CN110050699A - 一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法 - Google Patents

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Abstract

一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，分别利用固体培养和液体培养的各自优点，采用前期固体培养和后期浅层液体培养相结合的培养模式，其中，固体培养基配方为MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；液体培养基配方为MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L；并优化培养基配方组成以降低山药组培苗继代增殖过程中的有害物质等措施，显著提高山药组培苗继代增殖系数、缩短继代周期，减少继代次数，降低生产成本且更易实现山药组培苗生产的精简化和规模化水平，是一种加快山药组培苗繁育速度的有效方法。

Description

一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是指一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法。
背景技术
山药属薯蓣科薯蓣属具双子叶植物特征的单子叶缠绕蔓性藤本植物，近年来随着山药产业链的不断完善以及深加工产品的不断丰富，山药产业化种植面积不断扩大，产业前景良好。
山药种质退化问题是影响山药产业可持续发展的核心问题，利用植物组织培养的方法进行山药种苗脱毒复壮并进行规模化扩繁应用，是解决目前山药种质退化问题的最有效方法。目前山药组织培养研究报道较多，但大多还处于小规模研究阶段，真正规模化应用到生产实际的少有报道。究其原因主要还是山药组培繁殖系数较低，未能达到生产上快繁的目的，组培苗生产成本较高，无法在短期内向市场提供大量低成本的优质组培苗（薯）。如何降低组培苗生产成本、提高繁殖系数，加快组培苗繁育速度成为制约山药组培苗大规模生产应用的瓶颈。
发明内容
本发明提供一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其主要目的在于克服山药组培繁殖系数较低，未能达到生产上快繁的目的的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，包括以下步骤：
1)母瓶的准备：对山药外植体进行剪切，并取带芽节段8～10株接种于固体培养瓶中培养40～45天，其间进行无菌性检测；所述固体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的固体培养基；所述固体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
2)将步骤1中固体培养瓶内制得的组培苗在无菌条件下切割成复数个小丛块；
3)取复数个液体培养瓶，所述液体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的液体培养基；在每个液体培养瓶中接种10～12个所述小丛块进行浅层液体培养，培养周期为28～32天；所述液体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L；
4)将所述液体培养瓶内制得的组培苗再次在无菌条件下切割成复数个小丛块，并再次以每个液体培养瓶接种10～12个小丛块的数量均匀分配到复数个液体培养瓶中进行浅层液体培养，每个液体培养瓶内均具有所述液体培养基，培养周期为28～32天；
5)反复进行步骤4以持续8～10轮的浅层液体培养，并且最后一轮浅层液体培养的培养周期为43～47天。
进一步的，所述MS包括以下成分:硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mgL、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铜0.025mg/L、硼酸6.2mg/L、钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.83mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.2mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B6 0.5 mg/L、维生素B10.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L。
进一步的，所述液体培养基的配方还包括PVP 100mg/L。
进一步的，每个所述小丛块保留2～3株小苗。
进一步的，所述固体培养瓶采用240ml的玻璃瓶。
进一步的，所述液体培养瓶采用650ml的丝口玻璃瓶。
进一步的，所述固体培养基在进行步骤1之前，所述液体培养基在进行步骤3、4、5之前，均需在121℃下灭菌20min，并在灭菌完后放入冷却室备用。
进一步的，步骤3、4、5中，液体培养瓶所处的培养室温度为24±1℃，继代后前一个星期光照强度为5001x以下，光照周期12～16h或利用周围培养架的散射光；一个星期后光照强度调整为30001x。
进一步的，步骤3、4、5中，每轮浅层液体培养的过程中，每隔半个月震摇所述液体培养瓶一次。
其中，BA为6-苄基腺嘌呤；AD为腺嘌呤；IBA为吲哚丁酸。
固体培养基和液体培养基中的MS包括以下成分: 硝酸铵(NH4NO3)1650mg/L、硝酸钾(KNO3) 1900mg/L、氯化钙( Cacl2·2H20)440mg/L、硫酸镁(MgS04·4H2O)370mgL、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、硫酸锰(MnS04·H2O)22.3mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 8.6mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L、硫酸铜(CuS04·5H20)0.025mg/L、硼酸(H3B03)6.2mg/L、钼酸钠(Na2Moc04·2H20)0.25mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、硫酸亚铁(FeSO4·7H20)27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)37.2mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B6 0.5 mg/L、维生素B1 0.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L。
和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:
1、本发明的山药组织培养中分别利用固体培养和液体培养的各自优点，采用前期固体培养和后期浅层液体培养相结合的培养模式，并优化培养基配方组成以降低山药组培苗继代增殖过程中的有害物质等措施，显著提高山药组培苗继代增殖系数、缩短继代周期，减少继代次数，降低生产成本且更易实现山药组培苗生产的精简化和规模化水平，是一种加快山药组培苗繁育速度的有效方法。
2、本发明中，最后一轮浅层液体培养的培养周期从30天延长至45天左右，可促进山药组培苗长高，起到壮苗培养的作用，减少壮苗培养环节直接进入后期的生根培养。
3、本发明通过在液体培养基中添加PVP100mg/L，有助于降低组培苗的褐化程度。
4、在本发明中，液体培养瓶采用650ml的丝口玻璃瓶，增加了容量，减少操作人员工作量，空间更大，组培苗生长更好；并且采用该丝口玻璃瓶可以在不影响植物正常生长的情况下能把污染控制在5～8％之内。
5、在本发明中，设置该培养室的培养条件，可以降低山药组培材料褐化对其生长的影响，促进山药继代组培苗快速增殖，提高增殖系数。
附图说明
图1为实施例二中“安砂小叶薯”转接到液体培养基中初期的生长情况。
图2为实施例二中“安砂小叶薯”转接到液体培养基中后期的生长情况。
具体实施方式
下面参照附图说明本发明的具体实施方式。
一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，包括以下步骤：
步骤一
母瓶的准备：对山药外植体进行剪切，并取带芽节段8～10株接种于固体培养瓶中培养40～45天，其间进行无菌性检测；该固体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的固体培养基；固体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；这一步骤中，固体培养瓶采用240ml的玻璃瓶，培养过程中应定期进行无菌性检测以保证母瓶无菌及种苗的可靠性，至于无菌性检测的频率可以根据需要进行调整；具体操作剪切时，应尽量减少切口；此外，接种之前，配制好的固体培养基应先在121℃的条件下进行高温高压湿热灭菌20min,灭菌完毕再放入冷却室冷却备用。母瓶的量以当年生产规模确定，储备好足够的母瓶材料；比如当年生产100万株山药组培苗计算，需500～1000瓶基础母瓶材料。
步骤二
将步骤1中固体培养瓶内制得的组培苗在无菌条件下切割成复数个小丛块；具体操作时，小丛块不宜切割成太小，应使每个小丛块保留2～3株小苗，并且切割时尽量减少伤口以缩短转接后缓苗期。
步骤三
取复数个液体培养瓶，液体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的液体培养基；在每个液体培养瓶中接种10～12个小丛块进行浅层液体培养，培养周期为28～32天；液体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L；本步骤中，接种时将小丛块直接平放在液体培养基中即可，利用植物自然向光性组培苗生长后会自己直立起来；此外，接种之前，配制好的液体培养基应先在121℃的条件下进行高温高压湿热灭菌20min,灭菌完毕再放入冷却室冷却备用。
另外，还可在液体培养基中添加PVP 100mg/L，其有助于降低组培苗的褐化程度；液体培养瓶采用650ml的丝口玻璃瓶，其增加了容量，减少操作人员工作量，空间更大，组培苗生长更好，并且采用该丝口玻璃瓶可以在不影响植物正常生长的情况下能把污染控制在5～8％之内；可在每个液体培养瓶中添加20～30mL液体培养基，由于接种密度为每瓶10～12个小丛块，即每丛营养液量为2～2.5mL。
步骤四
将液体培养瓶内制得的组培苗再次在无菌条件下切割成复数个小丛块，并再次以每个液体培养瓶接种10～12个小丛块的数量均匀分配到复数个液体培养瓶中进行浅层液体培养，每个液体培养瓶内均具有液体培养基，培养周期为28～32天；
步骤五
反复进行步骤4以持续8～10轮的浅层液体培养，并且最后一轮浅层液体培养的培养周期为43～47天。最后一轮浅层液体培养的培养周期从30天延长至45天左右，可促进山药组培苗长高，起到壮苗培养的作用，减少壮苗培养环节直接进入后期的生根培养。由于经过了8～10轮的浅层液体培养，因此山药组培苗的数量获得了指数级生长，如上所述，仅需500～1000瓶基础母瓶材料，便能生产100万株山药组培苗。
另外，步骤三、四、五中，液体培养瓶所处的培养室温度为24±1℃，继代后前一个星期光照强度为5001x以下，光照周期12～16h或不开培养架的灯而利用周围培养架的散射光即可，一个星期后光照强度调整为30001x；并且每轮浅层液体培养的过程中，每隔半个月震摇液体培养瓶一次。通过降低温度、弱光照以及震摇的方式可以降低山药组培材料褐化对其生长的影响，促进山药继代组培苗快速增殖，提高增殖系数。
由于若仅采用液体培养基，难以进行无菌性检测，因此需要固体培养基的配合；若仅采用固体培养基，则会出现营养不均衡、毒性不发分散等问题；本发明的山药组织培养中分别利用固体培养和液体培养的各自优点，采用前期固体培养和后期浅层液体培养相结合的培养模式，并优化培养基配方组成以降低山药组培苗继代增殖过程中的有害物质等措施，显著提高山药组培苗继代增殖系数（增殖系数由原来的2倍左右提高到3～4倍）、缩短继代周期(山药组培苗増殖培养中,传统的山药组培苗増殖培养需要40～45d,采用本发明的方法只需30d左右,缩短了10～15d)，减少继代次数，规模化生产时组培苗成本可降低20%以上，组培苗健壮，整齐，且更易实现山药组培苗生产的精简化和规模化水平，是一种加快山药组培苗繁育速度的有效方法。
实施例一
一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，包括以下步骤：
1)母瓶的准备：以“褐苞薯蓣”类型清流雪薯为材料，对该清流雪薯外植体进行剪切，并取带芽节段8～10株接种于固体培养瓶中培养40～45天，其间进行无菌性检测；所述固体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的固体培养基；所述固体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L +AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
2)将步骤1中固体培养瓶内制得的组培苗在无菌条件下切割成复数个小丛块；
3)取复数个液体培养瓶，所述液体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的液体培养基；在每个液体培养瓶中接种10～12个所述小丛块进行浅层液体培养，培养周期为28～32天；所述液体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L；
4)将所述液体培养瓶内制得的组培苗再次在无菌条件下切割成复数个小丛块，并再次以每个液体培养瓶接种10～12个小丛块的数量均匀分配到复数个液体培养瓶中进行浅层液体培养，每个液体培养瓶内均具有所述液体培养基，培养周期为28～32天；
5)反复进行步骤4以持续8～10轮的浅层液体培养，并且最后一轮浅层液体培养的培养周期为43～47天。
实施例二
参照图1、图2。一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，包括以下步骤：
1)母瓶的准备：以“褐苞薯蓣”类型安砂小叶薯为材料，对该安砂小叶薯外植体进行剪切，并取带芽节段8～10株接种于固体培养瓶中培养40～45天，其间进行无菌性检测；所述固体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的固体培养基；所述固体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
2)将步骤1中固体培养瓶内制得的组培苗在无菌条件下切割成复数个小丛块；
3)取复数个液体培养瓶，所述液体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的液体培养基；在每个液体培养瓶中接种10～12个所述小丛块进行浅层液体培养，培养周期为28～32天；所述液体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L；
4)将所述液体培养瓶内制得的组培苗再次在无菌条件下切割成复数个小丛块，并再次以每个液体培养瓶接种10～12个小丛块的数量均匀分配到复数个液体培养瓶中进行浅层液体培养，每个液体培养瓶内均具有所述液体培养基，培养周期为28～32天；
5)反复进行步骤4以持续8～10轮的浅层液体培养，并且最后一轮浅层液体培养的培养周期为43～47天。
实施例三
1)母瓶的准备：以“褐苞薯蓣”类型明溪淮山药为材料，对该明溪淮山药外植体进行剪切，并取带芽节段8～10株接种于固体培养瓶中培养40～45天，其间进行无菌性检测；所述固体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的固体培养基；所述固体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
2)将步骤1中固体培养瓶内制得的组培苗在无菌条件下切割成复数个小丛块；
3)取复数个液体培养瓶，所述液体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的液体培养基；在每个液体培养瓶中接种10～12个所述小丛块进行浅层液体培养，培养周期为28～32天；所述液体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L + 蔗糖30g/L；
4)将所述液体培养瓶内制得的组培苗再次在无菌条件下切割成复数个小丛块，并再次以每个液体培养瓶接种10～12个小丛块的数量均匀分配到复数个液体培养瓶中进行浅层液体培养，每个液体培养瓶内均具有所述液体培养基，培养周期为28～32天；
5)反复进行步骤4以持续8～10轮的浅层液体培养，并且最后一轮浅层液体培养的培养周期为43～47天。
上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (9)

1.一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于,包括以下步骤：
1) 母瓶的准备：对山药外植体进行剪切，并取带芽节段8～10株接种于固体培养瓶中培养40～45天，其间进行无菌性检测；所述固体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的固体培养基；
所述固体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L +蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L；
2) 将步骤1中固体培养瓶内制得的组培苗在无菌条件下切割成复数个小丛块；
3) 取复数个液体培养瓶，所述液体培养瓶中具有pH值为5.8～6.2的液体培养基；在每个液体培养瓶中接种10～12个所述小丛块进行浅层液体培养，培养周期为28～32天；
所述液体培养基配方：MS+BA 0.5～1.0mg/L + AD 5～10mg/L +IBA 0.3～0.5mg/L +蔗糖30g/L；
4) 将所述液体培养瓶内制得的组培苗再次在无菌条件下切割成复数个小丛块，并再次以每个液体培养瓶接种10～12个小丛块的数量均匀分配到复数个液体培养瓶中进行浅层液体培养，每个液体培养瓶内均具有所述液体培养基，培养周期为28～32天；
5) 反复进行步骤4以持续8～10轮的浅层液体培养，并且最后一轮浅层液体培养的培养周期为43～47天。
2.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：所述MS包括以下成分:硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mgL、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铜0.025mg/L、硼酸6.2mg/L、钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.83mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.2mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素B6 0.5 mg/L、维生素B1 0.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L。
3.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：所述液体培养基的配方还包括PVP 100mg/L。
4.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：每个所述小丛块保留2～3株小苗。
5.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：所述固体培养瓶采用240ml的玻璃瓶。
6.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：所述液体培养瓶采用650ml的丝口玻璃瓶。
7.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：所述固体培养基在进行步骤1之前，所述液体培养基在进行步骤3、4、5之前，均需在121℃下灭菌20min，并在灭菌完后放入冷却室备用。
8.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：步骤3、4、5中，液体培养瓶所处的培养室温度为24±1℃，继代后前一个星期光照强度为5001x以下，光照周期12～16h或利用周围培养架的散射光；一个星期后光照强度调整为30001x。
9.如权利要求1所述一种规模化快速扩繁山药组培苗的生产方法，其特征在于：步骤3、4、5中，每轮浅层液体培养的过程中，每隔半个月震摇所述液体培养瓶一次。
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