CN110018247A - 一种检测麦角硫因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学分析领域，公开了一种检测麦角硫因的方法，该方法包括：采用SB‑aq色谱柱对可能含有麦角硫因的待测样品进行高压液相色谱分析。特别地，利用梯度洗脱对色谱柱进行洗脱，从而能够进一步延长色谱柱的使用时间。通过上述技术方案，本发明建立了一种检测时间短、准确度高、稳定性强、色谱柱使用时间长的麦角硫因检测方法。且即使在色谱柱使用一段时间后仍能够确保准确度和稳定性，降低了检测成本。

Description

一种检测麦角硫因的方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种检测麦角硫因的方法。

背景技术

麦角硫因是一种稀有的天然手性氨基酸，具有很强的抗氧化活性，是一种独特的细胞生理保护剂。麦角硫因极易溶于水，不易分解，对光、热不敏感，在器官移植、细胞保存、医药、食品饮料、化妆品等领域具有广泛的用途和市场前景。建立一种快速、准确、稳定的检测方法，是对麦角硫因进行研发和生产的前提和基础。

至今尚无麦角硫因检测方法的标准。目前较普遍的方法是利用高效液相色谱对麦角硫因进行定量检测，所用检测柱普遍为反相C₁₈柱。

周念波等采用HPLC测定了双孢菇子实体中麦角硫因的含量，色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶(Hypersil ODS C₁₈柱，250mm×4.6mm，5μm)，乙腈-水(3:97，v/v)作为流动相，在257nm下测定麦角硫因(周念波，朱艳琴，殷勤红.高效液相色谱法测定双孢菇中麦角硫因的含量[J].食品科技，2010，35(10):271-272.)。

姜文侠等建立了两套麦角硫因的检测方法，具体见CN103743825A和CN104749263A，分别使用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(两根串联)和HILIC分析色谱柱进行高压液相色谱分析。

但是目前所报道的上述XDB-C18色谱柱(两根串联)液相色谱检测方法在实现目的峰有效分离的条件下，色谱柱在使用一段时间后填料塌陷，色谱峰形、准确度和稳定性难以保证。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种检测麦角硫因的方法。

本发明的发明人发现，采用SB-aq色谱柱对待测样品进行高压液相色谱分析能够获得较高的检测准确度和稳定性。因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种检测麦角硫因的方法，该方法包括：采用SB-aq色谱柱对可能含有麦角硫因的待测样品进行高压液相色谱分析。

特别地，利用梯度洗脱对色谱柱进行洗脱，从而能够进一步延长色谱柱的使用时间。

通过上述技术方案，本发明建立了一种检测时间短、准确度高、稳定性强、色谱柱使用时间长的麦角硫因检测方法。且即使在色谱柱使用一段时间后仍能够确保准确度和稳定性，降低了检测成本。

附图说明

图1是麦角硫因的HPLC标准曲线；

图2是麦角硫因摇瓶发酵样品的HPLC检测谱图；

图3是麦角硫因摇瓶发酵样品的HPLC-MS谱图；

图4是待测样品中麦角硫因的含量随样品存放时间的变化曲线。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供的检测麦角硫因的方法包括：采用SB-aq色谱柱对可能含有麦角硫因的待测样品进行高压液相色谱分析。SB-aq色谱柱的官能团为单官能团硅烷，具有二异丙基侧链基团，空间位阻关键的硅氧烷键合到硅胶表面，具有在低pH条件下不易被水解破坏的特点，可为酸性、碱性和中性化合物提供稳定的峰形。

根据本发明的优选实施方式，采用SB-aq色谱柱对待测样品进行高压液相色谱分析的条件包括：流动相为pH 2-6、水的体积占比为90-100vol％的乙腈-水或甲醇-水，紫外检测波长为250-260nm，柱温为15-40℃，流速为0.5-1.5mL/min。本领域技术人员公知的是，液相色谱分析通常采用去离子水(纯水)。其中，“水的体积占比”是指水的体积与水和另一种溶剂(甲醇或乙腈)的总体积的百分比。

更优选地，流动相的pH为2.5-5，最优选为5。

更优选地，流动相中，水的体积占比为95-100vol％，最优选为99vol％。

更优选地，紫外检测波长为257nm。

更优选地，柱温为25-35℃，最优选为30℃。

更优选地，流速为0.7-1.2mL/min，最优选为0.7mL/min。

根据本发明，所述方法还可以包括每次检测后对SB-aq色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：

或者，梯度洗脱的程序为：

或者，梯度洗脱的程序为：

本发明的发明人发现，上述第三种38分钟的梯度洗脱亦能够获得较佳的洗脱效果，从而在进一步缩短检测时间的基础上确保了检测的准确度和稳定性。

根据本发明，可以使用酸碱调节剂调节流动相的pH值，所述酸碱调节剂优选选自乙酸、磷酸、硼酸、甲酸、氨水和三乙胺中的至少一种。

根据本发明，所述SB-aq色谱柱可以为各种常规的选择，优选情况下，SB-aq色谱柱为Agilent ZORBAX SB-aq色谱柱。

根据本发明，高压液相色谱分析时的进样体积可以为3-10μL。

根据本发明，所述待测样品可以为各种常见的可能含有麦角硫因的样品，例如，包括但不限于菌丝体或发酵液，包括蕈菌发酵(摇瓶或发酵罐)后的浸提样品、后续纯化过程(如离子交换纯化)等不同工序的样品。根据一种优选的实施方式，所述待测样品为蕈菌发酵后得到的菌丝体的含水浸提液。进一步优选地，所述待测样品通过以下方法获得：将发酵获得的蕈菌菌丝体用水进行浸提，然后经截留分子量为1.5-30kDa(特别是3kDa)的超滤膜过滤，得到的透过液即为含有麦角硫因的待测样品。其中，浸提的温度可以为50-100℃，浸提的时间可以为10-90min。本发明中，所述蕈菌可以为白蘑科(Tricholomataceae)的常见蕈菌，如侧耳属(Pleurotus)的蕈菌。优选情况下，所述蕈菌为糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)，如保藏编号为CGMCC No.6232的糙皮侧耳(该菌种已于2012年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，于CN103734022A中公开)。

根据本发明，只要分析高压液相色谱分析谱图上是否存在麦角硫因色谱峰即可获知待测样品中麦角硫因的存在。本发明的方法中，麦角硫因的出峰时间为第5-6分钟。进一步按照积分法测定麦角硫因色谱峰的峰面积即可能对待测样品中的麦角硫因含量进行定量。因此，根据本发明的一种特定实施方式，所述方法还包括计算高压液相色谱分析所得图谱上第5-6分钟所对应的峰面积，以对所述待测样品中的麦角硫因进行定量。定量可以借助标准曲线，绘制标准曲线的方法为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。

根据本发明的一种优选实施方式，对所述待测样品中的麦角硫因进行定量的方法包括：

(1)制备含不同浓度的麦角硫因对照品溶液；

(2)对含不同浓度的麦角硫因对照品溶液分别采用SB-aq色谱柱进行高压液相色谱检测；

(3)根据麦角硫因对照品溶液的浓度和峰面积绘制标准曲线；

(4)根据标准曲线和高压液相色谱检测得到的峰面积，对待测样品中的麦角硫因进行定量。

根据本发明，所述方法适用于测定含量范围较宽的样品中的麦角硫因含量，优选地，所述待测样品中的麦角硫因含量为0.045μg/L至1000mg/L(更优选如0.9μg/L至1000mg/L)。当待测样品中的麦角硫因含量为50mg/L至400mg/L时，能够更好地实现定量检测。若样品麦角硫因浓度高于此范围，先进行稀释子再实施检测。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，主要仪器和试剂来源如下：

主要仪器：高压液相色谱仪(简称HPLC，1260Infinity)由美国Agilent公司生产；超滤离心管(3kDa，美国MiliPORE公司)；微孔滤膜(0.22μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；水浴(TW20型，Julabo)；数字式加热磁力搅拌器(MIX Control 20型，WIGGENS)；高速台式冷冻离心机(TGL-16M型，湘仪离心机仪器有限公司)；超声机(SB-5200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司)。

主要试剂：麦角硫因对照品(纯度≥98重量％，Biomol International Inc.)；乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等试剂均为市售色谱纯；化学试剂KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、NaOH、Na₂HPO₄、柠檬酸、乙酸铵等，购自国药集团化学试剂有限公司；玉米粉购自梅河口市兴达米业有限责任公司；豆饼粉购自北京中棉紫光生物科技有限公司；α-淀粉酶购自北京索莱宝科技有限公司；甘油购自天津市风船化学试剂科技有限公司；酪蛋白胨购自偃师市百家工贸有限公司。

制备例1

对照品溶液的制备：精密称取麦角硫因对照品10mg，于10ml容量瓶中加纯水配成浓度为1000mg/L的对照品贮备液。再吸取贮备液适量，加纯水制成浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到不同浓度的对照品溶液。

按照如上相同的方法获得其它浓度的待测溶液1-4。

制备例2

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CGMCC No.6232菌丝体发酵液的制备。

斜面培养基：PDA培养基(Becton，Dickinson and Company)。

液体种子培养基(g/L)：玉米粉30g/L、豆饼粉15g/L、α-淀粉酶54U/L、KH₂PO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，在500mL三角瓶中的装液量为150mL。

液体发酵培养基(g/L)：甘油68g/L、酪蛋白胨45g/L、KH₂PO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O1.5g/L，半胱氨酸0.9g/L，蛋氨酸2.1g/L，其余为水，121℃灭菌20min，500mL三角瓶中装液量为150mL。

挑取斜面培养基菌种CGMCC No.6232的菌苔接入种子培养基，25℃摇床150rpm培养4天，得到种子液。将种子液按体积比5％的接种量接入发酵培养基，25℃摇床150rpm培养15天，得发酵液。

实施例1

本实施例用来说明本发明方法的检测准确度。

取已知浓度的待测溶液按照如下步骤检测麦角硫因(实验组)：将待测溶液注入高压液相色谱仪进行检测，每个样品在同一色谱柱上进行5次平行检测，HPLC检测条件为：安捷伦ZORBAX-SB-aq色谱柱，流动相成分的体积比为甲醇∶纯水＝1∶99、使用乙酸调节pH＝5；检测波长257nm，柱温30℃，进样体积5μL，流速0.7mL/min，麦角硫因出峰时间为6min。在相同条件下检测对照品溶液，并根据对照品的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，标准曲线见图1，从而根据待测溶液所得到的峰面积结果计算所对应的浓度值，结果以5次检测的平均值(实测浓度)表示，并计算相对偏差，对不同浓度的对照品溶液的检测结果如表1所示。此外，根据进样量和信噪比(3和10)，测得本发明方法的最低检出限和定量限分别为0.045μg/L和0.9μg/L。另外，将甲醇替换为乙腈，结果与使用甲醇时的结果相近，因此，乙腈亦可以作为流动相的成分。

表1

	理论浓度	实测浓度	相对偏差
				待测溶液1	86mg/L	85.64mg/L	0.41％
待测溶液2	166mg/L	168.54mg/L	1.53％
				待测溶液3	243mg/L	242.20mg/L	0.33％
待测溶液4	399mg/L	402.63mg/L	0.91％

从该实施例可以看出，对于已知浓度的样品，实测浓度与理论浓度的相对偏差均小于2％，说明本发明的方法可以准确测定麦角硫因。

实施例2

本实施例用来说明本发明方法的检测稳定性。

配制浓度为50、100、200、300、400mg/L的麦角硫因对照品溶液每周进行检测。HPLC检测条件为：安捷伦ZORBAX-SB-aq色谱柱，流动相成分的体积比为甲醇∶纯水＝1∶99、使用乙酸、氨水调节pH＝5；检测波长257nm，柱温30℃，进样体积5μL，流速0.7mL/min，麦角硫因出峰时间为6min。在相同条件下检测对照品溶液，并根据对照品的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，以此为实验组。

按照上述步骤进行检测，不同的是，HPLC检测使用的色谱柱为Agilent EclipseXBD-C18，250mm×4.6mm，5μm，两根色谱柱串联使用，并以此作为对照组。

实验组和对照组的麦角硫因的峰面积测试结果如下表2所示。

表2

由以上表格显示的结果明显可见，实验组相同浓度的麦角硫因对照品溶液峰面积一直较稳定，而对照组相同浓度的麦角硫因对照品溶液峰面积一直在变小，偏差较大。

实施例3

本实施例用来说明本发明的方法在检测蕈菌发酵产物(菌丝体)中的麦角硫因的应用。

(1)菌丝体的预处理方法：过滤发酵液收集菌丝体，随后加入与发酵液等体积的纯水，制成菌丝体悬液。利用磁力搅拌器进行浸提，控制转速为100rpm，浸提温度90℃，浸提时间为30min，得到菌丝体浸提液。浸提液超滤离心(超滤膜的截留分子量为3kDa)10min，离心条件12840×g，透过液即为待测样品。

(2)麦角硫因的检测：将待测样品注入高压液相色谱仪进行检测，每个样品在同一色谱柱上进行5次平行检测，HPLC检测条件为：安捷伦ZORBAX-SB-aq色谱柱，流动相成分的体积比为甲醇∶纯水＝1∶99、使用乙酸调节pH＝5；检测波长257nm，柱温30℃，进样体积5μL，流速0.7mL/min，检测图谱如图2所示，麦角硫因出峰时间为6min。在相同条件下检测对照品溶液，并根据对照品的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，从而根据待测样品所得到的峰面积结果计算所对应的浓度值。5次检测的平均值(实测浓度)为11.43mg/L，RSD为2.31％。

(3)按照上述方法进行麦角硫因的检测，不同的是，流速分别控制为0.5mL/min、1mL/min、1.2mL/min和1.5mL/min，结果显示，控制流速为0.7mL/min左右(0.7-1.2mL/min)能够更好地使目标峰与杂质峰分离，从而实现准确检测。

(4)按照上述方法进行麦角硫因的检测，不同的是，柱温分别控制为15℃、20℃、30℃和35℃，结果显示，控制柱温在30℃左右(25-35℃)能够更好地使目标峰与杂质峰分离，从而实现准确检测。

(5)按照上述方法进行麦角硫因的检测，不同的是，流动相成分的体积比分别为甲醇∶纯水＝10∶90(或5∶95)。结果显示，5次检测均发现麦角硫因色谱峰与杂质峰未实现基线分离，无法进行准确定量。

(6)质谱检测：为了验证6min的峰对应的是麦角硫因色谱峰，对该峰进行质谱检测，质谱检测条件为：质谱仪：Agilent6120；离子源：ESI；检测模式：正离子检测；喷雾电压：4.5KV；氮气流速：3L/min；毛细管温度：220℃；毛细管电压：10V；采用全离子扫描方式，扫描范围50-450m/z；

检测结果：检测图谱如图3所示，根据与紫外光谱相同洗脱方法下提取与标准品溶液相同保留时间的分子峰，色谱峰的一级质谱显示的分子离子峰[M+H]⁺为230.0597Da，[M+K]⁺为268.0498Da，根据麦角硫因的分子量为229Da，确定了该实施例的高压液相色谱图中所确定的色谱峰即是麦角硫因的色谱峰。

(7)取步骤(1)获得的待测样品于室温(约25℃)下分别放置0h、2h、4h、6h、8h、10h和12h，考察待测样品的时间稳定性，HPLC检测条件同步骤(2)，每个时间点的样品平行测定3次，检测结果见图4，RSD为2.89％，说明麦角硫因待测样品在12h内稳定性良好。

实施例4

本实施例用来说明本发明的方法在检测蕈菌发酵产物(菌丝体)中的麦角硫因中的应用。

(1)菌丝体的预处理方法：过滤发酵液收集菌丝体，随后加入与发酵液等体积的纯水，制成菌丝体悬液。利用磁力搅拌器进行浸提，控制转速为350rpm，浸提温度90℃，浸提时间为30min，得到菌丝体浸提液。浸提液超滤离心(超滤膜的截留分子量为3kDa)10min，离心条件12840×g，透过液即为待测样品。

(2)麦角硫因的检测：同上一实施例步骤(2)，且每次检测后先进行梯度洗脱再进行下一次的检测，具体的梯度洗脱方式如下：

5次检测的平均值(实测浓度)为61.69mg/L，RSD为1.43％。

实施例5

本实施例用来说明本发明的方法在检测蕈菌发酵产物(菌丝体)中的麦角硫因中的应用。

发酵液的预处理方法：将发酵液静置于水浴锅中浸提，温度为90℃，浸提时间为30min。浸提液超滤离心(超滤膜的截留分子量为3kDa)10min，离心条件12840×g，透过液即为待测样品。

麦角硫因的检测：同上一实施例，且每次检测后先进行梯度洗脱再进行下一次的检测，具体的梯度洗脱方式如下：

5次检测的平均值(实测浓度)为135.04mg/L，RSD为1.16％。

实施例6

按照上一实施例的方法进行麦角硫因的检测，不同的是，具体的梯度洗脱方式如下：

5次检测的平均值(实测浓度)为78.12mg/L，RSD为1.91％。

测试例1

取按照实施例3的步骤(1)获得的待测样品(样品1)以及按照实施例4的步骤(1)获得的待测样品(样品2)，分别添加不同已知浓度的麦角硫因对照品溶液，测定麦角硫因在样品中的含量，HPLC检测条件同实施例3的步骤(2)，每份样品平行进样3次，根据检测值计算麦角硫因的回收率，检测结果见表3，其中，回收率＝(检测值-样品中麦角硫因含量)/对照品加入量×100％。

表3

由麦角硫因检测回收率的实验结果可进一步看出，本发明的方法可满足定量分析的要求。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测麦角硫因的方法，其特征在于，该方法包括：采用SB-aq色谱柱对可能含有麦角硫因的待测样品进行高压液相色谱分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，采用SB-aq色谱柱对待测样品进行高压液相色谱分析的条件包括：流动相为pH 2-6、水的体积占比为90-100vol％的乙腈-水或甲醇-水，紫外检测波长为250-260nm，柱温为15-40℃，流速为0.5-1.5mL/min。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，流动相的pH为2.5-5；

和/或，流动相中，水的体积占比为95-100vol％；

和/或，紫外检测波长为257nm；

和/或，柱温为25-35℃；

和/或，流速为0.7-1.2mL/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括每次检测后对SB-aq色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：第1-7分钟，100％水；第8分钟，95vol％水+5vol％的甲醇或乙腈；第9-45分钟，线性变为100％的甲醇或乙腈，第45-52分钟，保持为100％的甲醇或乙腈，第53分钟变为100％的水，保持至60分钟结束；

或者，梯度洗脱的程序为：第1-7分钟，100％水；第8分钟，95vol％水+5vol％的甲醇或乙腈；第9-40分钟，线性变为100％的甲醇或乙腈，第40-45分钟，保持为100％的甲醇或乙腈，第46分钟变为100％的水，保持至52分钟结束；

或者，梯度洗脱的程序为：第1-8分钟，100％水；第9-20分钟，40vol％水+60vol％的甲醇或乙腈；第21-24分钟，线性变为100％的甲醇或乙腈，第24-30分钟，保持为100％的甲醇或乙腈，第31分钟变为100％的水，保持至38分钟结束。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，使用酸碱调节剂调节流动相的pH值，所述酸碱调节剂选自乙酸、磷酸、硼酸、甲酸、氨水和三乙胺中的至少一种。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，SB-aq色谱柱为Agilent ZORBAXSB-aq色谱柱。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品为蕈菌发酵后得到的菌丝体的含水浸提液。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括计算高压液相色谱分析所得图谱上第5-6分钟所对应的峰面积，以对所述待测样品中的麦角硫因进行定量。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，对所述待测样品中的麦角硫因进行定量的方法包括：

(1)制备含不同浓度的麦角硫因对照品溶液；

(2)对含不同浓度的麦角硫因对照品溶液分别采用SB-aq色谱柱进行高压液相色谱检测；

(3)根据麦角硫因对照品溶液的浓度和峰面积绘制标准曲线；

(4)根据标准曲线和高压液相色谱检测得到的峰面积，对待测样品中的麦角硫因进行定量。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品中的麦角硫因含量为0.045μg/L至1000mg/L。