CN110016465A - 一种包含b细胞及肿瘤双识别性t细胞的免疫细胞药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种将靶向B细胞的嵌合抗原受体(B‑CAR)跨膜表达在包括TIL、neoantigen反应性T细胞等肿瘤识别性T细胞上，制备包含“B细胞&肿瘤——双识别性T细胞”的免疫细胞治疗药物，借助该药物的B‑CAR结构在体内通过对正常B细胞的识别，实现对“B细胞&肿瘤——双识别性T细胞”的体内刺激并大幅扩增，从而解决肿瘤识别性T细胞的数量瓶颈问题。本发明可成为一种免疫细胞药物应用于不区分癌种的抗肿瘤治疗中。

Description

一种包含B细胞及肿瘤双识别性T细胞的免疫细胞药物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言本发明提供一种免疫细胞治疗药物，这种细胞药物解决了肿瘤识别性T细胞的数量瓶颈难题。
背景技术
T细胞是肿瘤免疫治疗的主力军，肿瘤免疫治疗的疗效在很大程度上取决于能识别肿瘤的T细胞的数量的多少。目前已经有多种技术手段来收集肿瘤识别性T细胞，包括从肿瘤组织中分离肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)，或者通过高通量测序获得肿瘤新抗原(neoantigen)从而在筛选出来neoantigen反应性T细胞，等等。
一般情况下，晚期肿瘤患者体内的天然存在的能特异识别肿瘤的、且可采集到的T细胞——无论是来自TIL或是neoantigen反应性T细胞，其总数量与肿瘤细胞总量相比，都是很少的，有可能相差4个数量级(万倍)以上。
另一方面，无论是neoantigen反应性T细胞，还是TIL，在体外都不可能无限扩增，而且反复刺激扩增容易使T细胞状态过早进入耗竭状态，从而严重影响其治疗效果，这一点对于TIL尤甚。
因此无论是TIL或新抗原疗法，都面临肿瘤识别性T细胞数量局限问题，这对于这类肿瘤免疫疗法是非常严重的瓶颈问题和困扰。
另一方面，来自对治B细胞血液肿瘤的大量CD19 CAR-T的临床研究数据表明，靶向CD19、CD20、CD22等B细胞普遍表达的抗原的CAR-T细胞，可以在体内大量扩增。由此可见，借助患者体内广泛的海量的B细胞的类似疫苗的环境，靶向B细胞的CAR的T细胞的可在体内大量扩增。
发明内容
上述CAR-T的临床研究的目的是为治疗B细胞血液肿瘤，本发明的实质是将B细胞对 CAR-T的大幅扩增的效应，作为肿瘤识别性T细胞的辅助扩增体系，应用于实体瘤的治疗中。
本发明通过将靶向B细胞的CAR表达在肿瘤识别性T细胞上，制备“B细胞&肿瘤——双识别性T细胞”，解决了这一瓶颈问题。
首先双识别性T细胞的前提是这类T细胞是有肿瘤特异识别性的，这是本发明的基础条件，即先要收集患者的肿瘤识别性T细胞，再做靶向B细胞的CAR的基因改造。
基因改造可以通过慢病毒等体系来实现。转入CAR的肿瘤识别性T细胞即为“B细胞& 肿瘤——双识别性T细胞”。
这类T细胞之所以被称为双识别性，是因为这类T细胞既可通过识别肿瘤新抗原而启动对肿瘤的杀伤，又可以通过识别B细胞而启动对正常B细胞的杀伤。在杀伤B细胞的同时，这类肿瘤识别性T细胞即在体内大量扩增，从而得以更有效的杀伤肿瘤细胞。
本发明应用于临床唯一的风险是这类双识别性T细胞药物有可能杀伤正常B细胞，导致患者体液免疫功能缺陷，但这一风险是有限的：首先当体内不再需要双识别性T细胞的时候，可以通过利用CAR结构中的表达调控或自杀开关元件的设计，清除双识别性T细胞，从而终止其对B细胞的杀伤；患者可以通过外源性补充免疫球蛋白而弥补这一缺陷，而且大多患者可在2～12个月内恢复B细胞的再生；另一方面，与威胁生命的肿瘤疾病相比，两害相权取其轻，B细胞被清除的风险可以被暂时忽略，正如CAR-T技术在B细胞血液肿瘤治疗中被广泛应用的情形。
附图表说明：
图1.BCAR在TCR-T，TIL及NeoT中的表达。
图2.BCAR在靶向NY ES01基因的TCR-T的体外功能试验及扩增。
图3.BCAR在TIL的体外功能试验及扩增。
图4.BCAR在NeoT的体外功能试验及扩增。
图5.BCAR-NY ES01-TCRT细胞在动物实验中的肿瘤负荷变化。
图6.BCAR-TIL细胞在动物实验中的肿瘤负荷变化。
图7.BCAR-NeoT细胞在动物实验中的肿瘤负荷变化。
具体实施方式
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例一、肿瘤识别性T细胞——靶向肿瘤靶点NY-ESO-1的TCR-T细胞的制备
本实施例用靶向肿瘤靶点NY-ESO-1的TCR-T细胞模拟单靶点的新抗原反应性T细胞。
静脉采集健康人30ml外周血，，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，贴壁2小时，取悬浮细胞-主要是T细胞。加入识别NY-ESO-1的TCR慢病毒载体(HLA-A：0201)，按照 MOI(慢病毒数目/细胞数)＝5加入慢病毒，培养72h，流式分选出TCR表达阳性的TCR-T细胞，流式检测TCR阳性率在95％以上。
实施例二、肿瘤识别性T细胞——肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)的制备
取患者肿瘤组织10克或以上，用酶消化法分离出肿瘤组织的细胞，并用CD3磁珠分离纯化出CD3阳性的T细胞，其余细胞贴壁培养获得患者自体的肿瘤细胞。
实施例三、肿瘤识别性T细胞——neoantigen反应性T细胞(neoT)的制备
首先，抽取患者外周血或手术切除的肿瘤组织进行全外显子或RNA转录组测序；选取突变位点，并结合患者HLA分型进行亲和肽预测，选取约20个突变作为Neoantigen。基因合成该Neoantigen，并体外转录成RNA；再次，单采或是直接抽取患者外周血，分离出PBMC并贴壁2小时，取贴壁单核细胞，加入相关细胞因子促进DC细胞分化成熟，并电转RNA进入细胞；取悬浮细胞，主要为T细胞，与电转的DC细胞共培养，分离CD137+阳性的T细胞得到新抗原反应性T细胞(以下或简称neoT)，并扩增该细胞。
实施例四、靶向B细胞的CAR(以下或简称BCAR)的慢病毒载体的制备
选取CD19作为BCAR的靶标，构建CD19 CAR，代表BCAR。
CD19 CAR慢病毒载体，采用更安全的第四代慢病毒载体系统。将主载体CD19 CAR，及包装载体pMDL-gag，Rev，包膜载体pMD2.G，采用磷酸钙或是脂质体PEI共转染293T细胞，48小时收集上清，并进行超速离心浓缩慢病毒。
CD19 CAR慢病毒载体的滴度检测，采用3倍倍比稀释，取50ul感染293T细胞，感染48小时至72小时，收集293T细胞进行CAR染色，流式分析CAR+细胞的比例，并按照公式进行滴度计算：
滴度(TU/ml)＝起始293T细胞数×CAR+细胞百分比×稀释倍数×20(取第一个PD1+细胞百分比＜20％进行计算)，计算慢病毒滴度＞3×107可进行下一步使用。
实施例五、BCAR在前述肿瘤识别性T细胞的转染
根据制备的CD19 CAR慢病毒滴度，按照MOI＝5，将慢病毒加入前述三种新抗原识别性T细胞(即NY-ESO-1-TCR-T，TIL，neoT)中，分别得到BCAR-NY-ESO-1-TCR-T，BCAR-TIL，BCAR-neoT，流式检测的结果显示，BCAR在三种肿瘤抗原识别性T细胞都有约60％的表达(图1)，分别培养并扩增三种T细胞。
实施例六、表达BCAR的NY-ESO1 TCR-T细胞的体外功能试验
为了验证BCAR在靶向NY-ESO-1的TCR-T中的作用，我们首先构建了HLA分型为 A：0201的J82-NY ESO1-Luc的肿瘤细胞系。为了验证BCAR-NY ESO1-TCRT的双识别性功能，我们首先在24孔板接种1×105数量的J82-NY ESO1肿瘤细胞，过夜贴壁后，分成4组进行实验，对照组A组加入2×105数量的T细胞共培养；B组加入2×105数量的BCAR-T(CAR 的阳性率为60％)共培养；C组加入2×105数量的NY-ESO1 TCR-T共培养；D组加入2×105数量的BCAR-NY-ESO1 TCR-T共培养；同时，这四组细胞都加入5×104的B细胞，分别检测：
1、T细胞的扩增情况。共培养48h，96h，分别对T细胞进行计数，如图2a所示，经过 4天的共培养，A组T细胞扩增3倍左右；B组BCAR-T扩增约12倍；C组NY ESO1-TCRT 扩增约10倍；而D组BCAR-NY ESO1-TCRT扩增最多，达到27倍。体外实验的结果表明，在B细胞的刺激环境下，TCR-T在转染CD19 CAR后，数量可以得到大幅扩增。
2、肿瘤细胞的生长情况。共培养48h和96h后，去掉上清液，PBS漂洗3次，裂解贴壁的肿瘤细胞，采用试剂盒测定荧光素酶的活性来指示肿瘤细胞的存活率。图2b共培养48h的体外实验结果提示，在B细胞的刺激环境下，TCR-T在转染BCAR后，杀伤肿瘤的能力明显提高。
实施例七、表达BCAR的的TIL的体外功能试验
为了验证CD19 CAR在TIL中的作用，我们首先将从患者新鲜肿瘤组织分离的肿瘤细胞接种到24孔板，过夜贴壁后，分别加入TIL和BCAR-TIL共培养，同时所有的分孔中都加入相同数量的B细胞并进行检测：
1、T细胞的数量对比。与肿瘤细胞共培养96h，如图3a所示，TIL扩增了约10倍，而BCAR-TIL扩增约25倍。体外实验的结果表明，在B细胞的刺激环境下，TIL在转染CD19 CAR后，数量可以得到大幅扩增。
2、肿瘤细胞的生长情况。共培养96h后，去掉上清液，PBS漂洗3次，裂解贴壁的肿瘤细胞，采用试剂盒测定荧光素酶的活性来指示肿瘤细胞的存活率。图3b的体外实验结果表明，在B细胞的刺激环境下，TIL在转染BCAR后，杀伤肿瘤的能力明显提高。
实施例八、表达BCAR的的新抗原反应性T细胞的体外功能实验
为了验证CD19 CAR在NeoT中的作用，我们首先将从患者新鲜肿瘤组织分离的肿瘤细胞接种到24孔板，过夜贴壁后，分别加入NeoT和BCAR-NeoT共培养，同时所有的分孔中都加入相同数量的B细胞并进行检测：
1、T细胞的数量对比。与肿瘤细胞共培养96h，如图4a所示，_NeoT扩增了约9倍，而BCAR-NeoT扩增约23倍。体外实验的结果表明，在B细胞的刺激环境下，NeoT在转染 CD19CAR后，数量可以得到大幅扩增。
2、肿瘤细胞的生长情况。共培养96h后，去掉上清液，PBS漂洗3次，裂解贴壁的肿瘤细胞，采用试剂盒测定荧光素酶的活性来指示肿瘤细胞的存活率。图4b的体外实验结果表明，在B细胞的刺激环境下，NeoT在转染BCAR后，杀伤肿瘤的能力明显提高。
实施例九、表达B CAR的NY-ESO-1 TCR-T细胞的动物实验
动物模型构建：将1×106数量的肿瘤细胞J82-NY-ESO-1皮下接种到NSG小鼠体内，空白对照组皮下注射PBS(A0)，注射肿瘤细胞的小鼠，大约两周后开始成瘤，第23天测量肿瘤大小，并选取30只老鼠入组。
给药：空白对照组(A0)尾静脉注射PBS，接种肿瘤细胞的小鼠分成6组，分别为：PBS组 (A1)；T细胞组(A2)；BCAR-T细胞组(A3)；NY-ESO-1 TCR-T细胞组(A4)；BCAR&NY-ESO-1TCRT双识别性T细胞组(A5)；NY-ESO-1 TCR-T细胞高剂量组(A6)。给药方式：A1-5组均为1×104个T细胞尾静脉静脉输注，A6组为1×107个T细胞尾静脉输注，所有组均输注1×107个B细胞。
给药后，每2-3天进行肿瘤大小的测量及小鼠状态观察，肿瘤体积＝1/2*长径*短径*短径，持续观察28天。
一、肿瘤负荷变化：
荷瘤小鼠在给药后的一周，肿瘤体积持续增长，第7天，检测到A4、A5和A6组肿瘤开始缩小，但A4组肿瘤缩小幅度不明显，并在第11天开始反弹并继续生长，A6组有明显缩小，但在第16天开始反弹；而A5组持续缩小至几近消失，第23天肿瘤才开始反弹。其他三组肿瘤均保持自然生长(图5)。
二、输注的T细胞在体内的总量变化：
在给药的四个组，给药之后第10天，从2、3、4、5组抽取外周血，使用流式方法检测CD3进行估计T细胞的总量，其结果分别为2.11×105，1.91×107，1.52×106，5×107，提示带BCAR的A3、A5组所获得的T细胞总量远远超过A4组，表明BCAR-T细胞以及B细胞& 肿瘤——双识别性T细胞可以在体内大幅扩增。
实施例十、表达BCAR的TIL细胞的动物实验
动物模型构建：将分离自新鲜肿瘤组织的1×106数量的肿瘤细胞皮下接种到NSG小鼠体内，空白对照组皮下注射PBS(A0)，注射肿瘤细胞的小鼠，大约两周后开始成瘤，第25天测量肿瘤大小，并选取30只老鼠入组。
给药：空白对照组(A0)尾静脉注射PBS，接种肿瘤细胞的小鼠分成5组，分别为：不给药 -PBS组(A1)；T细胞组(A2)；BCAR-T细胞组(A3)；TIL细胞组(A4)；BCAR-TIL 细胞组(A5)。给药方式：A1～5组均为1×104个T细胞尾静脉输注，所有组均输注1×107个 B细胞。给药后，每2-3天进行肿瘤大小的测量及小鼠状态观察，肿瘤体积＝1/2*长径*短径* 短径，持续观察28天。
一、肿瘤负荷变化：
荷瘤小鼠在给药后的一周，肿瘤体积持续增长，第6天，检测到A4、A5组肿瘤开始缩小，但A4组肿瘤缩小幅度不明显，并在第14天开始反弹并继续生长，A5组持续缩小至几近消失，第21天肿瘤才开始反弹。其他三组肿瘤均保持自然生长(图6)。
二、输注的T细胞在体内的总量变化：
在给药的四个组，给药之后第10天，从2、3、4、5组抽取外周血，使用流式方法检测CD3进行估计T细胞的总量。其结果分别为1.87×105，1.57×107，9.52×106，3×107，提示带BCAR的A3、A5组所获得的T细胞总量远远超过A4组，表明BCAR-T细胞以及B细胞& 肿瘤——双识别性T细胞可以在体内大幅扩增。
实施例十、表达BCAR的新抗原反应性T细胞的动物实验
动物模型构建：将分离自新鲜肿瘤组织的1×106肿瘤细胞皮下接种到NSG小鼠体内，空白对照组皮下注射PBS(A0)，注射肿瘤细胞的小鼠，大约两周后开始成瘤，第23天测量肿瘤大小，并选取30只老鼠入组。
给药：空白对照组(A0)尾静脉注射PBS，接种肿瘤细胞的小鼠分成6组，分别为：不给药-PBS组(A1)；T细胞组(A2)；BCAR-T细胞组(A3)；普通neoT细胞组(A4)；BCAR-neoT 双识别性T细胞组(A5)；普通neoT细胞高剂量组(A6)。给药方式：A1～5组均为1×104个 T细胞尾静脉静脉输注，A6组为1×107个T细胞尾静脉输注，所有组均输注1×107个B细胞。
给药后，每2-3天进行肿瘤大小的测量及小鼠状态观察，肿瘤体积＝1/2*长径*短径*短径，持续观察28天。
一、肿瘤负荷变化：
荷瘤小鼠在给药后的一周，肿瘤体积持续增长，第9天，检测到A4、A5和A6组肿瘤开始缩小，但A4组第11天反弹，A6组在第18天开始反弹；而A5组持续缩小至几近消失，第23天肿瘤才开始反弹。其他三组肿瘤均保持自然生长(图7)。
二、输注的T细胞在体内的总量变化：
在给药的四个组，给药之后第10天，从2、3、4、5组抽取外周血，使用流式方法检测CD3进行估计T细胞的总量。其结果分别为1.65×105，1.23×107，1，02×107，3.15×107，提示带BCAR的A3、A5组所获得的T细胞总量远远超过A4组，表明BCAR-T细胞以及B细胞 &肿瘤——双识别性T细胞可以在体内大幅扩增。
上述B细胞&肿瘤——双识别性T细胞的动物实验表明：
1.B细胞&肿瘤——双识别性T细胞可以借助B细胞刺激实现大幅扩增。
A6组双识别性T细胞可以在体内大幅扩增，达到和CAR-T细胞相同数量级的数量。
2.同样是小剂量回输，B细胞&肿瘤——双识别性T细胞可以取得更好的疗效。
A5组双识别性T细胞在体内大幅扩增后，可以起到明显增强肿瘤特异杀伤的效果，效果远超小剂量回输的肿瘤识别性T细胞组，堪比大剂量肿瘤识别性T细胞组甚至可能更强。
数据表明，B细胞&肿瘤——双识别性T细胞可在小鼠体内扩增迅速并实现明显肿瘤抑制效果，无论是扩增效果还是疗效上，都远超给予同样小剂量给予肿瘤识别性T细胞组。

Claims (5)

1.一种免疫细胞制备方法，制备“B细胞&肿瘤——双识别性T细胞”，其特征在于：
1)将靶向B细胞表面蛋白的嵌合抗原受体(以下或简称“B-CAR”或“BCAR”)表达在肿瘤识别性T细胞；
2)所述靶向B细胞表面蛋白的嵌合抗原受体(B-CAR)包括以下特征：
A.B细胞表面蛋白包括CD19、CD20、CD22以及其他任何B细胞广泛表达的膜蛋白：
B.所述B-CAR结构包括CD3ζ和靶向上述B细胞表面蛋白的抗体的可变区；
C.所述B-CAR结构可以包括CD28、41BB在内的共刺激分子以及其他基因或蛋白修饰，也可以不包括这些共刺激分子以及其他基因或蛋白修饰；
D.所述B-CAR结构可以包括或不包括TET-ON或其他任何一种CAR或CAR-T细胞表达调控以及令CAR-T细胞自杀或凋亡的开关的元件；
E.所述B-CAR结构包含或不包含靶向CD19的抗体可变区，其序列如序列表SEQ ID NO：1所显示
3)所述肿瘤识别性T细胞可以是由以下ABC任意一种方法获得的多种TCR序列的克隆的T细胞混合物，或经过分组筛选或高通量筛选后的单种或多种TCR序列的克隆的T细胞：
A.从肿瘤组织中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)而得，或进行或不进行对TIL的进一步扩增、改造或以包括但不限于PD1、CD137、TIM3等任意一种或几种分子为标志物的筛选；
B.对外周血中的T细胞进行PD1、CD137、TIM3等一种或几种标志物进行筛选而得，或进行或不进行对其进一步扩增或改造；
C.经肿瘤基因测序分析体细胞突变得到肿瘤新抗原(neoantigen)，并通过任意方法，获得肿瘤识别性T细胞而得，以及将单种克隆的肿瘤识别性T细胞的TCR序列加工到普通T细胞而得，所述基因测序的样本来源包括对肿瘤组织和ctDNA以及外泌体等任意一种能获得肿瘤特征性变异的测序样本来源，测序方法包括定制Panel、全外显子测序、全转录组测序、免疫组库测序等任意一种能获得肿瘤特征变异的测序策略及方法。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述B-CAR或免疫检查点-共刺激因子转换分子在所述B细胞&肿瘤——双识别性T细胞或肿瘤识别性T细胞的表达，可以由以下任意一种或多种方法实现：
1)运用慢病毒或腺病毒或腺相关病毒等任意一种可将所述B-CAR或免疫检查点-共刺激因子转换分子转染在所述肿瘤识别性T细胞基因组的并稳定表达的转染载体或媒介及方法或系统而实现；
2)将所述B-CAR或免疫检查点-共刺激因子转换分子的mRNA序列电击转染进入所述肿瘤识别性T细胞内而实现。
3.一种免疫细胞治疗药物或药物组合，其特征在于，在所述药物或药物组合研发、生产、制备、应用的任意一个过程中使用了权利要求1或2中所述的免疫细胞制备方法，或对使用权利要求1或2中所述方法制备出的细胞进行扩增或进行其他实验方法的加工处理，及其在治疗药物、治疗方法的任意一种衍生应用。
4.如权利要求3所述的免疫细胞治疗药物或药物组合，其特征在于，所述药物或药物组合在任意癌种或病种、任意肿瘤分期的抗肿瘤治疗中的应用。
5.如权利要求3所述的细胞治疗药物或药物组合，其特征在于，在其应用于肿瘤治疗的机制上，一方面借助所述细胞药物或药物组合对肿瘤的特异识别而杀伤肿瘤细胞，另一方面借助所述细胞药物或药物组合中的“B细胞&肿瘤——双识别性T细胞”对B细胞的识别，使得“B细胞&肿瘤——双识别性T细胞”受到B细胞的刺激而扩增，从而增强所述细胞药物或药物组合对肿瘤的杀伤功能。
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