CN110038000A - Dat在制备预防或治疗肠炎及相关疾病或症状的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了DAT在制备预防或治疗肠炎及相关疾病或症状的药物中的应用。DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐在制备预防或治疗肠炎及相关疾病或症状的药物或保健品中的应用。一种用于预防或治疗肠炎的药物,以DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐作为主要有效成分。本发明用DAT干预DSS肠炎小鼠,发现DAT干预DSS小鼠体重下降减缓,生存率显著提高,结肠水肿、充血减轻,肠道炎症标志物MCP‑1,Lipocalin2明显降低,小鼠饮水情况不受影响。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,涉及DAT在制备预防或治疗肠炎及相关疾病或症状的药物中的应用。
背景技术
DAT(脱氨基酪氨酸,Desaminotyrosine)是肠道细菌代谢饮食成分的产物。有研究报道只要给予小鼠DAT即能大幅降低流感病毒引发的肺部伤害。目前,尚未有研究对酪氨酸衍生物在肠道炎症性疾病的作用进行探讨。
葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)为一种化学致炎剂。给予小鼠饲喂含有DSS的饮水可以诱导其形成溃疡性结肠炎,其病理改变与人类溃疡性结肠炎相似,是炎症性肠病的经典模型(简称DSS模型)。DSS模型小鼠出现体重显著下降、生存时间缩短、肠道粘膜粒细胞浸润、肠道组织炎症指标MCP-1升高、肠道内容物中性粒细胞源性炎症标志物Lipocalin2升高。
发明内容
本发明的目的是提供DAT的一种新应用。
本发明的另一目的是提供用于预防或治疗肠炎的药物。
本发明的又一目的是提供一种用于改善肠道不适的保健品。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐在制备预防或治疗肠炎及相关疾病或症状的药物或保健品中的应用。
一种用于预防或治疗肠炎的药物,以DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐作为主要有效成分。
所述的药物优选还含有其他有效成分。
所述的药物优选还含有药学上可接受的辅料。
一种用于改善肠道不适的保健品,含有DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐。
有益效果:
本发明用DAT干预DSS肠炎小鼠,发现DAT干预DSS小鼠体重下降减缓,显著提升肠炎小鼠生存率,减轻结肠水肿、充血,明显降低肠道炎症标志物MCP-1、IL-6、Lipocalin2,小鼠饮水情况不受影响。体外实验显示:DAT显著抑制细胞炎症因子的产生。以上结果表明:DAT可以有效减轻肠道炎症,在制备预防或治疗肠炎及相关疾病或症状的药物或保健品方面具有广阔的前景。
附图说明
图1:体内实验评价DAT对肠炎小鼠饮水量、生存率和体重的影响。A:DAT对小鼠饮水量无明显影响;B:DAT显著提高肠炎小鼠生存率;C:DAT缓解肠炎小鼠的体重下降。
图2:小鼠模型评价DAT对炎症相关指标的影响。A:DAT减轻肠炎小鼠肠道充血、水肿;B:DAT减少肠道组织炎症标志物MCP-1的产生;C:DAT减少肠道组织炎症因子IL-6的产生;D:DAT对肠道组织炎症因子TNF-a的影响;E:DAT降低肠道内容物中性粒细胞源性炎症标志物Lipocalin2。
图3:细胞模型评价DAT对炎症相关因子的影响。A:DAT抑制细胞产生炎症标志物MCP-1;B:DAT抑制细胞产生炎症因子IL-6;C:DAT抑制细胞产生炎症因子TNF-a。
具体实施方式
实施例1
药物配制:将DSS(商品化试剂)溶于小鼠的饮用水中,配制成含3%DSS(w/v)的溶液。将DAT(商品化试剂)和DSS同时溶于小鼠的饮用水中,配成含3%DSS(w/v)和100mM DAT的水溶液。
动物模型及实验过程:6-8周龄C57BL/6雄性小鼠适应性喂养一周后,随机分为2组,DSS(3%)饮水组和DSS(3%)+DAT(100mM)饮水组。分组后开始给予小鼠不同配方的饮水自由饮用,持续12天;每天称量小鼠体重,记录饮水量以及小鼠死亡情况。在第八天,分别剖杀两组部分小鼠,观察结肠状态,取肠道组织检测肠道炎症因子;收集盲肠内容物检测Lipocalin2水平。
肠道组织细胞因子检测:
a)将提取的组织放入EP管中,做好标记,并置于冰中。
b)称取组织重量,先后加入裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF。裂解液的量(μl)=组织净重(mg)*4,酶抑制剂的量(μl)=裂解液的量(μl)/100。
c)用超声匀浆器匀浆,至没有明显的絮状物。
d)4℃,12000rpm,离心15min。
e)取上清弃沉淀,使用CBA试剂盒(BDTM Cytometric Bead Array,CBA),按照说明书检测上清中的细胞因子含量。
盲肠内容物Lipocalin2检测:
a)盲肠内容物用0.1%吐温20的1xPBS重悬(100mg/ml),充分震荡混匀。
b)4℃,12000rpm,离心15min。
c)收集上清,使用ELISA试剂盒(Mouse Lipocalin2/NGAL DuoSet ELISA),按照说明书检测上清中的Lipocalin2。
统计学分析:本实验所有数据均使用均数±标准差表示,采用GraphPad Prism5.0统计软件,体重变化比较采用Two-way ANOVA,生存率比较采用Mantel-Cox,其他均为两组间单因素比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果显示:与DSS组相比,DAT干预DSS小鼠饮水情况不受影响(图1A),生存率从0%提高至83%(图1B),体重下降减缓(图1C),结肠水肿、充血情况减轻(图2A),肠道组织炎症指标MCP-1(图2B)和肠道内容物中性粒细胞源性炎症标志物Lipocalin2水平显著降低(图2C)。以上结果表明:DAT可以减轻肠道炎症,可用于制备治疗或预防肠道炎症性疾病及相关症状的药物。
小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的诱导培养:
a)获取骨髓细胞:将C57BL/6小鼠颈椎脱臼法处死,浸泡于75%乙醇中5-10min,无菌剥离胫骨和股骨,并去除表面肌肉组织,用剪刀剪去长骨两侧的骨骺端使骨髓腔暴露,用1ml注射器吸取少量无血清DMEM培养基插入骨髓腔,将骨髓细胞冲入一无菌培养皿中,反复冲洗3-6次直至长骨颜色变白,收集骨髓细胞悬液至一无菌15ml离心管中。
b)裂解红细胞:将含有骨髓细胞悬液的离心管常温1500rpm,5min离心弃上清,用预冷的红细胞裂解液3ml重悬细胞,室温静置4min去除红细胞,后1500rpm,5min离心,弃上清。
c)过滤、洗涤:去除红细胞后加入2-5ml无血清DMEM培养基重悬细胞,用200目尼龙膜过滤细胞,除去骨头碎片和成团絮状物,将收集的细胞悬液1500rpm,5min离心弃上清,最后再加入无血清DMEM培养基,混匀,1500rpm,5min离心弃上清,重复两次洗涤细胞。
d)骨髓细胞的诱导分化:将骨髓细胞以2ⅹ106置于12孔培养板中,选用含有10%胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中,培养基中加入终浓度为20ng/ml的rmM-CSF细胞因子,置于37摄氏度,5%CO2培养箱中培养2天后半量换液(轻轻吹打细胞,连同培养液一起吸去悬浮细胞,保留贴壁细胞,弃去杂细胞,加新的含有20ng/ml的rmM-CSF细胞因子的DMEM完全培养基),继续培养至第4天后半量换液(尽量保留贴壁细胞),培养至第6天再一次半量换液,培养至第七天后收集贴壁细胞即为小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)。
细胞模型评价DAT对炎症因子产生的影响:
a)第7天,将100ng/ml脂多糖LPS加入BMDM培养液中以促其产生炎症因子,同时设立DAT:100uM或1000uM干预组。共设立4组,分别为control组;LPS组;LPS+DAT(100uM)组,LPS+DAT(1000uM)组;观察DAT对BMDM分泌炎症因子的影响。
b)刺激24小时,收集上清,CBA试剂盒(BDTM Cytometric Bead Array,CBA)检测上清中的细胞因子,检测过程按照试剂盒说明书进行。
统计学分析:本实验所有数据均使用均数±标准差表示,采用GraphPad Prism5.0统计软件,体重变化比较采用Two-way ANOVA,生存率比较采用Mantel-Cox,其他均为两组间单因素比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果如图3所示,细胞模型结果显示:DAT显著抑制细胞产生细胞炎症因子MCP-1、IL-6和TNF-a。
Claims (5)
1.DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐在制备预防或治疗肠炎及相关疾病或症状的药物或保健品中的应用。
2.一种用于预防或治疗肠炎的药物,其特征在于以DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐作为主要有效成分。
3.根据权利要求2所述的药物,其特征在于所述的药物还含有其他有效成分。
4.根据权利要求2所述的药物,其特征在于所述的药物还含有药学上可接受的辅料。
5.一种用于改善肠道不适的保健品,其特征在于含有DAT或其药学上可接受的光学异构体或盐。
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WO2018081388A1 (en) * | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Washington University | Compositions comprising desaminotyrosine and uses thereof to enhance type i interferon stimulation |
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