CN110041187B - 新芳香聚酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结构新颖的芳香聚酮类化合物及其制备方法和用途，该类化合物是通过链霉菌（Streptomyces sp.）N12W1565发酵制备的，所述链霉菌的保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCC No.15050。本发明所制备的芳香聚酮类化合物能够用于制备预防或治疗PTP所介导疾病的药物。

Description

新芳香聚酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体地说涉及一类新的芳香聚酮类化合物及其制备方法和用途，以及该类化合物的产生菌。

背景技术

蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein-tyrosine phosphatase，PTP)在细胞信号传导中具有重要的作用，它们通过调节细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化水平来控制细胞的生长、分化、代谢；细胞迁移、基因转录、离子通道开闭、免疫反应、细胞凋亡以及成骨发育也受到调控。蛋白质酪氨酸磷酸酶的紊乱可导致多种疾病，如癌症、糖尿病、肥胖症和骨质疏松症（Desai, et al., 1996, Cell, 84: 599-609; Kishihara et al., 1993, Cell,74:143-156; Hardy S, et al., Anticaner Agents Med Chem 2011,Jun 27.）。

蛋白质酪氨酸磷酸酶是一个大家族，按其在细胞内所处的位置可分为跨膜受体型和胞内非受体型。目前的研究结果证明其中PTP1B、SHP2与胰岛素信号通路关系最为密切。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(Protein tyrosine Phosphatase 1B，PTP1B)是在体内广泛表达的胞内蛋白质酪氨酸磷酸酶，由PTPN1基因编码（Brown-Shimer S., et al., Proc Nat AcadSci,1990, 87: 5148-5152）。

胰岛素（Insulin）通过与胰岛素受体（Insulin receptor，IR）的α亚基结合，激活受体胞内β亚基内在的酪氨酸激酶活性，从而导致酪氨酸参加自身的磷酸化。而被激活的胰岛素受体酪氨酸激酶再通过磷酸化胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate，IRS），从而将胰岛素信号传递下去。胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号通路的阻断或减弱。研究发现PTP1B通过对胰岛素受体激酶（insulin receptor kinase，IRK)或IRK活性片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号传导进行负调节。PTPlB通过无催化活性的C-末端结构域与内质网相连，与其他PTPase相比，有更高的去IRβ和IRS磷酸化活性，从而抑制IRS 和PI3K的P85亚基复合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰岛素诱导的糖原合成被抑制，因此，PTPlB可在胰岛素信号级联中的多个位点发挥负调控作用。过度表达PTPlB能增加胰岛素受体脱磷酸化、下调受体后信号；相反，抑制受体-PTPlB结合、PTPlB的定点突变以及给与抑制性抗体的实验方法均可增强胰岛素信号 [Elchebly M.,et al.,Science 1999, 283: 1544-1548]。

更重要的研究证明，PTP1B基因敲除小鼠的基础代谢水平和总体能量消耗升高，体重减轻，胰岛素敏感性增强[Klaman L.D., et al. Molecular and Cellular Biology,20(15), 5479-5489]。Tonks等[Tonks N.K., et al.，Mol Cell Biol,1990,10:458-463]的实验表明，给爪蟾卵显微注射PTPlB阻断了胰岛素的作用。最近的基因敲除小鼠模型的研究已充分证明了PTPlB是胰岛素作用的特异性调控子，PTPlB可影响体重和能量消耗的调节。Elchebly等报道，PTPlB基因敲除鼠在表型上是健康的，同时有较低的空腹血胰岛素和血糖水平、在胰岛素耐量实验中血糖明显下降等胰岛素敏感性增加的表现，且这种增敏效应具有组织特异性，它可增加骨骼肌对葡萄糖的摄取，但对脂肪组织无明显影响。更加令人振奋的是，敲除鼠在高脂饮食喂养时不会出现肥胖或体重增加，也不发生IR的加重[Elchebly M., et al., Science 1999, 283: 1544-1548]。这一研究结果提出了一个可能性：抑制PTPlB能有效的解决代谢综合征的两个主要问题，糖耐量减低和肥胖，PTPlB是研究开发抗糖尿病药物的一个重要的新靶点。

另外，最新的研究结果表明，PTP1B可以通过对p62DOK的脱磷酸化激活Ras-ERK、Src 激酶 和 Ras/Erk 途径的癌症的发生和发展途径，从而在癌症，特别在乳腺癌、肺癌和结肠癌等癌症的发生、发展中起重要作用（Dube N, et al., Proc Natl Acad Sci, 2004,101: 1834-1839; Bentires-Alj M, et al., Cancer Res, 2007, 67: 2420-2424; ZhuS., et al., Cancer Res, 2007, 67: 10129-10137）。

越来越多的证据表明：PTP1B在调节胰岛素敏感性、能量代谢以及癌症的发生发展过程中均起着重要作用，是新的抗肿瘤、糖尿病、肥胖等药物研究的靶点[Darry A.J.,Future Med Chem, 2010, 2(10): 1563-1576]。因此寻找对蛋白质酪氨酸磷酸酶PTP1B具有良好的抑制作用的新化合物就尤显其重要性。

近年从链霉菌培养分离得到一类新芳香聚酮类化合物：Naphthacemycins 类化合物。这类化合物包含7-苯基稠四苯的结构。2017年Atsushi Fukumoto等报道了从链霉菌KB-3346-5分离得到17个新化合物naphthacemycins A1–A11, B1–B4 and C1–C2，它们与亚胺培南具有协同抗MRSA作用。（“Naphthacemycins, novel circumventors of β-lactamresistance in MRSA, produced by Streptomyces sp. KB-3346-5. II. Structureelucidation”，The Journal of Antibiotics，2017，70：568–573）。

但迄今并无抑制PTP1B的Naphthacemycins类化合物相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有蛋白质酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制作用的新的芳香聚酮类化合物，以及该类化合物的制备方法和医药用途，并提供了产生此类化合物的菌株。

为实现本发明目的，本发明提供了新的芳香聚酮类化合物，其结构如下：

其中R为：H、Cl、Br中的一种或多种。

本发明所提供的菌株N12W1565，保藏单位为是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年12月12日，保藏编号为CGMCC No.15050。

本发明所提供的N12W1565菌株分离自药用植物千里光（Senecio scandensBuch.-Ham. ex D. Don）样品，采集自云南（北纬23°9'50.0688"，东经104°49'28.2576"，海拔1670.3682m），样品采集后保存于4℃，并尽快分离。

千里光样品经自来水多次冲洗除去表面泥土后，在无菌条件下依次采用如下程序进行表面消毒：0.01% Tween-20处理1 min，有效氯含量为4.5 %-5 %的次氯酸钠处理3min，无菌2.5%硫代硫酸钠处理10 min，75 %乙醇处理5 min，无菌水清洗3次，无菌10 %碳酸氢钠浸泡10 min。表面消毒后的千里光样品经无菌滤纸充分吸干水分，在无菌条件下粉碎后撒在添加放线菌酮和制霉菌素各50μg/mL的酵母酪素琼脂（YECD）分离培养基（CoombsJT, Franco CMM. Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat roots[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69: 5603-5608）上，于28℃培养3-6周，放线菌菌落长出后，挑取至高氏一号培养基（阮继生, 刘志恒, 梁丽糯,等. 放线菌研究及应用[M]. 北京: 科学出版社, 1990: 2-18）培养及纯化，纯菌株培养于ISP2斜面培养基。菌株N12W1565在ISP2斜面培养基上28 ℃培养14 d左右，用20%甘油保存菌体于-80 ℃。

本发明所提供的N12W1565菌株在ISP2培养基上产生发育良好、不易断裂的分枝状基内菌丝，气丝较稀少（附图1）；菌落黄色，圆形，表面呈皱褶状（附图2）。其16S rDNA序列如序列表。根据其形态和16S rDNA序列比对，菌株属于链霉菌属（ Streptomyces sp.）。

本发明提供了上述新芳香聚酮类化合物的制备方法，该方法是采用上述链霉菌（ Streptomyces sp.）N12W1565发酵制备所述新芳香聚酮类化合物。具体地说，包括以下步骤：

a、制备N12W1565的种子液

将菌株N12W1565的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，27-32 ℃、转速180-220 rpm培养48-72 h获得种子液。

其中所说的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-40.0克、葡萄糖0.5-5.0克，蛋白胨1.0-10.0克、牛肉膏1.0-10.0克、酵母浸粉1.0-10.0克，加水定容至1000 mL；pH值7.0-7.5，121 ℃灭菌30 min。

b、制备N12W1565的发酵液

将上述种子液以体积百分比1-15%的接种量接种于含发酵培养基摇瓶或发酵罐中发酵，发酵温度26-30 ℃、发酵时间96-240 h。

其中所说的发酵培养基按以下方法制得：可溶性淀粉20.0-60.0克、玉米麸质粉10.0-30.0克、葡萄糖1.0-10.0克、脱脂豆粉1.0-10.0克、FeSO₄·7H₂O 0.1-1.0克、K₂HPO₄0.1-1.0克、KCl 0-2.0克、KBr 0-2.0克、CaCO₃ 1.0-10.0克，加水定容至1000 mL，pH值7.0-7.5，121 ℃灭菌30 min。

c、将上述发酵液离心，除去上清液，菌丝体中加入有机溶剂浸泡搅拌，过滤，滤液浓缩得到粗浸膏。

d、上述粗浸膏中加入极性有机溶剂，超声搅拌清洗2-4次，清洗液合并过滤后浓缩至深褐色粗品。

e、将上述粗品溶解，通过HPLC制备色谱柱制备，乙腈-水梯度洗脱，UV检测器检测，依次收集洗脱的色谱峰，相同部分合并，分别浓干得到如权利要求1所述的化合物。

其中步骤c中有机溶剂的加入量优选用菌丝体2倍以上体积，浸泡2-4小时。

其中步骤c、d中的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种。

其中步骤d中粗浸膏中加入5-7倍体积的有机溶剂。

其中步骤e中的深褐色粗品用DMSO溶解，0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC制备，乙腈-水梯度洗脱，水中含有0.05%的三氟乙酸，检测波长设为254和420 nm。依次收集洗脱的色谱峰，相同部分合并分别减压蒸干得1565A、1565B、1565C、1565D、1565E、1565F、1565G、1565H、1565I、1565J。

除上述制备方法外，本发明所述新芳香聚酮类化合物还可以按照常规方法，通过合成、半合成或生物转化的方式获得。

本发明还提供了上述新芳香聚酮类化合物的一种医药用途：将该类化合物用于制备预防或治疗PTP所介导疾病的药物。

本发明所述PTP所介导疾病，具体地说是指癌症、糖尿病或肥胖症。

优选地，本发明所述癌症是乳腺癌、肺癌或结肠癌。

涉及上述医药用途时，根据本领域技术人员的公知常识，不仅是本发明所述新芳香聚酮类化合物本身，其药学上可接受的盐、异构体、酯或前体药物都可以具有与其相同或相近的医药用途。上述药学上可接受的盐包括钠、钾、钙盐，以及胺盐；所述胺包括氨、烷基胺、苯胺和氨基酸；所述氨基酸包括精氨酸、赖氨酸。上述药学上可接受的盐还可以形成溶剂化物，并具有与之相同或相近的医药用途；所述溶剂化物包括水合物、醇合物。上述前药在体内代谢变化后能够释放出本发明所述芳香聚酮类化合物。

本发明所述新芳香聚酮类化合物的医药用途，具体来说是通过以下方法实现的：

按照常规方法制备药物组合物，其包含上述新芳香聚酮类化合物和可药用载体。其中，所述新芳香聚酮类化合物的质量百分含量为0.1-99%，优选5-75%。该药物组合物按照给药途径不同，可分为口服制剂、舌下或颊给药制剂、吸入制剂、注射剂、直肠给药制剂、经皮给药制剂等。其中，优选口服制剂。

当制备口服制剂时，单位剂型中所述新芳香聚酮类化合物的含量为1-500mg，优选1-250mg。可选择的剂型包括片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬液等。其中，优选片剂、胶囊剂。可药用载体包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸钠、滑石粉、硬脂酸镁、微粉硅胶、脂肪油、液体石蜡、液体聚乙二醇等。

当制备舌下或颊给药制剂时，可以采取片剂或糖锭剂的形式，按照常规方法配制。

当制备吸入制剂时，可以采取加压气雾剂的形式。适合的推进剂包括二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳。可药用载体包括乳糖、淀粉。

当制备注射剂时，单位剂型中所述新芳香聚酮类化合物的含量为0.1-100mg，优选0.1-25mg。可选择的剂型包括油性注射液、水性注射液或冻干粉针剂。可药用载体包括脂肪油、油酸乙酯、甘油三酯、脂质体、羧甲基纤维素钠、葡聚糖、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸钠。

当制备直肠给药制剂时，可以采取栓剂或灌肠剂的形式。可药用载体包括可可脂、甘油酯。

当制备经皮给药制剂时，可以采取贴剂的形式。可药用载体包括聚丙烯酸钠、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。

上述药物组合物在应用时，应达到有效治疗剂量，并根据疾病的性质、患者的年龄、体重进行合理调整。通常，所述新芳香聚酮类化合物的给药剂量为0.01-100mg/kg体重，优选为0.1-10mg/kg体重，更优选的是1-5mg/kg体重。给药剂量和频率最终应由医生决定。

附图说明

图1 菌株N12W1565在ISP2培养基上培养14 d的光学显微镜形态。

图2 菌株N12W1565在ISP2培养基上培养14 d的菌落解剖显微镜形态。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

下列实施例所涉及的部分原材料的规格型号如下：

核磁共振仪：Bruker Avance Ⅲ 500，TMS为内标

高压液相系统（分析）：Waters公司，e2695，2998 检测器

高压液相系统（制备）：Waters公司，600型泵，2487检测器

酶标仪：Perkin Elmer公司 Victor2 1420 Multilabel Counter

分析色谱柱：NanoMicro Unisil 10-120 C18 ODS column (4.6×250 mm, 10μm)

制备色谱柱：NanoMicro Unisil 10-120 C18 ODS column (21.2×250 mm, 10μm)

色谱级甲醇和乙腈购自Honeywell公司，其他试剂均为分析纯，购自天津永大化学试剂公司。

实施例1、菌株N12W1565的分离及初步鉴定

（1）菌株分离

本发明所提供的N12W1565菌株分离自药用植物千里光（Senecio scandensBuch.-Ham. ex D. Don）样品，采集自云南（北纬23°9'50.0688"，东经104°49'28.2576"，海拔1670.3682m），样品采集后保存于4℃，并尽快分离。

千里光样品经自来水多次冲洗除去表面泥土后，在无菌条件下依次采用如下程序进行表面消毒：0.01% Tween-20处理1 min，有效氯含量为4.5 %-5 %的次氯酸钠处理3min，无菌2.5%硫代硫酸钠处理10 min，75 %乙醇处理5 min，无菌水清洗3次，无菌10 %碳酸氢钠浸泡10 min。表面消毒后的千里光样品经无菌滤纸充分吸干水分，在无菌条件下粉碎后撒在添加放线菌酮和制霉菌素各50μg/mL的酵母酪素琼脂（YECD）分离培养基上，于28℃培养4周，放线菌菌落长出后，挑取至高氏一号培养基培养及纯化，纯菌株培养于ISP2斜面培养基。菌株N12W1565在ISP2斜面培养基上28 ℃培养14 d左右，用20%甘油保存菌体于-80℃。

（2）菌株鉴定

（a）形态观察：

将菌株N12W1565埋片培养于ISP2培养基平板上28 ℃培养14 d，在光学显微镜下观察显微形态，菌株产生发育良好、不易断裂的分枝状基内菌丝，气丝较稀少（图1）。

将菌株N12W1565划线培养于ISP2培养基平板上28 ℃培养14 d，观察其菌落形态。其菌落呈现浅黄色，圆形，表面呈皱褶状，在Olympus SZX7解剖显微镜下观察形态照片（图2）。

（b）培养特征：

将菌株N12W1565接种在ISP2-ISP7等不同培养基平板上，于28 ℃培养，分别于7d、14 d、21 d观察其培养特征，菌株的颜色以《链霉菌鉴定手册》（中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 1975）附录的色谱记录。菌株在不同培养基上的培养状态如表1所示。

表1、菌株N12W1565在不同培养基上的生长状态（14 d）

注：+++表示生长很好，++表示生长良好，+表示生长一般。

（c）16S rDNA序列分析：

用Ezup柱式细菌基因组抽提试剂盒（生工SK8256）提取菌株N12W1565的基因组DNA，作为PCR扩增模板。采用《放线菌系统学》（徐丽华, 李文均, 刘志恒, 等. 放线菌系统学——原理、方法及实践[M]. 北京:科学出版社, 2007）的方法进行16S rDNA序列的PCR扩增，引物为27f和1492r通用引物。PCR产物由上海生工进行序列测定。

菌株N12W1565的16S rDNA序列含有1401 bp，测定结果见序列表，经与GenBank进行序列比对，菌株属于链霉菌属（ Streptomyces sp.）。

根据菌株的形态特征、培养状态及其16S rDNA序列分析，将菌株N12W1565鉴定为链霉菌属（ Streptomyces sp.）。

实施例2 新芳香聚酮类化合物的制备

a、制备N12W1565的种子液

将菌株N12W1565的斜面培养物接种于种子培养基，30 ℃、转速220 rpm培养48 h获得种子液。

其中所说的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0克、葡萄糖5.0克，蛋白胨3.0克、牛肉膏1.0克、酵母浸粉6.0克，加水定容至1000 mL；pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。

b、制备N12W1565的发酵液

将上述种子液以体积百分比8 %的接种量接种于含发酵培养基发酵罐中发酵，发酵温度26 ℃、发酵时间240 h。

其中所说的发酵培养基按以下方法制得：可溶性淀粉30.0克、玉米麸质粉30.0克、葡萄糖8.0克、脱脂豆粉10.0克、FeSO4·7H2O 0.1克、K2HPO4 0.6克、KCl 2.0克、CaCO310.0克，加水定容至1000 mL，pH值7.5，121 ℃灭菌30 min。

c、新芳香聚酮类化合物的制备：

放线菌N12WA 1565发酵液10 L，4000 rpm离心15 min，上清液舍弃，菌丝体加入8L甲醇浸泡搅拌2 小时，过滤。重复一次。合并两次滤液，滤液减压蒸干得到粗浸膏65 g。

d、N12WA 1565发酵液提取浸膏65 g加入390 mL甲醇，超声搅拌清洗后过滤，重复一次，合并两次滤液，减压蒸干得到24 g深褐色粗品；

e、将上述粗品用DMSO溶解，0.45μm滤膜过滤后进行HPLC制备。乙腈-水（含0.05%三氟乙酸）梯度洗脱，流速18 mL/min，梯度设置如下：

检测器检测波长设为254和420 nm。依次收集色谱峰，合并相同的色谱峰，分别减压蒸干得到1565A（Rt 18.7 min）、1565B（Rt 20.9 min）、1565C（Rt 21.6 min）、1565D（Rt14.9 min）、1565E（Rt 15.8 min）、1565F（Rt 16.4 min）、1565G（Rt 17.3 min）、1565H（Rt18.0 min）、1565I（Rt 19.1 min）。

实施例3 新芳香聚酮类化合物的制备

a、制备N12W1565的种子液

将菌株N12W1565的孢子液接种于种子培养基，27 ℃、转速200 rpm培养72 h获得种子液。

其中所说的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉40.0克、葡萄糖2.0克，蛋白胨1.0克、牛肉膏6.0克、酵母浸粉10.0克，加水定容至1000 mL；pH值7.5，121 ℃灭菌30 min。

b、制备N12W1565的发酵液

将上述种子液以体积百分比1%的接种量接种于含发酵培养基摇瓶中发酵，发酵温度30 ℃、发酵时间168 h。

其中所说的发酵培养基按以下方法制得：可溶性淀粉60.0克、玉米麸质粉18.0克、葡萄糖1.0克、脱脂豆粉6.0克、FeSO4·7H2O 1.0克、K2HPO4 1.0克、KBr 2.0克、CaCO3 5.0克，加水定容至1000 mL，pH值7.2，121 ℃灭菌30 min。

c、新芳香聚酮类化合物的制备：

放线菌N12WA 1565发酵液4 L，4000 rpm离心15 min，上清液舍弃，菌丝体加入3 L乙醇浸泡搅拌4 小时，过滤。重复一次。合并两次滤液，滤液减压蒸干得到粗浸膏30 g。

d、N12WA 1565发酵液提取浸膏30 g加入210 mL乙醇，超声搅拌清洗后过滤，重复一次，合并两次滤液，减压蒸干得到14 g深褐色粗品；

e、将上述粗品用DMSO溶解，0.45μm滤膜过滤后进行HPLC制备。乙腈-水（含0.05%三氟乙酸）梯度洗脱，流速18 mL/min，梯度设置：

检测器检测波长设为254和420 nm。依次收集色谱峰，合并相同的色谱峰，分别减压蒸干得到1565A、1565B、1565D、1565E、1565F、1565G、1565H、1565J（Rt 18.3 min）。

所得上述各化合物的化学结构、理化性质和核磁数据如下：

N12WA 1565A：淡黄色固体粉末，易溶于氯仿、丙酮、甲醇和二甲基亚砜， ESI-HRMS给出m/z为575.0426（[M+H]+），分子式C₂₈H₂₁Cl₃O₇。

¹H NMR (499 MHz, CDCl₃) δ 14.20 (s, 1H), 13.60 (s, 1H), 7.74 (s, 1H),6.92 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.78(s, 3H), 1.76 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 190.19, 165.71, 160.00, 157.93, 155.91,152.56, 152.08, 151.00, 146.81, 137.80, 136.54, 133.99, 125.35, 119.88,117.99, 113.09, 111.85, 111.17, 108.92, 107.32, 105.69, 105.34, 96.70, 55.97,39.07, 34.47, 34.30, 17.99.

N12WA 1565B：黄色固体粉末，易溶于氯仿、丙酮、甲醇和二甲基亚砜， ESI-HRMS给出m/z为606.9901（[M-H]^-），分子式C₂₈H₂₀Cl₄O₇。

¹H NMR (499 MHz, CDCl₃) δ 14.28 (s, 1H), 14.17 (s, 1H), 7.72 (s, 1H),6.92 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.02(s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 190.26, 165.42, 159.80, 155.92, 154.96,152.77, 151.06, 149.33, 146.42, 137.93, 137.05, 133.99, 125.22, 120.01,117.59, 112.94, 112.06, 111.88, 111.22, 109.26, 107.77, 106.04, 96.72, 55.98,39.90, 30.18, 30.12, 18.02.

N12WA 1565C：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜， ESI-HRMS给出m/z为640.9515（[M-H]^-），分子式C₂₈H₁₉Cl₅O₇。

¹H NMR (499 MHz, DMSO- d ₆) δ 14.37 (s, 1H), 13.95 (s, 1H), 11.38 (s,1H), 10.03 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.39 (s, 3H), 2.03 (s, 3H),2.02 (s, 3H), 1.93 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, DMSO) δ 189.06, 163.57, 159.02, 157.70, 154.49,151.09, 149.13, 148.75, 145.79, 137.10, 135.28, 132.73, 129.77, 120.51,117.67, 115.58, 113.50, 112.97, 112.50, 111.53, 107.86, 107.48, 105.31,59.85, 39.35, 29.56, 29.42, 17.76.

N12WA 1565D：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，ESI-MS给出m/z为473.08（[M+H]⁺），分子式C₂₈H₂₄O₇。

¹H NMR (499 MHz, Acetone- d ₆) δ 14.46 (s, 1H), 12.84 (s, 1H), 7.48 (s,1H), 7.17 (d,  J = 2.5 Hz, 1H), 6.78 (d,  J = 2.2 Hz, 1H), 6.76 (d,  J = 2.4 Hz,1H), 6.39 (s, 1H), 6.29 (d,  J = 2.2 Hz, 1H), 3.57 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.74(s, 3H), 1.73 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Acetone) δ 191.18, 166.91, 166.59, 166.55, 165.86,159.60, 158.51, 157.83, 155.60, 146.06, 142.48, 140.96, 137.34, 125.09,122.03, 117.82, 116.00, 109.88, 108.97, 108.39, 107.27, 106.92, 101.96,97.23, 55.73, 39.47, 34.74, 34.28, 20.59.

N12WA 1565 E（81）：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，ESI-MS给出m/z为506.99（[M+H]⁺），分子式C₂₈H₂₃ClO₇。

¹H NMR (499 MHz, Acetone- d ₆) δ 14.31 (s, 1H), 13.55 (s, 1H), 7.49 (s,1H), 7.18 (d,  J = 2.5 Hz, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.77 (d,  J = 2.4 Hz, 1H), 6.47 –6.30 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.73 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Acetone- d ₆) δ 190.91, 166.74, 161.44, 160.70,159.95, 158.50, 157.88, 152.87, 145.75, 142.70, 142.67, 141.15, 141.11,137.32, 124.98, 122.18, 117.75, 116.23, 116.20, 109.95, 109.00, 108.82,107.15, 106.98, 106.57, 100.91, 97.23, 55.73, 39.36, 34.65, 34.22, 20.58.

N12WA 1565 F（82）：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，ESI-MS给出m/z为507.03（[M+H]⁺），分子式C₂₈H₂₃ClO₇。

¹H NMR (499 MHz, Acetone- d ₆) δ 14.49 (s, 1H), 12.80 (s, 1H), 7.51 (s,1H), 7.21 (d,  J = 2.5 Hz, 1H), 6.78 (d,  J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (d,  J = 2.5 Hz,1H), 6.62 (s, 1H), 6.30 (d,  J = 2.2 Hz, 1H), 3.59 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.74(s, 3H), 1.73 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Acetone- d ₆) δ 191.16, 166.58, 166.55, 166.03,159.64, 156.78, 155.60, 153.15, 146.29, 142.41, 140.04, 135.08, 126.59,122.03, 117.60, 116.03, 112.82, 110.25, 108.33, 107.39, 107.02, 102.07,98.41, 56.00, 39.49, 34.73, 34.27, 18.27.

N12WA 1565 G（9）：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，ESI-MS给出m/z为541.01（[M+H]⁺），分子式C₂₈H₂₂Cl₂O₇。

¹H NMR (499 MHz, Acetone- d ₆) δ 14.32 (s, 1H), 13.52 (s, 1H), 7.52 (s,1H), 7.22 (d,  J = 2.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.79 (d,  J = 2.5 Hz, 1H), 6.63(s, 1H), 3.60 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.74 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Acetone- d ₆) δ 190.95, 166.83, 161.45, 161.01,159.90, 156.76, 153.19, 152.91, 145.88, 142.63, 140.24, 135.06, 126.45,122.17, 117.50, 116.28, 112.84, 110.33, 108.94, 107.28, 106.85, 106.68,98.40, 56.00, 39.36, 34.61, 34.19, 18.27.

N12WA 1565 H（10）：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，ESI-MS给出m/z为540.77（[M+H]⁺），分子式C₂₈H₂₂Cl₂O₇。

¹H NMR (499 MHz, Acetone- d ₆) δ 14.53 (s, 1H), 12.69 (s, 1H), 7.93 (s,1H), 6.95 (s, 1H), 6.82 (d,  J = 2.2 Hz, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.32 (d,  J = 2.2Hz, 1H), 3.59 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.80 (s, 3H), 1.79 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Acetone- d ₆) δ 191.21, 166.74, 166.34, 166.24,156.66, 155.56, 155.02, 153.35, 148.05, 138.46, 138.08, 135.00, 125.95,121.59, 118.46, 113.75, 112.89, 111.82, 108.28, 107.84, 107.26, 102.16,98.42, 56.02, 39.91, 34.94, 34.53, 18.27.

N12WA 1565 I（12）：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，ESI-MS给出m/z为574.95（[M+H]⁺），分子式C₂₈H₂₁Cl₃O₇。

¹H NMR (499 MHz, Acetone- d ₆) δ 14.27 (s, 1H), 14.27 (s, 1H), 7.53 (s,1H), 7.24 (d,  J = 2.5 Hz, 1H), 6.80 (d,  J = 2.4 Hz, 1H), 6.63 (s, 1H), 3.60(s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.02 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Acetone- d ₆) δ 190.91, 166.51, 160.67, 160.19,157.43, 156.75, 153.24, 148.49, 147.51, 143.20, 140.35, 135.05, 126.31,122.36, 117.09, 112.89, 112.87, 110.19, 109.56, 108.70, 106.03, 98.41, 56.00,40.42, 30.10, 30.10, 18.27.

N12WA 1565 J（12-2）：黄色固体粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜，ESI-MS给出m/z为584.81（[M+H]⁺），分子式C₂₈H₂₂BrClO₇。

¹H NMR (499 MHz, Acetone- d ₆) δ 14.52 (s, 1H), 12.69 (s, 1H), 7.98 (s,1H), 6.95 (s, 1H), 6.82 (d,  J = 2.2 Hz, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.32 (d,  J = 2.2Hz, 1H), 3.59 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.80 (s, 3H), 1.79 (s, 3H).

¹³C NMR (126 MHz, Acetone- d ₆) δ 191.16, 166.73, 166.34, 166.13,156.60, 156.40, 155.53, 153.35, 148.14, 139.33, 139.26, 134.93, 125.96,121.36, 118.62, 114.83, 112.89, 108.28, 107.79, 107.26, 105.73, 102.16,98.41, 56.01, 39.88, 34.97, 34.57, 18.27.

实施例4 N12W1565的罐发酵和含新芳香聚酮类化合物粗提取物的制备

a、制备N12W1565的种子液

将菌株N12W1565的孢子液接种于种子培养基32 ℃、转速180 rpm培养60 h获得种子液。

其中所说的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉32.0克、葡萄糖0.5克，蛋白胨10.0克、牛肉膏10.0克、酵母浸粉1.0克，加水定容至1000 mL；pH值7.3，121 ℃灭菌30 min。

b、制备N12W1565的发酵液

将上述种子液以体积百分比15%的接种量接种于含发酵培养基发酵罐中发酵，发酵温度28 ℃、发酵时间96 h。

其中所说的发酵培养基按以下方法制得：可溶性淀粉20.0克、玉米麸质粉10.0克、葡萄糖10.0克、脱脂豆粉1.0克、FeSO4·7H2O 0.6克、K2HPO4 0.1克、KCl 0.4克、KBr 1.0克、CaCO3 1.0克，加水定容至1000 mL，pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。

c、含新芳香聚酮类化合物粗提取物的制备：

放线菌N12WA 1565发酵液25 L，4000 rpm离心15 min，上清液舍弃，菌丝体加入20L丙酮浸泡搅拌3 小时，过滤。重复一次。合并两次滤液，滤液减压蒸干得到粗浸膏136 g。

d、N12WA 1565发酵液提取浸膏136 g加入1000 mL甲醇，超声搅拌清洗后过滤，重复一次，合并两次滤液，减压蒸干得到47 g深褐色粗品。

实施例5 PTP1B的抑制活性测定

PTP1B为利用基因工程方法在大肠杆菌中表达后，经亲和层析纯化获得的活性人重组蛋白质酪氨酸磷酸酶。

抑制活性的测定方法如下：将实施例3制备的新芳香聚酮类化合物稀释后加入到96孔板中，并分别加入每孔100 μl含PTP1B酶的反应缓冲液，室温下孵育15分钟后，加入100μl含5 mM对硝基苯磷酸二钠(pNPP)反应底物的缓冲液。37ºC反应保温30 min，加0.2 MNaOH终止反应，用酶标仪测定405 nm下的光吸收变化。

按以下公式计算抑制率：

抑制率=(1-实验组吸光度平均值/空白对照组吸光度平均值)×100%。

抑制活性的评价标准：

IC50值为抑制率为50%时的新芳香聚酮类化合物浓度（μg/ml）

所述新芳香聚酮类化合物的对PTP1B的抑制活性如表1所示。

表1 新芳香聚酮类化合物的对PTP1B的抑制活性（IC₅₀，μg/ml）

上述结果表明，本发明的新芳香聚酮类化合物具有显著的PTP抑制活性，可用于制备预防或治疗PTP所介导疾病的药物。

序列表

<110>  华北制药集团新药研究开发有限责任公司

<120>  新芳香聚酮类化合物及其制备方法和用途

<130>

<160>  1

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1401

<212>  DNA

<213>  Streptomyces sp.

<400>  1

tcgccagtcc caccttcgac agctccctcc cacaaggggt tgggccaccg gcttcgggtg  60

ttaccgactt tcgtgacgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca  120

gcactgctga tctgcgatta ctagcaactc caacttcatg gggtcgagtt gcagacccca  180

atccgaactg agaccgactt tttgagattc gctccacctt gcggtatcgc agctcattgt  240

atcggccatt gtagcacgtg tgcagcccaa gacataaggg gcatgatgac ttgacgtcgt  300

ccccaccttc ctccgagttg accccggcgg tctcctgtga gtccccatca ccccgaaggg  360

catgctggca acacagaaca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg  420

acacgagctg acgacagcca tgcaccacct gtacaccgac cacaaggggg cgaccatctc  480

tggccgtttc cggtgtatgt caagccttgg taaggttctt cgcgttgcgt cgaattaagc  540

cacatgctcc gctgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc  600

gtactcccca ggcggggaac ttaatgcgtt agctgcggca ccgacgacgt ggaatgtcgc  660

caacacctag ttcccaccgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc  720

cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtaat ggcccagaga tccgccttcg ccaccggtgt  780

tcctcctgat atctgcgcat ttcaccgcta caccaggaat tccgatctcc cctaccacac  840

tctagcctgc ccgtatcgaa tgcagacccg gggttaagcc ccgggctttc acacccgacg  900

tgacaagccg cctacgagct ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gcgccctacg  960

tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttg  1020

cgcttcttcc ctgctgaaag aggtttacaa cccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc  1080

gctgcatcag gctttcgccc attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct  1140

gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccggt cgccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc  1200

cttggtgagc cactacctca ccaacaagct gataggccgc gggctcatcc tgcaccgccg  1260

gagctttcca ccatccagga tgcccaagat ggtcgtatcc ggtattagac cccgtttcca  1320

gggcttgtcc cagagtgcag ggcagattgc ccacgtgtta ctcacccgtt cgccactaat  1380

ccaccccgaa gggcttcatc g                                            1401

                         序列表

<110>  华药新药

<120>  新Naphthacemycin类化合物及其制备方法和用途

<130>  171226

<160>  1

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  1401

<212>  DNA

<213>  Streptomyces sp.

<400>  1

tcgccagtcc caccttcgac agctccctcc cacaaggggt tgggccaccg gcttcgggtg  60

ttaccgactt tcgtgacgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca 120

gcactgctga tctgcgatta ctagcaactc caacttcatg gggtcgagtt gcagacccca 180

atccgaactg agaccgactt tttgagattc gctccacctt gcggtatcgc agctcattgt 240

atcggccatt gtagcacgtg tgcagcccaa gacataaggg gcatgatgac ttgacgtcgt 300

ccccaccttc ctccgagttg accccggcgg tctcctgtga gtccccatca ccccgaaggg 360

catgctggca acacagaaca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg 420

acacgagctg acgacagcca tgcaccacct gtacaccgac cacaaggggg cgaccatctc 480

tggccgtttc cggtgtatgt caagccttgg taaggttctt cgcgttgcgt cgaattaagc 540

cacatgctcc gctgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc 600

gtactcccca ggcggggaac ttaatgcgtt agctgcggca ccgacgacgt ggaatgtcgc 660

caacacctag ttcccaccgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc 720

cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtaat ggcccagaga tccgccttcg ccaccggtgt 780

tcctcctgat atctgcgcat ttcaccgcta caccaggaat tccgatctcc cctaccacac 840

tctagcctgc ccgtatcgaa tgcagacccg gggttaagcc ccgggctttc acacccgacg 900

tgacaagccg cctacgagct ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gcgccctacg 960

tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttg      1020

cgcttcttcc ctgctgaaag aggtttacaa cccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc      1080

gctgcatcag gctttcgccc attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct      1140

gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccggt cgccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc      1200

cttggtgagc cactacctca ccaacaagct gataggccgc gggctcatcc tgcaccgccg      1260

gagctttcca ccatccagga tgcccaagat ggtcgtatcc ggtattagac cccgtttcca      1320

gggcttgtcc cagagtgcag ggcagattgc ccacgtgtta ctcacccgtt cgccactaat      1380

ccaccccgaa gggcttcatc g                                          1401

Claims (9)

1.结构如式(Ⅰ)所示的化合物及其药学上可接受的盐：

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a.制备链霉菌N12W1565的种子液

所述链霉菌N12W1565，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCCNo.15050；

b.制备链霉菌N12W1565的发酵液

c.将上述发酵液离心，除去上清液，菌丝体中加入有机溶剂浸泡，过滤，滤液浓缩得到粗浸膏；

d.在粗浸膏中加入极性有机溶剂，超声搅拌清洗2-4次，清洗液合并过滤后浓缩得到深褐色粗品；

e.将上述粗品溶解，通过HPLC制备色谱柱制备，乙腈-水梯度洗脱，UV检测器检测，依次收集洗脱的色谱峰，相同部分合并，分别浓干得到如权利要求1所述的化合物。

3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

其中步骤c中有机溶剂的加入量优选用菌丝体2倍以上体积，浸泡2-4小时；其中步骤c、d中的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种；

其中步骤d中粗浸膏中加入5-7倍体积的有机溶剂；

其中步骤e中的深褐色粗品用DMSO溶解，0.45μm滤膜过滤后进行HPLC制备，乙腈-水梯度洗脱，水中含有0.05％的三氟乙酸，检测波长设为254和420nm；依次收集洗脱的色谱峰，相同部分合并分别减压蒸干得1565A、1565B、1565C、1565D、1565E、1565F、1565G、1565H、1565I、1565J。

4.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤a具体为：将链霉菌N12W1565的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，27-32℃、转速180-220rpm培养48-72h获得种子液；

所述种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-40.0克、葡萄糖0.5-5.0克，蛋白胨1.0-10.0克、牛肉膏1.0-10.0克、酵母浸粉1.0-10.0克，加水定容至1000mL；pH值7.0-7.5，121℃灭菌30min；

所述步骤b具体为：将上述种子液以体积百分比1-15％的接种量接种于含发酵培养基摇瓶或发酵罐中发酵，发酵温度26-30℃、发酵时间96-240h；

所述发酵培养基按以下方法制得：可溶性淀粉20.0-60.0克、玉米麸质粉10.0-30.0克、葡萄糖1.0-10.0克、脱脂豆粉1.0-10.0克、FeSO₄·7H₂O 0.1-1.0克、K₂HPO₄0.1-1.0克、KCl0-2.0克、KBr 0-2.0克、CaCO₃1.0-10.0克，加水定容至1000mL，pH值7.0-7.5，121℃灭菌30min。

5.权利要求1所述化合物在制备预防或治疗PTP介导的疾病的药物中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述PTP所介导疾病是癌症、糖尿病或肥胖症。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于：所述癌症是乳腺癌、肺癌或结肠癌。

8.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述化合物以及药学上可接受的载体。

9.一株链霉菌株N12W1565，其保藏编号为CGMCC No.15050。

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