CN110025787B - 干预膜联蛋白a2巯基亚硝基化修饰的医药用途 - Google Patents

Abstract

干预膜联蛋白A2的巯基亚硝基化修饰在制备动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物中的应用，涉及在心血管领域。动脉粥样硬化的动物血管组织中ANXA2的巯基亚硝基化修饰水平增加。在细胞水平，突变ANXA2的Cys133位点能抑制oxLDL导致的THP1细胞与内皮细胞粘附的增加，降低ICAM1与VCAM1的mRNA水平。在动物水平，突变ANXA2的Cys133位点能抑制高脂饮食导致的动脉粥样斑块增加，降低ICAM1与VCAM1的mRNA水平，以及血管内皮舒张功能，改善动脉粥样硬化相关血管疾病。本发明开拓了动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物制备的新方法，对于动脉粥样硬化相关血管疾病的防治提供了有意义的参考。

Description

干预膜联蛋白A2巯基亚硝基化修饰的医药用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)的巯基亚硝基化修饰在制备动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物中的应用。

背景技术

随着当今社会的飞速发展，心血管疾病作为人类健康“三大杀手”之首，正在日趋降低人类的生活质量，严重威胁人类的生命与健康。血管内皮功能障碍(vascularendothelial dysfunction,VED)已成为多种心血管疾病的关键调控因素，如动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)。AS是一种与血脂异常有关的慢性炎症性血管疾病，血管内皮作为血管内、外物质交换的通透性屏障，起着重要的生理作用。AS是多因素共同作用引起的，发病机制复杂，目前尚未完全阐明。主要危险因素有高血压、高血脂和大量吸烟，还有糖尿病、肥胖和遗传因素等。在致病因素的刺激下，内皮的活化和功能障碍是AS形成的始动环节。因此，明确内皮功能调节机制，为有效防止内皮功能障碍及其导致动脉粥样硬化提供新的思路，对研制新型的治疗动脉粥样硬化相关血管疾病的药物，寻找新的药物作用靶点，具有十分重要的意义

膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)是一类钙依赖性磷脂结合蛋白，在细胞膜、细胞质和细胞核中都有分布，与胞吞、胞吐、纤维蛋白溶解、离子通道形成和细胞基质相互作用都有关系。最早发现ANXA2存在于在内皮细胞的细胞膜上，进而结合纤溶酶原(plasminogen)和组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)，从而使纤溶酶原被激活，形成纤溶酶，促进溶血。许多研究也表明，ANXA2的活性或者表达的改变与血栓的形成有密切关系。另外有研究显示，在肝脏中ANXA2能抑制细胞内前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶(proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9，PCSK9)的活性，而后者能通过降解LDL受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)，使LDL受体循环中断。

蛋白质巯基亚硝基化修饰是Stamler教授于1994年提出的一种新的蛋白质翻译后修饰，即NO基团与蛋白质半胱氨酸的巯基-SH生成-SNO(S-nitrosylation)，并指出NO通过蛋白质巯基亚硝基化修饰进行氧化还原信号转导的调控。蛋白质的巯基亚硝基化修饰可通过影响蛋白质的生物活性以及表达、亚细胞定位、分子间相互作用(包括蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-核酸相互作用)等参与蛋白质功能调控，类似于蛋白质磷酸化、谷胱甘肽化、棕榈酰化、乙酰化和其他类型的蛋白质修饰。因此蛋白质巯基亚硝基化修饰成为一种翻译后修饰，广泛存在于各个组织器官中，但其在生命活动中的具体作用及机理亟待深入研究。亚硝基化修饰信号一旦被干扰或者发生异常调节，将会导致细胞功能的受损，进一步表现出多种多样的疾病症状，其调控紊乱已涉及多种疾病的发生发展，如哮喘、囊性纤维化、帕金森、心力衰竭、中风、肺动脉高压、缺血性冠状动脉综合症等。在模式动物中使用增加巯基亚硝基化修饰水平的方式可导致肺动脉高压、镰刀形红细胞和心力衰竭等多种病状，而减少巯基亚硝基化修饰水平则会导致胰岛素抵抗、糖尿病及神经退行性病变(如帕金森综合症)等疾病。

目前，ANXA2的巯基亚硝基化修饰在心血管疾病中的作用及其机制目前尚未有任何相关的研究和报道。

发明内容

针对上述问题，本发明首先提供一种膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)的医药用途，即膜联蛋白A2(ANXA2)Cys133位点在制备动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物中的应用，具体而言，所述应用是指，根据ANXA2 Cys133位点设计下调该位点巯基亚硝基化修饰的生物材料，并用于制备动脉粥样硬化防治药物。

其次本发明提供了下调ANXA2 Cys133巯基亚硝基化修饰的生物材料在制备动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物中的应用，具体而言，所述生物材料包括但不限于为ANXA2C133A的腺相关病毒，该腺相关病毒包括但不限于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的内皮特异性病毒。

本发明首次发现并验证了内皮细胞内ANXA2巯基亚硝基化修饰的水平与动脉粥样硬化相关血管疾病的相关性，并首次发现及验证了ANXA2 Cys133位点位点突变(下调内皮细胞内ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰的表达水平)有效抑制动脉粥样硬化相关血管疾病的发生。

在致病因素刺激下，内皮的活化和功能障碍是AS形成的始动环节。本发明首次明确内皮功能调节机制，为有效防止内皮功能障碍及其导致的动脉粥样硬化提供新的防治药物研发途径，和新的药物作用靶点，具有十分重要的药用价值。

附图说明

图1：EA.hy926内皮细胞给予oxLDL(氧化低密度脂蛋白)刺激2小时，构建内皮细胞损伤模型，Biotin-switch检测中ANXA2的巯基亚硝基化修饰水平。**P<0.01。

图2：apoE^-/-小鼠，给予正常饮食和高脂饮食喂养，构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型。16周后，收取两组小鼠的血管组织，biotin-switch检测血管组织ANXA2的巯基亚硝基化修饰水平。***P<0.005。

图3：正常病人和CAD病人的血管组织，biotin-switch检测血管组织ANXA2的巯基亚硝基化修饰水平。**P<0.01。

图4：利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术，EA.hy926给予NO供体硝普钠(sodiumnitropmsside,SNP)处理，biotin-switch检测内皮细胞中ANXA2的巯基亚硝基化修饰，筛选ANXA2的巯基亚硝基化修饰位点。

图5：构建ANT1半胱氨酸C133位点突变质粒，转染EA.hy926细胞，biotin-switch检测细胞内ANXA2的巯基亚硝基化修饰水平。**P<0.01。*P<0.05。

图6：构建133位点突变的质粒(C133A)和野生型质粒(WT)转染内皮细胞，oxLDL刺激24小时，通过RT-PCR检测粘附因子ICAM1、VCAM1 mRNA的水平；通过westernblot检测ICAM1、VCAM1的蛋白水平。*P<0.05。**P<0.01。***P<0.005。

图7：构建133位点突变的质粒(C133A)和野生型质粒(WT)转染内皮细胞，oxLDL刺激24小时，与用活细胞细胞膜红色荧光染料Dil(2.5mg/m)标记的人外周血单核细胞THP1共培养1h，通过倒置荧光显微镜观察单核细胞与内皮细胞黏附情况。***P<0.005。

图8：构建133位点突变的腺相关病毒(AAV-C133A)、野生型腺相关病毒(AAV-WT)尾静脉注射apoE^-/-小鼠，1周后行正常胆固醇或高胆固醇饮食喂养构建小鼠的动动脉粥样硬化相关血管疾病模型，喂养16周，检测小鼠血浆中的TG、LDL-c、T-CHO和HDL-c含量。*P<0.05。**P<0.01。***P<0.005。

图9：构建133位点突变的腺相关病毒(AAV-C133A)、野生型腺相关病毒(AAV-WT)尾静脉注射apoE^-/-小鼠，1周后行正常胆固醇或高胆固醇饮食喂养构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型，16周收取小鼠血管组织，RT-PCR检测粘附因子ICAM1，VCAM1 mRNA的水平；免疫荧光检测ICAM1，VCAM1的蛋白水平。*P<0.05。

图10：构建133位点突变的腺相关病毒(AAV-C133A)、野生型腺相关病毒(AAV-WT)尾静脉注射apoE^-/-小鼠，1周后行正常胆固醇或高胆固醇饮食喂养构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型，喂养16周，收取小鼠血管组织，油红O染色检测斑块形成情况，HE染色检测主动脉根部的斑块面积，masson染色检测主动脉根部的胶原含量。

图11：构建133位点突变的腺相关病毒(AAV-C133A)、野生型腺相关病毒(AAV-WT)尾静脉注射apoE^-/-小鼠，1周后行正常胆固醇或高胆固醇饮食喂养构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型，喂养16周，收取小鼠血管组织，血管张力仪检测小鼠血管舒张功能。*P<0.05。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

1人脐静脉内皮细胞(HUVECs)；南京市妇幼保健院提供。

2 EA.hy926细胞株：购于上海生科院细胞所，来源为American Type TissueCulture Collection(ATCC)。

3人急性单核细胞细胞系(THP1)：购于上海生科院细胞所，来源为American TypeTissue Culture Collection(ATCC)。

4 apoE^-/-小鼠：购于维通利华实验动物技术有限公司。

5正常人和CAD病人的血管组织由南京市鼓楼医院提供。

6 ANXA2野生型WT以及半胱氨酸Cys133位点突变质粒：购于金唯智生物科技有限公司。

实施例1 ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰与动脉粥样硬化相关血管疾病相关性研究实验

为了探索ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰在动脉粥样硬化相关血管疾病中的作用，培养EA.hy926内皮细胞(Xie L,et al.Br J Pharmacol.2012；165(3):754-64.)，实验组加入oxLDL(氧化低密度脂蛋白，100μg/mL)刺激2h引起内皮细胞损伤，构建内皮细胞损伤模型，同时以加入等量PBS组作为对照组(control)，分别提取蛋白，通过Biotin-switch检测(检测方法参见文献“Xie L,et al.Diabetes.2016Jun 22.”)ANXA2的巯基亚硝基化修饰(SNO-ANXA2)水平，检测结果如图1所示。图1A中，SNO-ANXA2代表ANXA2的巯基亚硝基化含量，Total-ANXA2代表总的ANXA2蛋白水平，β-actin代表肌动蛋白含量(内参)。图1B为图1A的量化与统计分析。由图1可见，相比于对照PBS组(control)，oxLDL(μg/mL)刺激2h可明显增加SNO-ANXA2水平。

接着，利用apoE^-/-小鼠分别给予(SPF级)正常饮食(对照组，RCD)或高胆固醇饮食(D12108C，实验组，HCD)(喂食方法参见文献“Cheng WL,et al.Br J Pharmacol.2015；172(23):5676-89”)，构建小鼠的动脉粥样硬化相关疾病模型，16周后利用biotin-switch结合westernblo检测小鼠血管组织中SNO-ANXA2的水平。检测结果如图2A所示。图2A中，SNO-ANXA2代表ANXA2的巯基亚硝基化含量，Total-ANXA2代表总的ANXA2蛋白水平，β-tublin代表肌动蛋白含量(内参)。图2B为图2A的量化与统计分析。由图2可见，与对照组相比，实验组高脂饮食组小鼠血管组织中SNO-ANXA2水平明显增加。

最后，在正常人(Normal)和CAD病人(Patients)的血管组织中，利用Biotin-switch检测血管组织SNO-ANXA2的水平，检测结果如图3所示。图2A中，SNO-ANXA2代表ANXA2的巯基亚硝基化含量，Total-ANXA2代表总的ANXA2蛋白水平，β-actin代表肌动蛋白含量(内参)。图3B为图3A的量化与统计分析。由图3可见，与正常人相比，CAD病人血管组织中SNO-ANXA2水平明显增加。

以上实验结果提示：在内皮损伤的细胞，小鼠模型以及CAD病人的血管组织中，ANXA2蛋白的巯基亚硝基化水平都明显升高。

实施例2 ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰位点筛选实验

为了进一步明确ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰在动脉粥样硬化相关血管疾病中的作用，本实施例结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术(Xie L,et al.Diabetes.2016 Jun22.)，在EA.hy926内皮细胞给予NO供体硝普钠(sodium nitropmsside,SNP)(100μM)处理，筛选ANXA2的巯基亚硝基化修饰位点，发现在oxLDL作用的EA.hy926内皮细胞中，ANXA2半胱氨酸C133位点发生了巯基亚硝基化修饰(图4)。

将ANXA2半胱氨酸Cys133突变丙氨酸(C133A)，用lip3000转染试剂转染EA.hy926细胞，进一步得出ANXA2的C133位点发生了巯基亚硝基化修饰(图5)。图5A中，SNO-HA为外源性的SNO-ANXA2，Total-HA为外源性转染的ANXA2的总蛋白，图5B是图5A的量化与统计分析。

将ANXA2 C133A和野生型(WT)内皮细胞，oxLDL(100μg/mL)刺激24小时，通过RT-PCR检测粘附因子ICAM1、VCAM1的表达情况；在通过westernblot检测ICAM1、VCAM1的蛋白水平(Xie L,et al.Antioxid Redox Signal.2016,20；24(6):329-343；Xi H,et al.CircRes.2016；118(10):1525-39.)。检测结果如图6所示，可见，在oxLDL作用下，C133位点突变后，ICAM1，VCAM1表达水平相比于转染WT组明显降低(图6A)。图6B中，GAPDH为内参，图6C和图6D分别为ICAM1和VCAM1的量化与统计分析。

用Dil(2.5μg/mL)标记培养的人外周血单核细胞(THP1)，在37℃孵育10min。将标记的人外周血单核细胞加入到已经处理好的内皮细胞中，在37℃共孵育1h。用预热的PBS洗3遍。最后在荧光显微镜下观察单黏附情况(以上操作注意避光)。结果如图7所示，图7A为红色荧光染料染色结果照片，图7B纵坐标为每100X视野中粘附的单核细胞数。可见，在oxLDL作用下，C133位点突变后，单核细胞与内皮细胞的粘附相比于WT组明显降低。

通过以上实验结果可以有力证明：抑制ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰水平可以有效抑制oxLDL诱导的血管损伤。

实施例3 ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰在制备动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物中的应用

为了进一步验证ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰在动脉粥样硬化相关血管疾病中的作用，我们给8周龄小鼠尾静脉注射腺相关病毒10¹¹个/只(Wang L,et al.Nature.2016Dec7；540(7634):579-582.；Varadi K,et al.Gene Ther.2012Aug；19(8):800-9.)，内皮细胞特异性过表达133位点突变及野生型ANXA2蛋白，注射后1周后行正常胆固醇(SPF级)或高胆固醇饮食(D12108C)喂养构建小鼠的动脉粥样硬化相关血管疾病模型。本实施例所使用的腺相关病毒为内皮特异性病毒，由香港中文大学黄聿教授所赠，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；同时以ANXA2野生型病毒(AAV-WT,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)作为对照组。

按照上述步骤喂养小鼠16周后，分别进行如下检测：

1、取小鼠血浆检测血浆中TG、LDL-c、T-CHO和HDL-c含量(Xie L,etal.Diabetes.2016Jun 22.)(图8)。结果显示：与对照组相比，在下调了ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰水平以后，小鼠血浆中的T-CHO(图8A)、TG(图8B)和LDL-c(图8C)水平明显降低，HDL-c(图8D)水平明显增高。

图8中AAV-WT-RCD代表注射ANXA2野生型病毒，正常饮食喂养；AAV-WT-HCD代表注射ANXA2野生型病毒，高脂饮食喂养；AAV-C133A-HCD代表注射ANXA2 C133A病毒，高脂饮食喂养。

通过RT-PCR检测粘附因子ICAM1、VCAM1的表达情况；免疫荧光检测ICAM1、VCAM1的蛋白水平。结果如图9所示，可见，与对照组相比，在下调了ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰水平以后，细胞内ICAM1，VCAM1的表达水平明显降低。

图9中AAV-WT-RCD代表注射ANXA2野生型病毒，正常饮食喂养；AAV-WT-HCD代表注射ANXA2野生型病毒，高脂饮食喂养；AAV-C133A-HCD代表注射ANXA2 C133A病毒，高脂饮食喂养。

2、用油红O染色检测斑块形成情况如图10A所示；H&E染色检测主动脉根部斑块面积，如图10B第一行所示；masson染色检测主动脉根部胶原含量，如图10B第二行所示。通过实验结果可以发现与对照组相比，在下调了ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰水平以后，可以减少斑块面积，增加胶原含量，增加斑块的稳定性(图10)。

3、利用血管张力仪评估血管的舒张功能，通过实验结果可以发现与对照组相比，在下调了ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰水平以后，小鼠血管舒张功能显著改善(图11)。

以上实验结果可以进一步证明：ANXA2发生蛋白巯基亚硝基化修饰可以起到促进动脉粥样硬化相关血管疾病的作用，下调ANXA2巯基亚硝基化修饰位点Cys133巯基亚硝基化修饰水平的生物材料(如针对ANXA2的腺相关病毒)，可以应用于动脉粥样硬化防治药物的制备。

以上的实验结果充分证明，内皮细胞中ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰在动脉粥样硬化相关血管疾病的进程中发挥了重要的调控作用，能够有效促进动脉粥样硬化相关血管疾病的发生。通过转染位点突变的腺相关病毒的方式，有效下调心肌细胞内ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰水平后，可以有效的抑制动脉粥样硬化相关血管疾病的发生。因此，我们认为ANXA2蛋白巯基亚硝基化修饰可以作为临床上治疗动脉粥样硬化相关血管疾病的一个新的重要靶标，在动脉粥样硬化相关血管疾病的防治中具有潜在的临床应用价值。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 干预膜联蛋白A2巯基亚硝基化修饰的医药用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtaccatgt ctactgttca cgaaatcctg tgcaagctca gcttggaggg tgatcactct 60

acacccccaa gtgcatatgg gtctgtcaaa gcctatacta actttgatgc tgagcgggat 120

gctttgaaca ttgaaacagc catcaagacc aaaggtgtgg atgaggtcac cattgtcaac 180

attttgacca accgcagcaa tgcacagaga caggatattg ccttcgccta ccagagaagg 240

accaaaaagg aacttgcatc agcactgaag tcagccttat ctggccacct ggagacgttg 300

attttgggcc tattgaagac acctgctcag tatgacgctt ctgagctaaa agcttccatg 360

aaggggctgg gaaccgacga ggactctctc attgagatca tcgcctccag aaccaaccag 420

gagctgcagg aaattaacag agtctacaag gaaatgtaca agactgatct ggagaaggac 480

attatttcgg acacatctgg tgacttccgc aagctgatgg ttgccctggc aaagggtaga 540

agagcagagg atggctctgt cattgattat gaactgattg accaagatgc tcgggatctc 600

tatgacgctg gagtgaagag gaaaggaact gatgttccca agtggatcag catcatgacc 660

gagcggagcg tgccccacct ccagaaagta tttgataggt acaagagtta cagcccttat 720

gacatgttgg aaagcatcag gaaagaggtt aaaggagacc tggaaaatgc tttcctgaac 780

ctggttcagt gcattcagaa caagcccctg tattttgctg atcggctgta tgactccatg 840

aagggcaagg ggacgcgaga taaggtcctg atcagaatca tggtctcccg cagtgaagtg 900

gacatgttga aaattaggtc tgaattcaag agaaagtacg gcaagtccct gtactattat 960

atccagcaag acactaaggg cgactaccag aaagcgctgc tgtacctgtg tggtggagat 1020

gacgggggtg gaggctctta tccttacgac gtgcctgact acgcctaatc taga 1074

<210> 2

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaccatgt ctactgttca cgaaatcctg tgcaagctca gcttggaggg tgatcactct 60

acacccccaa gtgcatatgg gtctgtcaaa gcctatacta actttgatgc tgagcgggat 120

gctttgaaca ttgaaacagc catcaagacc aaaggtgtgg atgaggtcac cattgtcaac 180

attttgacca accgcagcaa tgcacagaga caggatattg ccttcgccta ccagagaagg 240

accaaaaagg aacttgcatc agcactgaag tcagccttat ctggccacct ggagacgttg 300

attttgggcc tattgaagac acctgctcag tatgacgctt ctgagctaaa agcttccatg 360

aaggggctgg gaaccgacga ggactctctc attgagatca tctgctccag aaccaaccag 420

gagctgcagg aaattaacag agtctacaag gaaatgtaca agactgatct ggagaaggac 480

attatttcgg acacatctgg tgacttccgc aagctgatgg ttgccctggc aaagggtaga 540

agagcagagg atggctctgt cattgattat gaactgattg accaagatgc tcgggatctc 600

tatgacgctg gagtgaagag gaaaggaact gatgttccca agtggatcag catcatgacc 660

gagcggagcg tgccccacct ccagaaagta tttgataggt acaagagtta cagcccttat 720

gacatgttgg aaagcatcag gaaagaggtt aaaggagacc tggaaaatgc tttcctgaac 780

ctggttcagt gcattcagaa caagcccctg tattttgctg atcggctgta tgactccatg 840

aagggcaagg ggacgcgaga taaggtcctg atcagaatca tggtctcccg cagtgaagtg 900

gacatgttga aaattaggtc tgaattcaag agaaagtacg gcaagtccct gtactattat 960

atccagcaag acactaaggg cgactaccag aaagcgctgc tgtacctgtg tggtggagat 1020

gacgggggtg gaggctctta tccttacgac gtgcctgact acgcctaatc taga 1074

Claims (1)

1.下调ANXA2 巯基亚硝基化修饰位点 Cys133巯基亚硝基化修饰水平的生物材料在制备动脉粥样硬化防治药物中的应用；

所述生物材料为ANXA2 C133A的腺相关病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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