CN1100327A

CN1100327A - 血管活性肠肽其类似物及片段用于治疗神经变性疾病

Info

Publication number: CN1100327A
Application number: CN94104817A
Authority: CN
Inventors: I·戈泽斯; M·弗里金
Original assignee: Ramot University Application Research Industrial Development Co Ltd; Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Ramot University Application Research Industrial Development Co Ltd; Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1993-03-16
Filing date: 1994-03-15
Publication date: 1995-03-22
Anticipated expiration: 2014-03-15
Also published as: IL105061A0; TW290458B; DE69418931T2; KR100305453B1; JPH0769919A; KR940021074A; EP0620008A1; EP0620008B1; CN1140294C; DE69418931D1; IL105061A

Abstract

一种治疗神经变性疾病的医药组合物，该组合物含有一种作为活性成分的选自下列一组中的肽：(I) 血管活性肠肽(VIP)；(II)血管活性肠肽的类似物，其中有一个或多个氨基酸被置换，加入或缺失而基本上没有改变母肽的生物学性质；(III)根据(I)和(II) 的肽偶联到亲脂部分上形成的结合物；(IV)(I)、 (II)、和(III)所述肽的生理学活性片段；以及(V) (I)、(II)、(III)和(IV)中所述的任何一组肽的功能衍生物，且可合并有医药上可接受的载体。

Description

本发明涉及含有活性成分血管活性肠肽（VIP）或其类似物、衍生物及片段的用来治疗神经变性疾病的药物组合物。

神经变性疾病中，因神经细胞变性而引起意识功能的衰退。多种疾病和神经学缺陷可引起神经细胞变性，其中有阿耳茨海默氏病、杭廷顿氏病或舞蹈病、因卒中引起的乏氧或者缺血、因癫癎引起的细胞坏死、肌萎缩性侧索硬化、精神呆滞等，以及因所老导致的神经变性改变。

血管活性肠肽（VIP）是一种表现有神经介质和激素作用的28氨基酸调节肽。VIP在中枢神经系统（CNS）中有不同的分布，其中以大脑皮层、丘脑下部、小脑扁桃体和纹状体含量水平最高。大量的证据表明，VIP参予许多神经功能，其中包括：改变膜电位、调节毒

碱刺激作用、促进电阻滞的神经元的存活（1）、维持神经完整性（2）、改善大鼠的新生期行为（3）、使神经解除由HIV被膜蛋白质引起的死亡危险。经用VIP共处理而弱化的VIP-受体拮抗剂引起了大鼠的空间学习功能损伤，此表明VIP在学习过程中的可能作用（4）。

关于VIP在痴呆特别是阿耳茨海默氏病中的作用存在着相抵触的证据。大量证据提示VIP没有卷入这些病理过程。Rosor等人发现，与对照组相比，得自阿耳茨海默型老年性痴呆病人脑的大脑皮质的VIP没有改变（5）。其他一些研究者则发现阿耳茨海默氏病病人和对照组病人的VIP测定结果没有差异（6、7、8），而且发现痴呆的程度与脑脊髓液中VIP的浓度没有关联（9）。

相反，对阿耳茨海默氏病病人和对照组病人脑中VIP的免疫反应性的研究显示，阿耳茨海默氏病病人大脑皮层特别是脑岛和脑角皮层中VIP免疫反应性明显降低（10）。然而，尚未确定这种降低是大脑皮层中阿耳茨海默氏病性损害的原因还是结果。

根据本发明，已发现VIP和其类似物、衍生物及片段可引起阿耳茨海默氏病动物模型之学习能动性的恢复。

因此，本发明提供了一种治疗神经变性疾病的医药组合物，该组合物含有一种作为活性成分的选自下列一组的肽：

（Ⅰ）血管活性肠肽（VIP）;

（Ⅱ）血管活性肠肽的类似物，其中有一个或多个氨基酸已被置换，加入或缺失而基本上没有改变母肽的生物学性质;

（Ⅲ）根据（Ⅰ）和（Ⅱ）的肽偶联到亲脂部分上形成的结合物;（Ⅳ）（Ⅰ）、（Ⅱ）和（Ⅲ）所述肽的生理学活性片段;以及（Ⅴ）（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）和（Ⅳ）中任何一组肽的功能衍生物;也可以与医药上可接受的载体联合使用

所说的与VIP或式Ⅰ的经修饰的VIP偶联的亲脂部分较好是饱和的或未饱和的残基，如有至少5个碳原子的烃基或羧酰基。亲脂部分可以连接在肽分子的N末端或C末端或两端。

所说VIP的类似物较好有式Ⅰ的顺序：

1 7

His-Ser-Asp-Ala-X¹-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-

16

Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X²-Ala-X³-Lys-Lys-

28

Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn

其中

X¹，X²和X³可以是相同或不同的，且各自是天然或非天然亲脂氨基酸残基。

本发明医药组合物的最优选的活性剂选自具有式Ⅱ的顺序：

1 7

R¹-Y¹-His-Ser-Asp-Ala-X¹-Phe-Thr-Asp-Asn-

16

Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X²-Ala-X³-Lys

28

-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH-Y²-R²

其中R¹和R²可以是相同或不同的，且各自是氢、饱和或未饱和的亲脂基团或C₁-C₄烃基或羧酰基，条件是R¹和R²中至少一个是亲脂基团;

Y¹和Y²可以是相同或不同的，各自是-CH₂-或在相联的R¹或R²是氢的情况下为键，且Y¹还可以是-CO-;

X¹、X²和X³可以是相同或不同的，各自是天然或非天然亲脂氨基酸的残基;

或其生理学活性片段或所说式Ⅱ肽的功能衍生物或其生理学活性片段。

X¹、X²和X³较好是由亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、八氢吲哚-2-羧酸（Oic），环己基-甘氨酸（chg）和环戊基甘氨酸（cpg）所代表的亲脂氨基酸残基。

根据本发明的特别优选的组合物包含上列式Ⅰ和式Ⅱ的肽，式中X²是正亮氨酸残基，X¹和X²各自是缬氨酸，Y¹是-CO-，且R¹是C₅-C₁₇烷基，同时Y¹R¹例如是硬脂酰或己酰，Y²是键且R²是氢。

本文所述的功能性衍生物是其中至少一个非末端氨基酸残基携带侧键功能基因而形成生物学活性物质的化合物。功能性衍生物的例子是糖苷、有羧基和羧基基团的酯、酰胺等。

本文所述的VIP的类似物是其中已借助本领域已知的方法加入、缺失或置换一个或多个氨基酸的肽。落入本发明范围内的VIP类似物是如下文解释的保留天然VIP生物学性质的类似物。

本文所述的本发明的生理学活性片段是VIP的片段、VIP类似物的片段及亲脂部分与VIP或其类似物或片段的结合物。

落入本发明范围内的VIP功能衍生物、生理学活性片段和VIP类似物是在与天然VIP的保护浓度基本相同或较低浓度下具有防止电阻断的神经元免于死亡，或使培养物中未经处理的神经元免于自然死亡之活性，和/或当以这些浓度给动物体内用药时具有提高学习和记忆能力的衍生物、片段和类似物。

例如，VIP或其类似物的片段可以是具有VIP或式Ⅰ的经修饰的VIP或式Ⅱ之结合物的7至28位或16至28位氨基酸的顺序。根据本发明之VIP片段的结合物的例子是：式St-A-V-K-K-Y-L-N-S-I-L-N的St-VIP_18-28（以下称为“肽6”）;式St-A-V-T-T-D-N-Y-T的St-Thr⁶-VIP_4-11（以下称为“肽5”）;式St-H-S-D-A-V-F-T-D-A-V-Y-T-R-L-R的St-VIP_1-14（以下称为“肽3”）;式St-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L的St-Ala²⁴，Ala²⁵，Val²⁶VIP_15-27（以下称为“肽2”）;式St-H-S-D-G-I-F-T-D-S-Y-S-R-Y-R的修饰的VIP片段（以下称为“肽1”）。

用本领域已知的固相合成方法制备本发明组合物中肽化合物的肽链，一旦组成这些肽链即在其上面连接一个除氢以外的末端基团R¹Y¹-和/或R²Y²-。

当Y¹是羰基基团，即为有末端R¹CO-的化合物时，可用常规酰化方法引入R¹CO-基团。

在制备用于本发明组合物中的，其中Y¹是-CH₂-即具有末端R¹-CH₂-的化合物时，可首先与醛R¹CO=0偶联，然后按已知方法还原所得带R¹-CH=N-基团的化合物而引入R¹-CH₂-残基。经裂解带式R²-CH₂-NH₂胺的肽得到带R²-CH₂-的化合物。

本发明医药组合物的最适载体可以是适于经胃肠道外、口服、气雾、鼻内或眼内等途径投用作用于中枢神经系统之药物的任何载体。较好通过能使气雾剂组合物经嗅神经穿透到中枢神经系统的鼻内途径（WO91/07947）或通过眼内途径（Chiou，G.C.Y.,（1991）Ann,Rev.Pharmacol.Toxical,31：457-67），或通过如W.M.Pardridge,Peptide Drug Delivery,Raven Press,NY.,1991中所述的任何其他给药途径投用本发明的组合物。

也可以通过脑室间泵将本发明的医药组合物直接用于脑部。

本发明进一步涉及给需要进行治疗的宿主投用医药上有效量的上文（i）-（v）中限定的肽在制备治疗神经变性疾病的方法。

本发明还涉及上文（i）-（v）中限定的肽在制备治疗神经变性疾病之药物中的应用。

下列实施例举例阐述本发明的各个方面，但不构成对本发明限制。

下文使用的有关术语有下述涵义：

VIP-血管活性肠肽;

St-VIP-硬脂酰VIP;

Nle¹⁷-VIP-正亮氨酸¹⁷-VIP;

St-Nle¹⁷-VIP-硬脂酰正亮氨酸¹⁷-VIP。

下面借助实施例并参照相应附图描述本发明。

图1显示不同浓度的VIP（○）、St-Nle¹⁷-VIP（

）、Nle¹⁷-VIP（■）和St-VIP（●）对电阻断的神经元之存活性的影响;

图2显示不同浓度的肽1对未经处理的神经元之存活性的影响;

图3显示不同浓度的肽2对未经处理的神经元之存活性的影响;

图4显示各不同浓度的肽6对未经处理的神经元之存活性的影响;

图5A-B显示不同浓度的肽5对用VIP拮抗剂处理的神经元（图5A）和未经处理的神经元（图5B）之存活性的影响;

图6显示各不同浓度的St-Nle¹⁷-VIP对用β-淀粉状蛋白肽的片段25-35处理的神经元之存活性影响;

图7A-B显示St-Nle¹⁷-VIP（图7A）和St-VIP（图7B）对VIP受体的亲合力;

图8显示对对照组动物（○）、注射胆碱能阻断剂之动物（□）和注射胆碱能阻断剂与St-Nle¹⁷-VIP之动物（●）进行的学习和记忆研究结果;

图9显示对注射胆碱能阻断剂之动物（□）和注射胆碱能阻断剂并经鼻内给药用St-Nle¹⁷-VIP（●）或用肽6（○）处理之动物进行的学习和记忆研究结果;

图10显示对未经处理的老动物（□）和用St-Nle¹⁷-VIP（■）处理的老动物进行的学习和记忆研究结果。

下列非限制性实施例作为举例进一步阐述本发明。

实施例1：硬脂酰-Nle¹⁷-VIP的合成

在可代用的方法中，按下述步骤合成St-Nle¹⁷-VIP：

按照Merrifield固相方法学的一般原则，在购自Nora，Switzerland的4-（2′，4′-二甲氧基苯基-氨甲基）-苯氧基树脂上在机械振荡器中手工装配肽链。所用的溶剂，即二氯甲烷（CH₂Cl₂）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）和二甲基甲酰胺（DMF）均为Merck，Germany的分析产品。三氟乙酸（TFA）、二异丙基乙胺（DIEA）和N，N′-二环己基碳二亚胺（DCC）购自Aldrich，USA。1-羟基苯并三唑（HOBT）得自Nova，Switzerland。所有被保护的氨基酸衍生物（FMOC-AA）均为L构型的并都得自Bachem，Switzerland。在整个合成中用芴基甲氧羰基（FMOC）基团保护N°-氨基酸功能。如下述保护侧链功能：用叔丁基保护Ser，Asp，Thr;用叔丁氧基保护Lys;用苄氧甲基（BOM）保护His;并用甲氧基三甲基苯磺酰基（Mtr）保护Arg。

按照步骤1和2（见合成程序）从商品聚合物4-（2′，4′-二甲氧基苯基-FMOC-氨乙基）-苯氧基树脂（0.47mmol氨基/g）上除去FMOC-基团开始合成。使用盛在2个反应罐中的10g聚合物，各容器中所用溶剂的体积为20-25ml。使用DCC（0.84g，4mmol）和HOBT（0.55g，4mmol）作为偶联剂将FMOC-Asn（0.92g，4mmol）偶联到树脂（5g）上以准备开始肽链装配。重复偶联步骤。负载物（0.39mmol/g）由氨基酸分析测定。使聚合物与溶在CH₂Cl₂中的乙酸酐（10%）和二异丙基乙胺（5%）反应，以封端保护聚合物上的未经处理的残留氨基。按照表2所列程序从FMOC-Asn-树脂开始肽链装配。

表2：固相肽合成

测量所有洗涤和反应过程所用溶剂，达到10ml/g树脂，但偶联时（步骤10）所用溶剂体积为5ml/g树脂。所有偶联均使用在各偶联步骤之前，用DCC制备的FMOC-氨基酸衍生物的HOBT活性酯来完成。分别使用2∶1摩尔比例的FMOC-氨基酸1-羟基苯并三唑酯（FMOC-AA-OBT）和生长肽链的α氨基基团进行偶联。在溶于吡啶一水中的茚三酮溶液内将几毫克（约3mg）聚合物煮沸2分钟，以监测偶联反应。将偶联FMOC一氨基酸的步骤重复两次或多次以确保反应完成。在第二次偶联以及必要时在继续重复偶联时可使用半量的FMOC-AA-OBT。只是在阴性茚三酮试验（步骤15，见反应程序）后准备开始存在加入第二个氨基酸的继后步骤。通常，均在完成各偶联步骤后，使树脂与溶在二氯甲烷中的乙酸酐（10%）和二异丙基乙胺（5%）反应以封端保护残留的氨基基团。

在完成肽链装配之后，通常使用溶于DMF中的哌啶除去His的FMOC保护基团，并使用DCC（0.84g，4mmol）和HOBT（0.54g，4mmol）作为试剂将新的游离α-氨基偶联（在各反应容器中）到硬脂酸（1.14g，4mmol）上。反应进行120分钟并重复两次。按照程序用CH₂Cl₂洗含充分装配之肽链的树脂，然后在P₂O₅上方于真空下干燥过夜。按下述方法使保护基团去封闭并从树脂上裂解掉肽：将1g干燥的树脂放在100cc加入苯硫基甲烷（2ml）和乙二硫醇（2ml）的烧瓶中。在冰浴上将混合物冷却到4℃并加入20ml三氟乙酸，5分钟后再加入三氟甲磺酸（2ml）。于室温下将混合物搅拌50分钟。

然后将反应混合物冷却到4℃并例入500ml无水乙醚中。4℃搅拌60分钟后，在烧结玻璃漏斗上过滤固形物质（树脂和肽），用无水乙醚洗，干燥后用50%乙酸水溶液（100ml）提取。在高真空中浓缩所得到的含有肽的溶液并将残留物（约15ml）直接加到sephadexG25柱（45×6cm）上。以45ml/小时的流速用0.1N乙酸洗脱柱。于274nm处监测洗脱物。冻干含所需部分的水溶液，得到没有在酸解步骤作为清除剂加入之芳香添加剂的肽。产率约为400mg白色粉末。

如在酸水解后经氨基酸分析所揭示的，该材料具有所需的氨基酸含量和比例。

用高效液相层析法（HPLC）对sephadex分级分离的产物进一步纯化。但也可对粗肽作进一步纯化。纯化在Merck Rp-8柱（7μm，250×25mm柱）上完成。将肽加在35%乙腈水溶液中上柱并用从溶于水溶液中的35%乙腈和0.1%TFA到溶于75%乙腈溶液中的0.1%TFA之间的线性梯度，以10ml/分钟的流速进行洗脱。收集各部分并在经分析性HPLC检测后分割各馏分部分。合并所得部分并冻干。纯肽的产率为30-35%。

实施例2：R₁-CH₂-Nle¹⁷-VIP衍生物的制备

按实施例1中所述方法在聚合物载体甲基二苯甲基胺树脂（MBHA）（Nova，Switzerland）上装配肽链（含有0.39mmolAsn/lgr）。在掺入最后一个氨基酸残基（组氨酸）后，用TFA除去N-α-保护基团（t-Boc），用DIEA处理聚合物、洗涤并进行茚三酮试验。然后将聚合物悬浮在乙醇（1gr/10ml）中，加入相应的醛R₁-CH=O（1当量游离N末端氨基基团加3-4当量醛）并于室温下将混合物轻轻搅拌过夜。过滤聚合物，用乙醇（3×10ml）洗，重新悬浮在乙醇和NaBH₄（3-4当量还原剂对1当量西夫碱;R¹-CH=N-His…）中并在室温下将混合物轻轻搅拌2小时。另外也可使用NaBH₃CN（3-4当量对1当量西夫碱）（在0.1-0.2ml乙酸存在下）。也可在其他有机溶剂如DMF或NMP中进行缩聚和还原反应。在完成还原过程后，过滤聚合物，洗涤并干燥，然后如制备硬脂酰-Nle¹⁷-VIP所述用HF处理之。以实施例1中所述的同样方法纯化粗产物后得到所需终产品。

实施例3：R¹-Y¹-NH-Nle¹⁷-VIP-NH-R²的制备

按下述方法将第一个氨基酸Boc-Asn连接到1%交联的氯化甲基化聚苯乙烯（Chemalog，South Plainfield，NJ，USA）上：在溶于无水乙醇（35ml）中的氨基酸衍生物（5mmol;1.16g）中加入三乙胺（4.75mmol;0.66ml），并将混合物在室温下放置5分钟。然后加入聚合物（5g）并将混合物于78℃温和回流60小时。另外也可将5mmolBoc-Asn溶解在EtoH（12ml）与水（3ml）的混合物中，并用20%Cs₂CO₃水溶液将PH调到7.5。用苯将溶液闪蒸三次并在干燥器内于P₂O₅上方将残留物干燥5小时。然后加入DMF（30ml）溶解该材料，再加入5g聚合物并于50℃将混合物搅拌36小时。经氨基酸分析测定装柱材料（0.4mmol/gr）。

按实施例1中所述方法进行肽链装配。但其中使用Boc-Asn（β-环己酯）代替Boc-Asn（β-苄酯）。环己基基团对氨解作用是稳定的。完成所需肽链的装配后，按上述方法洗涤并干燥聚合物。然后将产物悬浮在无水乙醇或EtoH与DMF的1∶1V/V混合物（1g/10ml）中，加入相应的胺（R″-NH₂;20mmol）并于室温下将混合物轻轻搅拌48小时。使用溶剂系统N-丁醇∶乙酸∶H₂O∶吡啶（15∶3∶12∶10V/V）进行TCL，表明存在从聚合物载体上移除的产物。用乙醇（3×10ml）、DMF（3×10ml）提取聚合物并在高真空中蒸除溶剂，然后用HF处理油状半固体残留物以除去侧链保护基团。以上述制备硬脂酰-Nle¹⁷-VIP的同样方法和相当产率纯化粗产物后得到所需的终产品。

实施例4生物学试验-VIP和VIP类似物对电阻断之细胞存活性的影响

方法

（a）按以前所述方法（15）培养得自12天令胚胎的小鼠脊索神经元。将神经元铺放在添加了10%马血清和10%胎牛血清的eagle氏基本培养基（MEM）中。1天后将培养基换成添加营养素的5%马血清（15）。铺板后9天在一完全改变的培养基中得到培养物。用1μM作为神经元中电活性阻断剂的河豚毒（TTX）处理所有培养物并分成4组。用各种不同浓度的VIP处理第1组，用不同浓度的Nle¹⁷-VIP处理第2组，不同浓度的St-VIP处理第3组，用不同量的St-Nle¹⁷-VIP处理第4组。从第9到14天用VIP和其类似物处理培养物，然后固定以根据神经元特异性烯醇酶（NSE）（该酶为存活神经元的标志物）的存在对神经元进行免疫细胞化学分析。在不知道是否经过处理的双盲试验中计数总面积为50mm²的100个视野内的细胞数。

结果

（b）结果如图1所示。从图中可以看出，本发明医药组合物的所有被试活性剂均可在一定程度上防止电阻断的细胞免于死亡，St-VIP和Nle¹⁷-VIP大约比天然VIP作用强10倍，而St-Nle¹⁷-VIP比天然VIP作用约强100倍。两种带有疏水部分的活性剂（St-VIP和St-Nle¹⁷-VP）还可使活性浓度的峰加宽。

上述结果表明，本发明的活性剂是电阻断之神经元的强有力保护剂，因此可用于降低神经元死亡及继后导致的认识能力衰失。

实施例5：生物学试验：肽1、2和3对神经元之存活性的影响

方法

（a）用稍加改动的Forsythe和Westbrook所述技术（J.physiol.Lond.396∶515（1988）制备大脑皮层培养物，其中用大脑皮层代替海马并用新生大鼠代替E16小鼠。体外生长9天后，得到完全改变培养基的培养物并用系列稀释的肽1、2或6处理培养物以确定这些肽是否可有效地保护神经元使之免于自然死亡。按上述方法计数大脑皮层细胞，每个平板只计数面积为20mm²的40个视野。

结果

（b）如从表2中所看出的，浓度在10^-8M以上的肽1能够防止细胞自然死亡（以10^-12M时的细胞数作为对照）。图3显示肽2在浓度为10^-9M以上时能够防止细胞的自然死亡，图4显示肽6在从10^-11M开始的所有浓度下均能够防止细胞自然死亡。

上述结果表明，本发明的活性剂不仅可阻止细胞因电阻断引起的死亡，而且可防止细胞的自然死亡。

实施例6：生物学试验：肽5对未经处理的神经元和用VIP拮抗剂处理的神经元之存活性的影响

方法

（a）按实施例5所述制备细胞。体外生长9天后，得到完全改变培养基的培养物并在有和没有10^-8M如美国专利US5，217，953详细描述的VIP拮抗剂存在下，用系列稀释的肽5处理该培养物。在试验期第5天开始时进行一次处理。在总面积为50mm²的100个视野上进行细胞计数。在不知道是否作过处理的情况计数神经元。

结果

（a）从图5中可以看出，肽5是一种VIP激动剂，可在有（图5A）和没有（图5B）VIP拮抗剂存在情况下刺激神经元的存活性，表明肽5可保护神经元免于自然死亡。应该注意的是，在有VIP拮抗剂存在时，10^-10M的浓度即得有最大活性;而在没有VIP拮抗剂存在时，在10^-8M的浓度可见有最大活性，此提示VIP拮抗剂使该系统更为敏感并且能使肽5在较低浓度时发挥其保护作用。

实施例7：生物学试验：St-Nle¹⁷-VIP对用β淀粉状蛋白肽的片段25-35处理的神经元之存活性的影响

方法

已知β淀粉状蛋白肽与阿耳茨海默氏病有关，并且是培养的神经元生长的毒性物质（Pike et,J.of Neurosci，13（4），1676-1687（1993））。用25μM含有上述出版物中公开之顺序的位置25-35氨基酸的β淀粉状蛋白肽片段处理按上述方法制备的大鼠大脑皮层神经元。将β淀粉状蛋白肽片段溶解在水中并在10%CO₂环境中37℃预保温48小时。向培养皿中加入不同浓度的St-Nle¹⁷-VIP（10μg/ml培养基）连同β淀粉状蛋白肽片段。先将St-Nle¹⁷-VIP溶解在DMSO中达到10^-3M的浓度，并在盐水中进行进一步的稀释。然后将细胞保温5天，用抗神经元异性烯醇酶的抗体着染并按上述方法计数活的神经元。

结果

单用25μMβ淀粉样蛋白肽的片段25-35即可使活神经元的数目降低到每20mm²42个。如图6中所示，在所有被试浓度的St-Nle¹⁷-VIP均能够使神经元免于遭受β淀粉样蛋白肽片段的毒性作用，St-Nle¹⁷-VIP的最有效保护浓度为10^-13M，而更高浓度则显示出较低的保护效果。

这些结果表明，本发明的活性剂可保护神经之使之免于由参予阿尔茨海默氏病神经变性过程之β淀粉状蛋白肽引起的死亡。

实施例8-生物学试验：亲和性研究

得到大脑皮层星形细胞并按以前所述方法（16，17）培养之。在含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐中4℃铺板后5-7天，对完整细胞进行结合研究。将细胞分成两组。第1组与不同浓度的St-VIP一起保温，第2组与不同浓度的St-Nle¹⁷-VIP一起保温。与VIP类似物保温30分钟后，加入50pM¹²⁵I-VIP^（14）并保温1小时。然后除去培养基并经于4℃下反复加入和除去1ml磷酸盐缓冲盐水而将细胞洗3次。将标记的细胞溶解在0.2NNaOH中并移入自动γ计数器（Wallac 1470 Wizard）中进行放射活性计数。

结果

亲的和性研究结果示于图2（A）和2（B）中。从中可以看出，在低浓度区（高亲和力）St-Nle¹⁷-VIP在其浓度比St-VIP（图2B）浓度小10倍（图2A）时便可表现放射活性VIP，即St-Nle¹⁷-VIP具有比St-VIP高10倍的亲合力。在高浓度区（低亲和力区）St-Nle¹⁷-VIP也具有比St-VIP高10倍的亲和力。St-Nle¹⁷-VIP对高亲和力受体的亲和力约比VIP高100倍^（19）

实施例9：生物学试验：St-Nle¹⁷-VIP对阿尔茨海默氏病动物模型之学习和记忆能力的影响

方法

（a）阿尔茨海默氏病动物模型的制备-I、C、V途径给药使用接有25G针头的塑料导管（PE-20），以0.21μl/分钟的速度经脑室内途径（I、C、V）给13只雄性大鼠注射。5只对照组大鼠接受盐水注射（2μl/侧），另外8只动物接受乙基胆碱吖丙啶鎓（ethylcholine aziridium，AF64A）注射（3nmol/2μl/侧）。AF64A是一种胆碱能功能减退的诱导剂，其模拟某些阿尔茨海默氏病中报导的胆碱能功能减退并用于制备阿尔茨海默动物模型（22）。

注射后给动物插上导管以便进行I、C、V、给药并放置恢复一周。使用游泳迷宫法进行学习和记忆试验。将8只注射AF64A的动物等分为两组，然后每天注射盐水或100ng（I、C、V）St-Nle¹⁷-VIP。5只对照大鼠（见上文）注射盐水。注射7天后，对对照组和试验动物再进行14天的行为检验。

（b）阿尔茨海默动物模型的制备一鼻内给药

按上述方法用AF64A处理8只雄性大鼠。AF64A给药后10天。对5只动物每天鼻内给予溶解于10%sefsol和40%异丙醇的浓度为70μg/40μl的St-Nle¹⁷-VIP（通过每侧鼻孔各给药20μl）。3只动物鼻内给予50μg/40μl溶解于10%sefsol和40%异丙醇中的肽6（每鼻孔20μl）。6只对照组动物每天鼻内给予40μl的10%sefsol和40%异丙醇（每鼻孔20μl）。在鼻内给药前，用二乙醚部分地麻醉动物。对照组和试验组动物均每天注射50，000单位长效抗生素以避免感染。鼻内给药7天后对照组和试验组动物再进行8天的行为试验。

试验程序

将大鼠放在直径1.26m，深0.2m，用干净的聚异丁烯酸树脂柱平衡过，带有正好达到水（22-24℃）表面下方之13.3cm平台的环形水池中。每天试验前4小时注射给药或于试验前1小时经鼻内途径给药。记录每只小鼠达到平台的潜力（以秒计）并作图显示经几天训练后的改变，借以反映其学习和记忆能力。

结果

（a）I、C、V注射的动物

从图8中可以看出，注射胆碱能阻断剂（□）的动物显示达到平台的潜能改善较小，此表明与对照组动物（○）相比学习和记忆能力有显著减小。注射胆碱能阻断剂和St-Nle¹⁷-VIP的动物（●）显示恢复了学习和记忆能力，基本上相似于对照组动物（○）。

上述结果清楚地证明本发明的活性剂在恢复由胆碱能神经元功能减退（相似于阿耳茨海默氏病中见到的病理状态）引起的学习和记忆能力上是有效的。

（b）鼻内给药的动物

如可从图9中看到的，与用胆碱能阻断剂和St-Nle¹⁷-VIP处理的动物（●）或用胆碱能阻断剂和肽6处理的动物（○）相比，对照组动物（□）显示作为降低了学习和记忆能力之指征的达到平台的潜能改善较小。

这些结果清楚地表明，本发明的活性剂当经鼻内途径给药时也是有效的。

实施例10-生物学试验：St-Nle¹⁷-VIP对老动物之学习和记忆能力的影响。

方法

将6只18-20月令的雄性大鼠分成两组。第1组每天经鼻内给药途径接受溶解于10%sefsol和40%异丙醇中的浓度为40μl/天（每鼻孔20μl）的St-Nle¹⁷-VIP。对照组动物每天经鼻内途径接受40μl的10%sefol和40%异丙醇（每鼻孔20μl）。动物在用乙醚部分麻醉后给药。如此将动物处理7-19天。然后如上述将它们放在水池中进行试验。

结果

如可从图10中看出，用St-Nle¹⁷-VIP处理的老动物（■）显示与对照组未经处理的动物（●）相比其达到平台潜能有较大改善，表明提高了学习和记忆能力。这些结果清楚地表明本发明的活性剂不仅在恢复由于阿耳茨海默氏病等病理条件所致的学习和记忆能力减退上是有效的，而且对于恢复因正常生理老化所致的这些能力减退上也是有效的。

参考文献

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Claims

1、治疗神经层变性疾病的医药组合物，该组合物含有一种作为活性成分的选自下列一组中的肽：

(Ⅰ)血管活性肠肽(VIP)；

(Ⅱ)血管活性肠肽的类似物(VIP)，其中有一个或多个氨基酸被置换，加入或缺失而基本上没有改变母肽的生物学性质；

(Ⅲ)根据(Ⅰ)和(Ⅱ)的肽偶联到亲脂部分上形成的结合物；

(Ⅳ)(Ⅰ)、(Ⅱ)、和(Ⅲ)所述肽的生理学活性片段；以及

(Ⅴ)(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中所述的任何一组肽的功能衍生物，

且可合并有医药上可接受的载体。

2、根据权利要求1的医药组合物，其中活性成分是具有式Ⅰ顺序的VIP的类似物。

1 7

His-Ser-Asp-Ala-X¹-Phe-Thr-Asp-Tyr-Thr (I)

16

Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X²-Ala-X³-Lys-Lys-Tyr

28

-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn

其中X¹、X²和X³可以是相同或不同的，且各自是天然或非天然亲脂氨基酸残基。

3、根据权利要求2的医药组合物，其中X¹、X²和X³是相同或不同的，各自是选自亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、八氢吲哚-2-羧酸（oic）、环己基甘氨酸（chg）和环戊基甘氨酸（cpg）的氨基酸。

4、根据权利要求1的医药组合物，其中活性成分是VIP或其类似物、功能衍生物或片段在其N末端或C末端或两端与新脂部分偶联的结合物，其中所说的亲脂部分是至少有5个碳原子的饱和或未饱和烃基或羧酰基残基。

5、根据权利要求1的医药组合物，其中活性成分选自具有下列式Ⅱ顺序的肽

1 7

R¹-Y¹-His-Ser-Asp-Ala-X¹-Phe-Thr-Asp- (II)

16

Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X²-Ala-X³-

28

Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH-Y²-R²

其中R¹和R²可以是相同或不同的，且各自是氢，至少有5个碳原子的为饱和和未饱和的烃基或羧酰基的亲脂部分，或者R¹和R²可以是相同的或不同的，且各自是C₁-C₄烃基或羧酰基，条件是R¹和R²中至少一个是亲脂基团;

Y¹和Y²可以是相同或不同的，各自是-CH₂-或者在相联系的R¹或R²为氢时是键，且Y¹还可以是-CO-;

X¹、X²和X³可以是相同或不同的，且各自是天然的或非天然亲脂氨基酸残基。

或其生理学活性片段，或所说的式Ⅱ肽的功能衍生物或其生理学活性片段。

6、根据权利要求5的医药组合物，其中X¹、X²和X³是相同或不同的，且各自选自于亮氨酸、异高氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、八氢吲哚-2-羧酸（oic）、环己基甘氨酸（chg）和环戊基甘氨酸（cpg）。

7、根据权利要求3或6的医药组合物，其中X²是亮氨酸或正亮氨酸，X¹和X³是缬氨酸。

8、根据权利要求5的医药组合物，其中X²是正亮氨酸，X¹和X³是缬氨酸，Y¹是-CO-，R¹是亲脂基团且R²-Y²是氢。

9、根据权利要求8的医药组合物，其中R¹是C₁₇烷基。

10、根据权利要求1的医药组合物，其中（Ⅰ）到（Ⅳ）组中任何一种肽的至少一个非末端氨基酸残基携带有功能基团。

11、根据权利要求1的医药组合物，其中生理学活性片段（Ⅳ）具有VIP或VIP类似物的7至28位或16至28位氨基酸。

12、根据权利要求1的医药组合物，其活性成分是硬脂酰一正亮氨酸¹⁷-VIP。

13、根据权利要求1的医药组合物，其中活性成分是已酰一正亮氨酸¹⁷-VIP。

14、根据权利要求1的医药组合物，用于治疗痴呆。

15、根据权利要求14的医药组合物，用于治疗阿耳茨海默氏病引起的痴呆。

16、选自下列一组中的一种肽用于制备治疗神经变性疾病的药物：

（Ⅰ）血管活性肠肽（VIP）;

（Ⅱ）血管活性肠肽（VIP）类似物，其中一个或多个氨基酸已被置换，加入或缺失，而实质上没有改变母肽的生物学性质;

（Ⅲ）根据（Ⅰ）和（Ⅱ）的肽与亲脂部分偶联而成的结合物;

（Ⅳ）（Ⅰ）、（Ⅱ）和（Ⅲ）所述肽的生理学活性片段，以及（Ⅴ）（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）和（Ⅳ）中所述任何一种肽的功能衍生物。

17、根据权利要求16的应用，其中活性成分是具有式Ⅰ顺序的VIP类似物

1 7

His-Ser-Asp-Ala-X¹-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr (I)

16

-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X²-Ala-X³-Lys-Lys

28

-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn

其中X¹、X²和X³可以是相同或不同的，且各自是天然或非天然亲脂氨基酸的残基。

18、根据权利要求17的应用，其中X¹、X²和X³是相同或不同的，且各自选自于亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、八氢吲哚-2-羧酸（oic）、环己基甘氨酸（chg）和环戊基甘氨酸（cpg）。

19、根据权利要求16的应用，其中肽是VIP或其类似物，功能衍生物或片段在N末端或C末端或两端与亲脂部分偶联的结合物，其中所说的亲脂部分是至少有5个碳原子的饱和或未饱和的烃基或羧酰基残基。

20、根据权利要求16的应用，其中肽具有式Ⅱ所示的顺序：

1 7

R¹-Y¹-His-Ser-Asp-Ala-X¹-Phe-Thr-Asp (II)

16

-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-X²-Ala-

28

X³-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH-Y²

-R²

其中R¹和R²可以是相同或不同的，且各自是氢，至少有5个碳原子的未饱和或未饱和的烃基或羧酰基的亲脂部分，或者R¹和R²可以是相同或不同的，且各自是C₁-C₄烃基或羧酰基，条件是R¹和R²中至少一个是C₁-C₄烃基或羧酰基，且条件是R¹和R²中至少一个是亲脂基团;

Y¹和Y²可以是相同或不同的，且各自是-CH₂-或者在相联系的R¹或R²为氢时其为键，且Y¹还可以是-CO-;

X¹、X²和X³可以是相同或不同的，且各自是天然或非天然亲脂氨基酸残基;

或其生理学活性片段，以及所说式Ⅱ肽或其生理学活性片段的功能衍生物。

21、根据权利要求20的应用，其中X¹、X²和X³是相同或不同的，且各自选自于亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、八氢吲哚-2-羧酸（oic）、环己基甘氨酸（chg）和环戊基甘氨酸（cpg）的氨基酸。

22、根据权利要求18或21的应用，其中X²是亮氨酸或正亮氨酸，X¹和X³是缬氨酸。

23、根据权利要求20的应用，其中X²是正亮氨酸，X¹和X³是缬氨酸，Y¹是-CO-，R¹是亲脂基团且R²-Y²是氢。

24、根据权利要求23的应用，其中R¹是C₁₇烷基。

25、根据权利要求16的应用，其中（Ⅰ）至（Ⅳ）中任一种肽的2至27位中的至少一个氨基酸残基携带有功能基团。

26、根据权利要求16的应用，其中生理学活性片段具有VIP或VIP类似物的7至28位或16至28位中的氨基酸。

27、根据权利要求16的应用，其中肽是硬脂酰一正亮氨酸¹⁷-VIP。

28、根据权利要求16的应用，其中肽是已酰一正亮氨酸¹⁷-VIP。

29、根据权利要求17的应用是用于治疗痴呆。

30、根据权利要求29的应用是用于治疗阿耳茨海默氏病引起的痴呆。