CN110012910A - 抑制超长链脂肪酸合成的化合物在病原菌防治中的应用以及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制超长链脂肪酸合成的化合物在病原菌防治中的应用以及方法，涉及植物病理学和植物病害防治技术领域。本发明公开了抑制超长链脂肪酸合成的化合物在防治病原菌中的应用。本发明的研究结果显示，以超长链脂肪酸的合成为靶点，通过使用抑制超长链脂肪酸合成的化合物，可以对病原菌产生抑制作用。由此说明，抑制超长链脂肪酸合成的化合物可以用于到病原菌病害的防治中，为防治病原菌病害提供了一种新的思路或策略，也为病原菌病害的防治药物的类别提供了更多的选择性。

Description

抑制超长链脂肪酸合成的化合物在病原菌防治中的应用以及 方法
技术领域
本发明涉及植物病理学和植物病害防治技术领域，具体而言，涉及抑制超长链脂肪酸合成的化合物在病原菌防治中的应用以及方法。
背景技术
植物病害在世界范围内严重危害粮食生产和人类健康。例如，被称为“水稻癌症”的稻瘟病严重威胁水稻的产量及品质，该病在世界范围稻区均有发生，严重时能使水稻减产40％～50％甚至绝收；除了危害水稻之外，稻瘟病还可以使小麦和大麦等多种重要作物致病。为了保障粮食生产安全、人类和生态健康，迫切需要开发防治病害的方法及策略。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供抑制超长链脂肪酸合成的化合物在病原菌防治中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种预防或治疗植物受病原菌感染的方法。
本发明是这样实现的：
化学药物防治是防治病原菌的主要方法。传统的抗菌药物的靶点主要包括细胞壁合成相关的重要酶类、细胞膜中甾醇与鞘磷脂等关键成分的合成酶类、微管蛋白组装、支链氨基酸合成相关酶、蛋白质与核酸的合成机器等。病原菌作为微生物，具有易变异、繁殖快和适应性强的特点，长期使用单一抗菌药物，易使病原菌累积抗药性，导致防效下降。开发利用重要的药物靶点，设计与筛选新型抗菌药剂，对病原菌的综合防治具有重要的理论意义和应用价值。
超长链脂肪酸是一类重要的脂类，它在某些植物(例如禾本科杂草、宽叶杂草等)生长发育过程中发挥重要功能。鉴于超长链脂肪酸对于某些植物生长发育的重要性，其合成途径已作为一类重要的除草剂靶标，广泛用于防治水稻、小麦、玉米等作物生产时的田间杂草。针对超长链脂肪酸生物合成的除草剂种类众多，例如包括硫代氨基甲酸酯类除草剂环草丹(Molinate)、燕麦敌(Diallate)、克草丹(Pebulate)、异丁草丹(Butylate)、硫烯草丹(Sulfallate)和野燕畏(Triallate)等，以及酰胺类除草剂吡草胺(Metazachlor)、丁草胺(Butachlor)，毒草胺 (Propachlor)、唑草胺(Cafenstrole)、噻唑草酰胺(Flufenacet)、乙草胺 (Acetochlor)、异丙草胺(Metolachlor)等。
靶向超长链脂肪酸的除草剂在防治禾本科杂草和宽叶杂草方面发挥了重要作用，然而本发明的研究结果显示，以超长链脂肪酸的合成为靶点，通过使用抑制超长链脂肪酸合成的化合物例如常见的除草剂，能够实现对病原菌的防治作用。由此说明，抑制超长链脂肪酸合成的化合物可以作为抗菌剂，用于到病原菌的防治中，为防治植物病害例如病原菌感染提供了一种新的思路或策略，也为植物病害的防治药物的类别提供了更多的选择性。
基于此，一方面，本发明提供了抑制超长链脂肪酸合成的化合物在防治病原菌中的应用。
本发明的研究结果显示，抑制超长链脂肪酸合成的化合物能通过抑制病原菌超长链脂肪酸的合成，使病原菌侵染寄主表皮时侵染钉的形成受阻，进而破坏病原菌的致病性，起到防治病害的效果。因此，抑制超长链脂肪酸合成的化合物可以用于病原菌的预防或治疗。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述超长链脂肪酸为碳链长度为20个碳原子以上的脂肪酸。
本发明的研究进一步发现，碳链长度为20个碳原子以上的脂肪酸对病原菌的致病性有重要影响，通过抑制病原菌体内的20个碳原子以上的脂肪酸的合成，降低其致病性，起到抑制病原菌的效果。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述化合物为硫代氨基甲酸酯类化合物或酰胺类化合物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述硫代氨基甲酸酯类化合物选自环草丹、燕麦敌、克草丹、异丁草丹、硫烯草丹和野燕畏中的任意一种或其组合或几种的组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述酰胺类化合物选自吡草胺、丁草胺，毒草胺、唑草胺、噻唑草酰胺、乙草胺和异丙草胺中的任意一种或其组合或几种的组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述病原菌为病原真菌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述病原真菌为植物病原真菌或动物病原真菌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述植物病原真菌为稻瘟病菌、小斑病菌或白粉病菌；
优选的，所述动物病原真菌为绿僵菌。
另一方面，本发明提供了一种防治病原菌的方法，其包括：向待防治对象施用具有抑制超长链脂肪酸合成特性的化合物；
优选的，所述超长链脂肪酸为碳链长度为20个碳原子以上的脂肪酸。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述化合物为硫代氨基甲酸酯类化合物或酰胺类化合物；
优选的，所述硫代氨基甲酸酯类化合物选自环草丹、燕麦敌、克草丹、异丁草丹、硫烯草丹和野燕畏中的任意一种或几种的组合；
优选的，所述酰胺类化合物选自吡草胺、丁草胺，毒草胺、唑草胺、噻唑草酰胺、乙草胺和异丙草胺中的任意一种或几种的组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述病原菌为病原真菌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述病原真菌为稻瘟病菌、小斑病菌或白粉病菌；
优选的，所述植物为水稻、玉米或小麦。优选的，所述化合物的有效防治剂量为：每100m2的目标区域，对应喷施1-2g所述化合物；
优选的，所述化合物以如下方式进行喷施：将1-2g的所述化合物溶解于4mL的二甲基亚砜(DMSO)，再将DMSO溶解的化合物溶于2L水中，所述化合物终浓度为500-1000μmol/L，将水溶液喷施于目标区域。
目标区域是指需要进行真菌防治的栽培有作物的种植区域。
优选的，所述化合物的施用浓度为500μmol/L。
当所述化合物的施用浓度为500μmol/L时，所述化合物对病原真菌致病性的抑制率可达50％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1.靶向超长链脂肪酸合成的药物对水稻稻瘟病菌致病性的影响；
图2.药物抑制稻瘟病菌致病性的坏死斑数量统计；
图3.预防条件下药物抑制稻瘟病菌致病性的坏死斑数量统计；
图4.治疗条件下药物抑制稻瘟病菌致病性的坏死斑数量统计；
图5.药物对玉米小斑病菌致病性的影响；
图6.药物抑制玉米小斑病菌致病性的病斑数量统计；
图7.药物对小麦白粉菌致病性的影响；
图8.药物抑制小麦白粉菌致病性的病情指数；
图9.药物阻碍稻瘟病菌超长链脂肪酸的合成；
图10.超长链脂肪酸合成的药物抑制稻瘟病菌侵染结构的形成；
图11.稻瘟病菌侵染钉形成的定量分析；
图12.基因MoELO敲除突变体的构建示意图；
图13.敲除突变体△Moelo的PCR鉴定；
图14.敲除突变体△Moelo中超长链脂肪酸的定量检测；
图15.敲除突变体△Moelo对水稻的致病性分析；
图16.敲除突变体△Moelo侵染水稻之后病斑数量分析。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
靶向超长链脂肪酸合成的药物对病原真菌致病性的影响
1.1供试超长链脂肪酸除草剂的配置和使用
购买七种代表性超长链脂肪酸合成除草剂药物，用于检测它们对病原真菌致病生长的影响。从Sigma公司购买除草剂成品，包括环草丹、燕麦敌、吡草胺、丁草胺、毒草胺、唑草胺和噻唑草酰胺，各药物对应的产品编号分别为36171、PS507、36155、37887、45637、32430 和31718。使用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，将各药物溶解制备成浓度500mmol/L的母液，-20℃保存待用。
1.2病原真菌的培养
本实验室所用的病原真菌水稻稻瘟病菌菌株为Guy11，采用完全培养基(简称CM)进行培养。玉米小斑病菌菌株为C56，采用马铃薯培养基(简称PDA)培养。白粉菌菌株为B.graminis f.sp.tritici，采用小麦进行活体传种。绿僵菌菌株为CQMa421，采用1/4萨氏葡萄糖培养基(1/4SDA)培养。
上述培养基配制：
(1)CM培养基
D-Glucose(无水葡萄糖)10g，Peptone(蛋白胨)2g，Yeast Extract(酵母提取物)1g，Casamino Acids(酸水解酪蛋白)1g， 20×Nitrate Salts(氮源)50ml，VitaminSolution(维生素)1ml，Trace Elements(微量元素)1ml，加ddH2O(去离子水)至1000ml，并用1mol/L的NaOH(氢氧化钠)溶液调节pH值至6.5。
若配固体培养基，每1000ml培养基中加15g琼脂粉；121℃湿热灭菌20min。
其中，20×Nitrate Salts(氮源)(1000ml)配方为：NaNO3(硝酸钠)120g，KCl(氯化钾)10.4g，MgSO4·7H2O(七水硫酸镁)10.4 g，KH2PO4(磷酸二氢钾)30.4g，加ddH2O(去离子水)至1000ml， 121℃湿热灭菌20min。
Vitamin Solution(维生素)(1000ml)配方为：Biotin(生物素) 0.1g，Pyridoxin(维生素B6)0.1g，Thiamine(维生素B1)0.1g， Riboflavin(核黄素)0.1g，PABA(p-aminobenzoic acid)(对氨基苯甲酸)0.1g，Nicotinic Acid(烟酸)0.1g，加ddH2O至1000ml，过滤除菌，4℃黑暗储存。
Trace Elements(微量元素)(100ml)配方为：ZnSO4·7H2O(七水硫酸锌)2.2g，H3BO3(硼酸)1.1g，MnCl2·4H2O(四水氯化猛) 0.5g，FeSO4·7H2O(七水硫酸亚铁)0.5g，CoCl2·6H2O(六水氯化钴)0.17g，CuSO4·5H2O(五水硫酸铜)0.16g，Na2MoO4·2H2O (二水钼酸钠)0.15g，加ddH2O至100ml，过滤除菌，4℃黑暗储存。
(2)PDA培养基
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，自然pH。马铃薯切成小块，加水煮沸20-30分钟，至马铃薯能被玻璃棒戳破即可，用八层纱布过滤马铃薯残渣，将滤液收集于玻璃烧杯中，加15g琼脂和20g葡萄糖，继续加热搅拌混匀使之溶解，再补充蒸馏水至1000ml，分装后121℃灭菌20分钟，冷却后贮存备用。
(3)1/4SDA培养基
葡萄糖10g，蛋白胨2.5g，酵母提取物5g，固体培养基则加入琼脂18g，蒸馏水1000ml，pH值调至6.0。将各营养成分用蒸馏水搅拌溶解之后，补充蒸馏水至1000ml终体积，分装后121℃灭菌20 分钟，冷却后贮存备用。
1.3供试植物
以高感稻瘟病的实验室常用水稻品种CO39为寄主材料，育苗至三叶期的水稻叶片用于检测药物对稻瘟病菌致病性的影响。玉米品种为正红505，育苗至五叶期的叶片用于检测小斑病菌致病性。小麦南农0686为寄主材料，育苗至三叶期叶片用于检测白粉病菌致病性。
1.4病原菌接种方法
1)水稻稻瘟病菌致病性的分析
用灭菌蒸馏水收集CM平板生长10天的分生孢子，将菌悬液用 Miracloth过滤后，5000rpm转速下离心10min收集孢子，用0.1％的 Tween-20溶液重悬孢子，至孢悬液终浓度为1×105个/ml，然后加入 500mmol/L的除草剂药物母液至合适的药物工作液终浓度。将加有药物的孢悬液喷雾接种到水稻植株，同时喷洒含0.1％DMSO的孢悬液作为对照组。喷洒接种后，将水稻置于25℃、12h光照/12h黑暗交替、90％相对湿度的人工气候室，4-5天后统计水稻叶片上的坏死斑，计算5cm叶片区域上的坏死斑数目。
2)玉米小斑病菌致病性的分析
用灭菌蒸馏水收集培养基上生长的分生孢子，过滤之后离心收集孢子，用0.1％的Tween-20溶液重悬孢子，至孢悬液终浓度为1×105个/ml，再加入除草剂药物母液至合适的终浓度。采用喷雾接种方法将孢悬液接种到玉米叶片，喷洒接种后，将玉米置于人工气候室，3-4 天后统计玉米叶片上的病斑数量，计算8cm叶片区域上的数目。
3)小麦白粉菌致病性的分析
将小麦叶片置于培养皿中，底部放置湿润滤纸片以保湿，再将药物的工作液均匀喷洒至小麦叶片上，通风橱内放置30min，使叶片表面水分挥发，然后将小麦叶片上活体寄生生长的白粉菌孢子轻轻抖落到叶片表面，接种后放置于25℃保温培养，4-5后观察叶片发病情况，并计算叶片上白粉菌的发病面积。
1.5药物对病原真菌致病性的抑制效果
(1)药物对水稻瘟病菌致病性的抑制作用
稻瘟病菌侵染寄主水稻时，以添有溶剂DMSO的孢悬液作为无药物处理对照，此时稻瘟病菌在水稻叶片上引起了大量的典型坏死斑，而当孢悬液中添加了超长链脂肪酸的抑制剂药物之后，坏死斑的数量显著减少(图1)。通过统计病斑的数量，发现当药物浓度为100μM、30株幼苗共喷施5mL药物时，除毒草胺(Propachlor)之外的各药物均可在一定程度上抑制稻瘟病菌坏死斑的数量产生，其中吡草胺 (Metazachlor)、燕麦敌(Diallate)和唑草胺(Cafenstrole)对坏死斑数量的抑制率达50％以上(图2)；当药物浓度500μmol/L时，吡草胺(Metazachlor)、丁草胺(Butachlor)、燕麦敌(Diallate)和唑草胺 (Cafenstrole)对坏死斑数量的抑制率达50％以上。对于植物而言，靶向抑制超长链脂肪酸的抑制剂对不同植物具有不同的抑制效果，因此毒草胺(Propachlor)对病原真菌而言可能也具有一定的选择性，导致其对水稻稻瘟病的抑制效果不显著。以上结果说明靶向超长链脂肪酸合成的多种抑制性药物在100-500μmol/L浓度范围内，能显著抑制稻瘟病菌的致病性。
上述结果表明唑草胺(Cafenstrole)、吡草胺(Metazachlor)、燕麦敌 (Diallate)三种药物对水稻稻瘟病具有较好的抑制作用。在此基础上，进一步检测三种抑制性药物对稻瘟病的预防和治疗效果。先将500 μmol/L浓度的各药物分别喷施于水稻幼苗，同时以仅喷施溶剂 DMSO作为对照，在喷施完8小时之后，再将稻瘟病菌孢悬液接种至水稻幼苗，以分析抑制剂对稻瘟病的预防效果；另外，针对水稻幼苗，先将稻瘟病菌孢悬液接种至水稻幼苗，接种完8小时之后，将浓度为500μmol/L的各药物喷施于幼苗，同时以仅喷施DMSO作为对照组，以分析抑制剂对稻瘟病的治疗效果。4-5天后观察水稻叶片上稻瘟病坏死斑形成情况，发现无论是在预防实验组(图3)，还是在治疗实验组中(图4)，三种抑制性药物相比于溶剂DMSO对照，它们均能显著抑制稻瘟病坏死斑的形成，其抑制率能达到50％以上，该结果说明靶向超长链脂肪酸合成的多种抑制性药物对稻瘟病具有预防和保护效果。
(2)药物对玉米小斑病菌致病性的抑制作用
药物浓度在500μmol/L时，对稻瘟病菌致病性表现出更为明显的抑制作用，因此在后续实验中，均使用500μmol/L的药物工作液浓度来检测对其它病原真菌的致病性。进一步检测药物对玉米小斑病菌致病性的影响时，发现溶剂对照DMSO组中接种小斑病菌之后，玉米叶片上产生了大量病斑，而药物处理组中，除了噻唑草酰胺 (Flufenacet)之外的药物均可在一定程度上抑制病斑的形成(图5),噻唑草酰胺(Flufenacet)药效不明显原因可能是由于其对玉米小斑病菌具有一定的选择性。通过统计病斑形成的数量，发现毒草胺(Propachlor)、吡草胺(Metazachlor)、丁草胺(Butachlor)和唑草胺 (Cafenstrole)对病斑形成的抑制率达50％以上(图6)。
(3)药物对小麦白粉菌致病性的抑制作用
检测药物对小麦白粉菌致病性的影响时，发现溶剂对照DMSO 组中接种白粉菌之后，小麦叶片上产生了大量典型的白粉病病斑，而药物处理组中，除了毒草胺(Propachlor)之外的各药物均可抑制白粉病病斑的产生(图7)。参照文献报道方法计算白粉病病情指数[杨共强等，植物保护，2008,34(1):146-147]，发现吡草胺(Metazachlor)、丁草胺(Butachlor)、噻唑草酰胺(Flufenacet)、环草丹(Molinate)、燕麦敌 (Diallate)和唑草胺(Cafenstrole)都可显著抑制白粉病发病程度，抑制率达50％以上(图8)。
实施例2
药物阻碍稻瘟病菌超长链脂肪酸的合成
为分析药物是否通过抑制超长链脂肪酸合成来阻碍病原真菌致病性，于是选择三种对稻瘟病菌致病性具有显著抑制效果的代表性药物吡草胺(Metazachlor)、燕麦敌(Diallate)和唑草胺(Cafenstrole)，来分析它们处理之后，稻瘟病菌超长链脂肪酸合成水平。
2.1药物处理稻瘟病菌样品的制备
将稻瘟病菌培养于液体CM培养基，25℃、75rpm条件下培养2 天，收集菌丝并转移至新鲜的液体CM培养基，再往菌丝培养基中分别加入药物吡草胺(Metazachlor)、燕麦敌(Diallate)和唑草胺 (Cafenstrole)，至终浓度为500μmol/L，同时以加入溶剂DMSO为无药物处理的对照。加入药物之后培养24小时，然后收集菌丝用于提取脂质和脂肪酸含量分析。
2.2脂肪酸的提取和定量分析
参照已有文献报道的色谱质谱串联分析方法进行脂肪酸的提取和定量[Lam等,Journal of Lipid Research,2014 55:299-306]。往盛有稻瘟病菌液生菌丝的玻璃小瓶中加入氯仿:甲醇(2:1)，并加入 d31-16:0(Sigma)的脂肪酸作为内参对照以用于脂肪酸的定量。然后在 4℃下剧烈震荡约半小时，再离心收集下层的有机相液体，将其转移至新的玻璃小瓶并进行真空干燥。针对提取的脂类样品，使用液相色谱仪Exion UPLC system和质谱系统QTRAP 6500PLUS system (Sciex,Framingham,MA)进行定量分析，其中利用PhenomenexLuna Silica 3μm(i.d.150 2.0mm)的色谱柱进行脂肪酸的分离。
2.3脂肪酸定量分析结果
对脂肪酸进行定量分析(图9)，发现三种药物处理之后，相比于溶剂对照DMSO，稻瘟病菌中C16:0和C18:0的含量未发生明显改变，但是C20以上的脂肪酸含量降低，这说明药物对稻瘟病菌的超长链脂肪酸合成具有显著的抑制作用。
实施例3
药物阻碍稻瘟病菌关键侵染结构的形成
为分析药物抑制超长链脂肪酸合成时，稻瘟病菌致病性降低的原因，进一步观测代表性药物吡草胺(Metazachlor)、燕麦敌(Diallate)和唑草胺(Cafenstrole)药物对稻瘟病菌侵染结构的影响。
3.1稻瘟病菌侵染结构的显微观察
以生长至4叶期的水稻叶鞘为材料，同时使用表达细胞质GFP 的稻瘟病菌转化菌株进行接种，以利于侵染结构的显微观察，该菌株的构建及使用方法参照已有报道[许有嫔等，植物保护， 2017,43(6):53-61]，制备浓度为1×105个/ml的稻瘟病菌分生孢子悬液，同时往孢悬液中分别加入药物，至终浓度为500μmol/L，同时以加入溶剂DMSO的孢悬液作为无药物处理对照。将孢悬液注射至水稻叶鞘中，25℃保温培养，24h之后进行侵染结构的显微观察。
3.2药物对侵染钉形成的抑制作用
接种水稻叶鞘24h之后，对照组DMSO中，稻瘟病菌产生了典型的侵染器官附着胞和侵染钉，而药物处理之后，稻瘟病菌虽然能形成附着胞，但是侵染钉的形成却受到了阻碍(图10)。定量分析侵染钉的形成率，发现三种药物对侵染钉的形成具有显著的抑制作用，抑制率达50％以上(图11)。上述结果说明药物靶向抑制超长链脂肪酸合成之后，使稻瘟病菌侵染钉的形成受阻，从而引起稻瘟病菌致病性的降低。
实施例4
稻瘟病菌超长链脂肪酸合成的关键基因MoELO调控致病性
4.1稻瘟病菌超长链脂肪酸延伸酶MoELO的克隆
超长链脂肪酸合成途径在真核生物中高度保守，其中超长链脂肪酸延伸酶ELO是合成途径的限速酶。利用酵母ELO蛋白序列进行同源比对，从稻瘟病菌基因组数据库中鉴定获得了稻瘟病菌同源蛋白 MoELO。为进一步鉴定稻瘟病菌MoELO蛋白序列，使用ThermoFisher公司的Phusion高保真酶(货号F530S)及引物对 ELO-For/ELO-Rev(见表1，引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成)，从稻瘟病菌野生型菌株Guy11的cDNA中，克隆MoELO 的cDNA全序列，并且连接到pEASY-Blunt载体上，进行了测序(测序由上海生工生物工程股份有限公司完成)，cDNA序列见SEQ ID NO：1，该cDNA翻译形成的蛋白序列见SEQ IDNO：2。
表1、引物名称及序列
引物名称 序列
ELO-For ATGGCGGAAATACTAGACAAGATCC
ELO-Rev CGCCTTGCGAGAGCGAGGGGTCGACG
ELO-LF-For AAATTGACGACGAGACCG
ELO-LF-Rev gtcgtgactgggaaaaccctggcgAACTCCCTGCCACCAAA
ELO-RF-For tcctgtgtgaaattgttatccgctAGACCAAAGAAACCCAATAACT
ELO-RF-Rev TGACCTCCCGACAACTGC
HYG-For GTCGACAGAAGATGATATTG
HY-split CGTTGCAAGACCTGCCTGAA
YG-split AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
HYG-Rev TTACTATTCCTTTGCCCTCGGAC
P1 GAAAGTTTGTGGGAGGAAGG
P2 GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA
P3 GAGAGAACAAGACGCATAC
P4 CGGACAATGGCCGCATAA
PCR扩增体系(50μl)如下：Guy11菌株cDNA0.5μl(50ng)，Phusion DNA polymerase0.5μl(2U/μl)，5×Phusion HF buffer 10μl，dNTP(25mmol/L，each)1μl，上游引物(50μmol/L)0.5μl，下游引物(50μmol/L)0.5μl，ddH2O 37μl。
PCR扩增程序为：98℃预变性30s；98℃10s，60℃30s，72℃ 1min，35个循环；72℃10min，4℃保温。
4.2稻瘟病菌MoELO基因敲除突变体的构建
采用文献所述的Split-Marker基因敲除方法[Kershaw等，P.Natl.Acad.Sci.USA，2009，106(37):15967-15972]，构建MoELO的敲除突变体，其构建示意图见图12，基因MoELO约1kbp的编码序列选为打靶位点(targeted region)，基因敲除过程中，同源重组事件将该打靶位点序列置换为潮霉素筛选标记基因HYG，从而形成基因敲除突变体。
具体构建步骤如下：以Guy11基因组为模板，使用Phusion高保真酶以及引物对ELO-LF-For/ELO-LF-Rev和 ELO-RF-For/ELO-RF-Rev，通过PCR方法分别扩增得到长度为1kbp 的MoELO左翼LF和右翼RF片段。引物的序列见表1。
PCR扩增体系(50μl)如下：Guy11基因组DNA 0.5μl(100ng)， Phusion DNApolymerase 0.5μl(5U/μl)，5×Phusion HF buffer 10μl， dNTP(25mmol/L，each)0.5μl，上游引物(50μmol/L)0.5μl，下游引物(50μmol/L)0.5μl，ddH2O 37μl。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s， 72℃1min，35个循环；72℃10min，4℃保温。
使用引物对HYG-For/HY-split和YG-split/HYG-Rev分别扩增潮霉素筛选标记基因HYG的两个片段HY和YG，两个片段大小分别为1.1kbp和730bp。
HYG-For/HY-split和YG-split/HYG-Rev引物序列见表1。
PCR扩增体系(50μl)如下：pCB1004质粒模板0.5μl(10ng)， Phusion DNApolymerase 0.5μl(5U/μl)，5×Phusion HF buffer 10μl， dNTP(25mmol/L，each)0.5μl，上游引物(50μmol/L)0.5μl，下游引物(50μmol/L)0.5μl，ddH2O 37μl。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s， 72℃1min 30s，35个循环；72℃10min，4℃保温。
利用琼脂糖凝胶电泳回收上面扩增得到的四个片段LF、RF、HY 和YG；通过融合PCR，使用引物对ELO-LF-For/HY-split将片段LF 和HY连接形成融合片段LF-HY；同时使用引物对 YG-split/ELO-RF-Rev将片段YG和RF连接形成融合片段YG-RF。
获得融合片段LF-HY和YG-RF的PCR反应体系(50μl)如下：上游片段1μl(约50ng)，下游片段1μl(约50ng)，Phusion DNA polymerase 0.5μl(5U/μl)，5×Phusion HF buffer10μl，dNTP(25 mmol/L，each)，dNTP(25mmol/L，each)0.5μl，上游引物(50μmol/L) 0.5μl，下游引物(50μmol/L)0.5μl，ddH2O 36μl。
PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s，35个循环；72℃10min，4℃保温。
琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段LF-HY和YG-RF，同时参照以往文献所述方法制备稻瘟病菌野生型菌株Guy11的原生质体[Tablot 等，The Plant Cell，1993，5：1575-1590]，将这LF-HY和YG-RF片段共转至原生质体中，采用含潮霉素的CM平板筛选真菌转化子。在图12所示的基因置换过程中，由于融合片段的LF和RF序列与基因组上MoELO的位点序列存在同源性，因此会发生同源置换。
4.3基因MoELO敲除突变体ΔMoelo的鉴定
试验中共得到80个转化子，提取转化子基因组DNA之后，分别使用引物对P1/P2和P3/P4进行PCR验证(引物序列见表1)，其中随机插入的片段不能产生扩增条带，只有在MoELO基因位点发生了同源置换的转化子才能产生扩增条带。经PCR检测，2个转化子是经同源置换而产生的敲除突变体(图13)，编号分别为ΔMoelo.1 和ΔMoelo.2。
转化子检测的PCR反应体系(25μl)为：转化子基因组DNA0.5 μl(50ng)，Taqpolymerase 0.3μl(5U/μl)，10×buffer(+MgCl2，25 mmol/L)2.5μl，dNTP(25mmol/L，each)0.2μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，ddH2O 21.1μl。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s， 72℃2.5min，35个循环；72℃10min，4℃保温。
4.4敲除突变体ΔMoelo中超长链脂肪酸的定量分析
根据以往研究报道[Lam等，Journal of Lipid Research，2014，55： 299-306]，采用液相色谱和质谱联用技术分析了稻瘟病菌的超长链脂肪酸含量，发现敲除突变体ΔMoelo中碳链数大于20的超长链脂肪酸的含量明显小于野生型菌株Guy11(图14)。因此，MoELO基因在稻瘟病菌的超长链脂肪酸合成过程中发挥至关重要的作用。
4.5MoELO基因调控稻瘟病菌致病性的证明试验
按照如下方法进行：
25℃条件下，稻瘟病菌野生型菌株Guy11、敲除突变体ΔMoelo 在CM平板上生长10天后，用含0.1％吐温-20的无菌蒸馏水刮取平板上分生孢子，制备成浓度为1×105个/ml的孢悬液。以高感稻瘟病的实验室常用水稻品种CO39(该水稻材料保存于四川农业大学水稻研究所)为寄主材料，将孢悬液接种在育苗21天的水稻叶片上。接种后5天观察水稻叶片发病情况(图15)，发现野生型菌株在水稻叶片上造成了大量典型的稻瘟病病斑，而敲除突变体ΔMoelo接种后，叶片上形成的病斑数量显著减少(图16)，这说明MoELO对稻瘟病菌的致病性起关键调控作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> 抑制超长链脂肪酸合成的化合物在病原菌防治中的应用以及方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcggaaa tactagacaa gatccccatg ccgactatcg accggccatt tggcgtgcac 60
ttatggccca tcttcaataa ggccttcgag gccgtcgttg gcttcccggc tgacgacttc 120
cacttcgagg tcggcaagac gcccatgtca accctcaagg agacgggtat cttcatcgtc 180
atttactaca ttataatctt tggtggcagg gagttgatgc gcaaccgcga gcccttcaag 240
ctgcggtcgc tcttcctgat ccacaacttc tacctgacct ttatcagcgg cgctctcctg 300
gctcttttca ttgagcagct cgtccccacc attgcgaggc gtggcctctt tttcgccgtg 360
tgcgacaagg agggcggttg gacccaaccc ctgatcgttc tgtactacct caactacctc 420
accaagtacc tggaactcct cgacaccgtc ttcctgttcc tcaagaagaa gcccctgacc 480
ttccttcact gctaccacca cggcgctacc gctttccttt gctacaccca gctgattggc 540
tcgaccgccg ttcagtggtc tgtcatcacg ctgaacctga tggtccacgt tgtcatgtac 600
tggtactact tccagagcgc ccgtggcatc aagatctggt ggaaggagtg gatcacccgt 660
ctccaaatca cgcagttcgt tatcgacctg ggcttcatct actttgcctc gtacacgtac 720
ttcacctcca cctactggcc ctggatgccc aacgcgggtc agtgcgccgg cgaggagttc 780
gccgcgttcg ccggtattgc cagcatctcg tcgtacctgg ttctgttcat ctcgttctac 840
cttgcgacct acaagaagga gcgcaagcct ccaactgctc gcaagtccct gcgccgcatg 900
tcgcaggctc ctctgcctga cccccacagc ctcatgggcg ccgaaggtgc tgctaccccg 960
tccaaggccg ccaacggttt ctctactggt gctaagacca acggttcgtc gacccctcgc 1020
tctcgcaagg cgtaa 1035
<210> 2
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Glu Ile Leu Asp Lys Ile Pro Met Pro Thr Ile Asp Arg Pro
1 5 10 15
Phe Gly Val His Leu Trp Pro Ile Phe Asn Lys Ala Phe Glu Ala Val
20 25 30
Val Gly Phe Pro Ala Asp Asp Phe His Phe Glu Val Gly Lys Thr Pro
35 40 45
Met Ser Thr Leu Lys Glu Thr Gly Ile Phe Ile Val Ile Tyr Tyr Ile
50 55 60
Ile Ile Phe Gly Gly Arg Glu Leu Met Arg Asn Arg Glu Pro Phe Lys
65 70 75 80
Leu Arg Ser Leu Phe Leu Ile His Asn Phe Tyr Leu Thr Phe Ile Ser
85 90 95
Gly Ala Leu Leu Ala Leu Phe Ile Glu Gln Leu Val Pro Thr Ile Ala
100 105 110
Arg Arg Gly Leu Phe Phe Ala Val Cys Asp Lys Glu Gly Gly Trp Thr
115 120 125
Gln Pro Leu Ile Val Leu Tyr Tyr Leu Asn Tyr Leu Thr Lys Tyr Leu
130 135 140
Glu Leu Leu Asp Thr Val Phe Leu Phe Leu Lys Lys Lys Pro Leu Thr
145 150 155 160
Phe Leu His Cys Tyr His His Gly Ala Thr Ala Phe Leu Cys Tyr Thr
165 170 175
Gln Leu Ile Gly Ser Thr Ala Val Gln Trp Ser Val Ile Thr Leu Asn
180 185 190
Leu Met Val His Val Val Met Tyr Trp Tyr Tyr Phe Gln Ser Ala Arg
195 200 205
Gly Ile Lys Ile Trp Trp Lys Glu Trp Ile Thr Arg Leu Gln Ile Thr
210 215 220
Gln Phe Val Ile Asp Leu Gly Phe Ile Tyr Phe Ala Ser Tyr Thr Tyr
225 230 235 240
Phe Thr Ser Thr Tyr Trp Pro Trp Met Pro Asn Ala Gly Gln Cys Ala
245 250 255
Gly Glu Glu Phe Ala Ala Phe Ala Gly Ile Ala Ser Ile Ser Ser Tyr
260 265 270
Leu Val Leu Phe Ile Ser Phe Tyr Leu Ala Thr Tyr Lys Lys Glu Arg
275 280 285
Lys Pro Pro Thr Ala Arg Lys Ser Leu Arg Arg Met Ser Gln Ala Pro
290 295 300
Leu Pro Asp Pro His Ser Leu Met Gly Ala Glu Gly Ala Ala Thr Pro
305 310 315 320
Ser Lys Ala Ala Asn Gly Phe Ser Thr Gly Ala Lys Thr Asn Gly Ser
325 330 335
Ser Thr Pro Arg Ser Arg Lys Ala
340

Claims (10)

1.抑制超长链脂肪酸合成的化合物在防治病原菌中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述超长链脂肪酸为碳链长度为20个碳原子以上的脂肪酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述化合物为硫代氨基甲酸酯类化合物或酰胺类化合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述硫代氨基甲酸酯类化合物选自环草丹、燕麦敌、克草丹、异丁草丹、硫烯草丹和野燕畏中的任意一种或其组合或几种的组合。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酰胺类化合物选自吡草胺、丁草胺，毒草胺、唑草胺、噻唑草酰胺、乙草胺和异丙草胺中的任意一种或其组合或几种的组合。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述病原菌为病原真菌；
优选的，所述病原真菌为植物病原真菌或动物病原真菌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为稻瘟病菌、小斑病菌或白粉病菌；
优选的，所述动物病原真菌为绿僵菌。
8.一种防治病原菌的方法，其特征在于，其包括：向待防治对象施用具有抑制超长链脂肪酸合成特性的化合物；
优选的，所述超长链脂肪酸为碳链长度为20个碳原子以上的脂肪酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述化合物为硫代氨基甲酸酯类化合物或酰胺类化合物；
优选的，所述硫代氨基甲酸酯类化合物选自环草丹、燕麦敌、克草丹、异丁草丹、硫烯草丹和野燕畏中的任意一种或几种的组合；
优选的，所述酰胺类化合物选自吡草胺、丁草胺，毒草胺、唑草胺、噻唑草酰胺、乙草胺和异丙草胺中的任意一种或几种的组合。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述病原菌为病原真菌；
优选的，所述病原真菌为稻瘟病菌、小斑病菌或白粉病菌；
优选的，所述待防治对象为植物；
优选的，所述植物为水稻、玉米或小麦；
优选的，所述化合物的有效防治剂量为：每100m2的目标区域，对应喷施1-2g所述化合物；
优选的，所述化合物以如下方式进行喷施：将1-2g的所述化合物溶解于4mL的二甲基亚砜，再将二甲基亚砜溶解的化合物溶于2L水中，所述化合物终浓度为500-1000μmol/L，将水溶液喷施于目标区域。
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