CN1100149C - 马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法,本发明是利用Taq酶在PCR扩增体系内将类病毒RNA反转录为cDNA,同时完成cDNA扩增,用琼脂糖电泳检测扩增产物,判断病毒的有无。本发明检测速度快,可同时检测数十个样品;灵敏度高,可检测到纳克级的病毒RNA;特异性强,由于引物的特异性,只能特异性地扩增病毒cDNA;廉价,Taq的价格远远低于反转录酶。
Description
所属技术领域
本发明属于马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法。
背景技术
马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)没有蛋白质外壳<瞿峰,田波:病毒学报,9:288,1993>,它的检测,不能用检测一般病毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法<郑光宇,Wichai等:病毒学报,4:150,1988>。目前普遍采用往复电泳(Return-PAGE)方法检测<陈炜,田波:微生物通报,1(3):132,1985>,其灵敏度和简便性都略显不足。多聚酶链反应(PCR)技术在病毒检测方面具有廉价、快速、灵敏、特异性强等优点<陈枝楠等:植物病理学报,27(3):198,1997>。PSTVd是一种RNA病毒,RNA不能直接通过PCR扩增,首先要反转录为cDNA,以cDNA为模板进行扩增<A.M.Shamloul,et al.Canadian Journal of Plant Pathology,1997,19:89-96>。用传统方法检测,全部过程由两部分构成:在反转录酶催化下,将RNA反转录为cDNA,再在Taq聚合酶催化下完成cDNA的扩增,通过检测cDNA,判断PSTVd的存在<何小源等:中国病毒学,7:362,1992,何小源,周广和:病毒学报,8:337,1992>。既使如此,两步法在PSTVd的检测中也尚未得到应用。
马铃薯生产是我国仅次于小麦、水稻和玉米的第四大作物。由于马铃薯的优良品质,今后在我国还会有更大的发展。脱毒种薯是马铃薯生产的重要环节,其中PSTVd的检测是检验马铃薯脱毒效果的重要指标。目前的检测方法已不能满足未来生产的需要,迫切需要快速、灵敏的方法取代现有技术。
发明内容
本发明目的是提供一种马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法,本发明是利用Taq酶在PCR扩增体系内将类病毒RNA反转录为cDNA,同时完成cDNA扩增,用琼脂糖电泳检测扩增产物,判断病毒的有无,具有特异性强、灵敏度高(可检测纳克级PSTVd病毒)、耗时短(4-5hr)、价格低(3-5RMB/assay)等特点。
本发明包括病毒RNA的提取、PCR引物的设计、应用Taq酶将病毒RNA反转录为cDNA同时完成PCR扩增和cDNA的检测。
本发明具体步骤详细描述如下:
1、病毒RNA的提取:a.组织破碎:取染毒马铃薯组织(包括植株体及果实),加RNA抽提缓冲液(Tris 0.1M,NaCl 0.1M,HCl 0.075M,EDTA 0.01M,pH 7.0,3-5ml/每克马铃薯组织),加入石英砂(0.01-0.05g/每克马铃薯组织),在液氮中研磨碎;b.抽提蛋白:用2倍体积水饱和酚和2倍体积氯仿∶异戊醇(49∶1)抽提,冰浴10-15min;10,000-15,000rpm,4℃,离心15-20min;吸取上清液;c.沉淀并收集病毒核酸:用3倍体积冷无水乙醇和0.25倍体积NaAC(4M),-20℃沉淀20-30min。10,000-15,000rpm,4℃,离心15-20min,弃掉上清液;重复此述步骤1次;d.漂洗并溶解病毒核酸:用乙醇溶液漂洗沉淀1-2次,气干乙醇,用ddH2O溶解。
2、PCR引物设计:根据GenBank上PSTVd的全序列,在计算机辅助下,利用通用软件Oligo和Primer,根据内稳定性、变性温度及错配情况设计出引物P1、P2;P1:5’-GAAACCTGGAGCGAACTG-3’,P2:5’-CGGTTCCAAGGGCTAAAC-3’。
3、PCR扩增:取第一步粗提马铃薯核酸液,引物P1(0.5Pmol/每微升反应体系),P2(0.5Pmol/每微升反应体系),10×缓冲溶液(100mM Tris-HCl[pH 8.8],500mMKCl,0.8%Nonidet P40[购于Sangon公司]),MgCl2(1.2-1.5mM),dNTP mix(0.2mM),Taq酶(0.25U/每微升反应体系);在下述条件下进行PCR:72℃ 6min 40sec→94℃ 1min,37℃2min,72℃ 1min,10-20个循环→72℃ 5min→94℃ 1min,59℃ 30sec,72℃ 1min,35-40个循环。
4、检测:产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
本发明与传统的RT-PCR反应相比,该方法具有特异性强(只能特异性地扩增病毒cDNA)、灵敏度高(可检测纳克级PSTVd病毒)、耗时短(检测速度快,可同时检测数十个样品,4-5hr)、价格低(3-5RMB/assay,Taq的价格远远低于反转录酶)等特点。
附图说明
图一是PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳检测结果。
图二是四种处理在2%琼脂糖凝胶中电泳检测结果。
具体实施方式
本发明突出的实质性特点和显著效果可以从下述的实施例得以体现,但它们不是对本发明作任何限制。
实施例:
取新鲜染毒马铃薯叶子(津引薯9号)1g,加RNA抽提缓冲液5ml,加入少许石英砂,在液氮中研磨成粉状。用2倍体积水饱和酚和2倍体积氯仿∶异戊醇(49∶1)抽提,冰浴15min。10,000rpm,4℃,离心20min,吸取上清液。用3倍体积冷无水乙醇和0.25倍体积NaAC(4M),-20℃沉淀30min。12,000rpm,4℃,离心20min。重复上述步骤1次。用70%乙醇漂洗2次。气干乙醇,用适量ddH2O溶解。
PCR引物设计:根据GenBank上PSTVd的全序列,在计算机辅助下设计出引物P1、P2:P1:5’-GAAACCTGGAGCGAACTG-3’,P2:5’-CGGTTCCAAGGGCTAAAC-3’。
PCR扩增:(反应体系20μl)取粗提马铃薯核酸液1μl,引物P1 10 Pmol,P2 10Pmol,10×Buffer 2μl,MgCl2(25mM)1.6μl,dNTP mix(10mM)0.4μl,Taq酶5U,ddH2O11.75μl;如下条件做PCR:72℃ 6min 40sec→94℃ 1min,37℃ 2min,72℃ 1min,10个循环→72℃ 5min→94℃ 1min,59℃ 30sec,72℃ 1min,35个循环。检测:产物在2%Agrose中进行电泳检测,见图一。图中第一条泳道显示的是分子量marker,第二条泳道显示的是用本方法扩增出来的PSTVd的产物。
通过与正对照和负对照比较,判断有病毒PSTVd。
对比实施例一:
通过比较传统的RT-PCR和本技术的电泳照片可以发现,一步法RT-PCR扩增产物的大小与传统的RT-PCR扩增产物是一致的,且电泳带的亮度相近。
对比实施例二:利用PSTVd序列中HaeIII的单酶切位点酶切和嵌套式PCR验证,均表明一步法RT-PCR所检测到的正是PSTVd病毒。此结果见图二,其中第一条泳道显示的是分子量marker,第二条泳道显示的是用本方法扩增出来的PSTVd的产物,第三条泳道显示的是嵌套式PCR反应结果,第四条泳道显示的是嵌套式PCR产物酶切反应结果。
另外,用RNase(无DNase)处理过的染毒马铃薯RNA样品做RT-PCR,所得到的结果呈阴性。表明本方法扩增得到的产物是来自病毒RNA,而不是马铃薯DNA。
Claims (2)
1.一种马铃薯锤块茎类病毒的检测方法,其特征在于它包括如下步骤:
(1)、取染毒马铃薯组织,加入3-5ml/每克马铃薯组织,含有Tris、NaCl、HCl和EDTA的pH7.0的RNA抽提缓冲液及石英砂,在液氮中磨碎;根据计量体积数,用2倍体积水饱和酚和2倍体积的氯仿∶异戊醇抽提,其中氯仿∶异戊醇的体积比为49∶1,冰浴10-15分钟;10,000-15,000rpm,4℃,离心15-20分钟,吸取上清液;用3倍体积冷无水乙醇和0.25倍体积4M的NaAC,-20℃下沉淀20-30分钟,10,000-15,000rpm,4℃,离心15-20分钟,弃掉上清液,重复此步骤1次;用乙醇溶液漂洗沉淀1-2次;气干乙醇,用水溶解,得到病毒RNA的提取液;
(2)、根据GenBank上PSTVd的全序列,设计出PCR引物P1、P2;P1:5’GAAACCTGGAGGGAACTG-3’,P2:5’-CGGTTCCAAGGGCTAAAC-3’;
(3)、取第一步粗提马铃薯核酸液,引物P1 0.5Pmol/每微升反应体系,P20.5Pmol/每微升反应体系,10×缓冲溶液,其成份为:pH8.8的100mM Tris-HCl、500mMKCl、0.8%NonidetP40和1.2-1.5mM MgCl2;0.2mM dNTP mix,0.25U/每微升反应体系Taq酶;在下述条件下进行PCR扩增:72℃ 6分钟40秒→94℃1分钟,37℃ 2分钟,72℃1分钟,10-20个循环→72℃5分钟→94℃1分钟,59℃30秒,72℃1分钟,35-40个循环。
(4)、产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
2.权利要求1所说的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测方法,其特征在于所说的抽提缓冲液是Tris 0.1M,NaCl 0.1M,HCl 0.075M,EDTA0.01M;所说的石英砂用量是0.01-0.05g/每克马铃薯组织。
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