛的研究兴趣。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种新型的具有AIE特征的荧光探针化合物，可以对细胞内的pH值进行的定性分析和定量检测。
本发明采用的技术方案是：
一种具有AIE特征的pH荧光化合物，结构如式(I)所示：
本发明还涉及制备所述pH荧光化合物的方法，所述方法包括：以式(II)所示的2-甲基-6甲氧基喹啉化合物和式(III)的硫醚苯甲醛为底物，在无水二乙酸铁和三氟乙酸存在下，100～120℃反应10～18h，制得式(I)所示pH荧光化合物；反应结束后，利用减压旋转蒸发仪抽干甲苯，所得反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:8的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3～0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到所述pH荧光化合物。
具体的，所述反应在甲苯溶液中进行。
优选的，所述2-甲基-6甲氧基喹啉化合物、硫醚苯甲醛、无水二乙酸铁和三氟乙酸物质的量之比为1:1:0.05:0.05。
本发明还涉及所述pH荧光化合物在制备pH荧光探针中的应用。所述荧光探针AIE特征检测原理(参见图1)为：化合物(HAPH)在与pH进行反应后，喹啉N作为pH敏感基团，得到一个质子，形成NH+基团，荧光发生变化，测定在激发为360nm时，发射波长460nm和580处荧光的荧光强度变化。。
进一步，检测所述荧光探针AIE特征的具体方法为:化合物(I)分别加入到DCM，THF，MeOH，Acetone和超纯水中，测定在激发为360nm时发射波长460nm处探针的荧光强度；化合物(I)加入到不同比例的THF/H2O溶液中，测定在激发为360nm时发射波长460nm处探针的荧光强度变化；通过LLS测量HAPH在DMSO/H2O中的流体动力学直径(v/v＝1:99)，从而说明所述探针具有AIE特征。
具体的，所述pH荧光探针用于pH的荧光定量检测。
进一步，所述pH荧光探针用于测定细胞内溶酶体的pH值，pH值范围通常在3.5～1.25之间。
优选的，所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的具有聚集诱导发射(AIE)特征检测细胞pH值的荧光探针化合物，为研究细胞中pH的生理作用，提供了一种有效的研究工具。
(四)附图说明
图1为本发明中式(I)化合物检测pH浓度的原理图。
图2为本发明中实施例1制备的化合物(I)的核磁氢谱。图3为本发明中实施例1制备的化合物(I)，a)在手持式紫外灯的365nm紫外线照射下拍摄的不同溶剂的照片，b)以及加入到不同溶剂中的荧光发射光谱图；c)具有不同水分数(fw)的THF/水混合物的荧光发射光谱。激发波长360nm，发射波长470nm。
图4为本发明中实施例1制备的化合物(I)，通过LLS测量HAPH在DMSO/H 2O中的流体动力学直径(v/v＝1:99)。
图5为本发明中实施例1制备的化合物(I)，进行标准pH滴定的吸收光谱和荧光发射光谱。(a)化合物(I)用标准pH滴定，在紫外-可见吸收下的光谱图。(b)在各种pH值下HAPH(5μM)在水中的荧光发射光谱。Ex＝370nm，Em＝400nm～700nm。(c)化合物(I)在pH值为1.00-7.00范围内，580nm处的荧光强度的函数。Ex＝410nm，Em＝450-720nm。(d)化合物(I)在pH值为1.00-7.00范围内，在580nm处的荧光强度图。Ex＝410nm，Em＝450-720nm。插图：pH值在1.25-3.5的范围内的函数。
图6为本发明中实施例1制备的化合物(HAPH)的细胞成像图，(a)孵育并用pH 7.4、4.5、3.7和3.5的PBS进一步处理的HeLa细胞的双光共聚焦荧光显微镜图像；(b)不同pH下的平均荧光强度；(c)Forang/Fblue的比例图像。(λex＝405nm。比例尺：20μm)。
图7为不同溶剂中化合物(VI)的荧光发射光谱。
图8为不同pH值下化合物(VI)的荧光发射光谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：化合物(I)的制备
1.0mmol 2-甲基-6甲氧基喹啉化合物，对1.0mmol硫醚苯甲醛溶于10ml的甲苯溶液中，向其中加入0.05mmol的无水二乙酸铁，0.05mmol的三氟乙酸，100摄氏度加热12小时。利用减压旋转蒸发仪抽干甲苯，所得反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:8的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到化合物(I)，其核磁氢谱参见图2。
实施例2：不同溶剂在紫外下的吸收
用手持式紫外灯的365nm紫外线照射下拍摄的不同溶剂的照片，结果见图3A。
实施例3：化合物(I)(5μM)在不同溶剂中的荧光发射光谱图，激发波长为360nm，发射波长为460nm
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到1000μL不同溶剂如DCM，THF，MeOH，Acetone和超纯水中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光发射光谱。
实验结果表明，在以360nm波长激发时，在超纯水中时，化合物(I)在460nm处的荧光强度最强；当在DCM，THF，MeOH，Acetone中时，化合物(I)在460nm处的荧光强度较弱。说明探针具有AIE特征，荧光图谱见图3B。
实施例4：化合物(I)(5μM)在具有不同水分数(fw)的THF/水混合物的发射光谱。激发波长为360nm，发射波长为460nm
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到1000μL不同水分数(fw)的THF/水混合物中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光发射光谱。
实验结果表明，在以360nm波长激发时，化合物(I)在460nm处的荧光强度随着THF/水混合物的水分数(fw)的增加而增大，荧光图谱见图3C。
实施例5：化合物(I)在DMSO/H2O中的流体动力学直径。
化合物(I)在水中的溶解性差，在具有高水分数的溶液中形成聚集体。通过LLS测量化合物(I)在DMSO/H2O中的流体动力学直径(v/v＝1:99)。
结果见图4，实验结果表明，化合物(I)的有效直径为103±1nm，没有收集LLS信号，表明其溶解状态良好。这极大地限制了分子内运动并激活了AIE过程。
实施例6：化合物(I)在标准pH滴定下的紫外-可见吸收光谱。
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到不同pH的水溶液中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光发射光谱。
吸收光谱见图5a，实验结果表明，当pH从7.0降低到1.0时，340nm处的吸光度降低，同时，410nm处的新峰出现并且显着增加。吸收光谱中的红移证实了由于H+结合诱导的喹啉吸电子能力的增强，探针的分子内电荷转移(ICT)效应随着pH的降低而增强。
实施例7：化合物(I)(5μM)在不同pH下的荧光发射光谱图。激发波长为370nm，发射波长为400～700nm
准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到两组不同pH梯度(一组为pH在1～7的10个梯度，另一组为pH在1～4的10个梯度)的水溶液中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(I)的荧光发射光谱。
实验结果表明，如图5b所示，当pH值高于4.0时，溶液显示出以580nm(λex＝410nm)为中心的强发射带，具有120nm的大斯托克斯位移(图5c)。大斯托克斯位移有助于减少发射干扰。同时，发射比例也表现出良好的线性，pH值在3.0～1.25范围内(图5d)，线性系数为0.9831。根据发射比例的分析，计算出pKa为3.21。
实施例8：化合物(I)在监测活细胞pH波动中的应用
HeLa细胞在pH为7.4、4.5、3.7、3.5的环境中，37℃下用化合物(I)(2μM)染色30分钟。
实验结果表明，在pH为7.4时，HeLa细胞几乎仅在蓝色发射通道(420-490nm)处有荧光强度，而在黄色发射通道(540～620nm)没有信号(图6a，b)。当pH变为4.5时，绿色通道的荧光强度随着黄色通道强度的减弱而立即明显增强。在pH为3.5时，HeLa细胞几乎仅在黄色发射通道(540～620nm)处有荧光强度，而在蓝色发射通道(420～490nm)没有信号(图6a，b)。荧光强度比(Forange/Fblue)随着pH的减小显示出明显的增加(图6c)，由此可以表明细胞中的pH变化。结果表明化合物(I)可用于细胞成像和比率检测细胞内pH波动，尤其是细胞质。
对照实施列1：
按照权利要求所述合成方法合成下列化合物：
准确称取一定量实施例1制备的化合物(VI)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到1000μL不同溶剂如DCM，THF，MeOH，Acetone和超纯水中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(VI)的荧光发射光谱，见图7。
实验结果表明，在以360nm波长激发时，在超纯水中时，化合物(VI)在460nm处的荧光强度较弱；当在DCM，THF，MeOH，Acetone等有机溶剂中时，化合物(VI)在540nm处的荧光强度较强。证明该化合物无AIE性质。
对照实施例2：
准确称取一定量对照实施例1制备的化合物(VI)，用二甲基亚砜配制成浓度为0.1mM的探针母液，用移液枪吸取5μL加入到不同pH的水溶液中，摇晃均匀后，加入到96孔板中，然后测定化合物(VI)的荧光发射光谱，参见图8。
实验结果表明，当pH从7.0降低到1.0时，荧光没有显著变化，说明喹啉结构是探针的必要结构。

Claims (8)

1.一种具有AIE特征的pH荧光化合物，结构如式(I)所示：
2.制备权利要求1所述pH荧光化合物的方法，所述方法包括：以式(II)所示的2-甲基-6甲氧基喹啉化合物和式(III)的硫醚苯甲醛为底物，在无水二乙酸铁和三氟乙酸存在下，100～120℃反应10～18h，制得式(I)所示pH荧光化合物；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述反应在甲苯溶液中进行。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述2-甲基-6甲氧基喹啉化合物、硫醚苯甲醛、无水二乙酸铁和三氟乙酸物质的量之比为1:1:0.05:0.05。
5.权利要求1所述pH荧光化合物在制备pH荧光探针中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述pH荧光探针用于pH的荧光定量检测。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述pH荧光探针用于测定细胞内溶酶体的pH值。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
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