CN109999177A - 多黏菌素在制备治疗神经细胞损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多黏菌素在制备神经细胞损伤药物中的应用。将多黏菌素用于治疗脑卒中神经细胞损伤，尤其是治疗脑组织神经系统疾病，更尤其是对缺血性脑卒中的保护作用，能显著减轻脑卒中神经细胞，提高神经细胞功能。

Description

多黏菌素在制备治疗神经细胞损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及多黏菌素在制备治疗神经细胞损伤药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

多黏菌素（polymyxin）由多黏类芽孢杆菌产生的多肽类抗生素，通过破坏革兰阴性细菌细胞膜，导致细胞质成分外漏而杀死细菌。对大肠埃希菌、克雷伯氏杆菌及嗜血杆菌、绿脓杆菌等多种革兰阴性菌有抑制作用，临床上主要应用于绿脓杆菌及其他假单孢菌引起的创面、尿路以及眼、耳、气管等部位感染，也可用于败血症、腹膜炎。多黏菌素B/E的抗菌谱相似，但前者抗菌活性略高于后者，对繁殖期和静止期细菌均有杀灭作用。多黏菌素常见的不良反应之一为神经毒性，表现为步态不稳、运动失调等，可产生肌无力和呼吸抑制。目前，多黏菌素用于治疗脑卒中及其它中枢神经系统疾病神经细胞损伤尚未见报道。

缺血性脑卒中是严重危害人类健康的常见和多发病，在全球已成为第一致残和第三致死的原因，缺血性脑卒中的发病率约占脑血管病的70-80%。

脑缺血损伤与自由基过度形成、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎性反应等多种机制有关，无论何种机制，最终的结局都会导致神经细胞死亡、功能破坏、脑梗死灶形成。细胞死亡的方式主要有坏死和凋亡两条途径。传统观点认为，坏死是一种随机的、意外的和不受调控的被动死亡方式，而凋亡则是一种受到严密调控的主动死亡方式。最近的研究表明，坏死也受到各种信号通路严密调控，称为调节性坏死，包括坏死性凋亡(programmed necrosis)，CypD依赖的坏死等。其中，受体相互作用蛋白激酶RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的坏死性凋亡最受关注。研究表明，RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的坏死性凋亡存在于多种损伤相关性疾病中，包括缺血性脑卒中、肾脑卒中损伤。因此，抑制RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的坏死性凋亡已成为目前减轻缺血性脑卒中神经细胞死亡的有效途径。文献报道，RIPK1抑制剂necrostatin-1（Nec-1）能减少小鼠脑缺血损伤，改善神经功能，该作用与抑制神经细胞的坏死性凋亡密切相关。然而，Nec-1仅作为工具药用于动物实验，目前临床上尚无针对RIPK1/RIPK3/MLKL药物用于治疗缺血性脑卒中。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供多黏菌素在制备治疗神经细胞损伤药物中的应用。

进一步地，所述多黏菌素包括多黏菌素A、多黏菌素B、多黏菌素C、多黏菌素D、多黏菌素E中的至少一种。

进一步地，所述多黏菌素包括多黏菌素B和/或多黏菌素E。申请人研究发现多黏菌素B和/或多黏菌素E的效果最为明显。

进一步地，所述神经细胞包括中枢神经系统疾病相关神经细胞。

进一步地，所述中枢神经系统疾病包括外伤性中枢神经系统损伤、脑损伤、脊髓损伤、脑卒中、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、亨廷顿病疾病、痴呆、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、多发性硬化症、糖尿病性神经病、脊髓小脑共济失调、fahr病、menke病、威尔逊病、脑缺血、朊病毒病、额颞叶痴呆、路易体痴呆、皮质基底部退化、进行性核上性麻痹、多系统萎缩和遗传性痉挛性截瘫。

进一步地，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和/或出血性脑卒中。

多黏菌素在制备治疗脑卒中药物中的应用。

进一步地，所述药物可以按照已知技术制备成任意一种药剂学上可以接受的剂型，如口服剂、注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液或滴丸，优选为注射剂。

进一步地，所述应用中的给药方式可为皮下注射、静脉注射、肌肉注射、口服给药或黏膜给药，优选为肌肉注射。

本发明人研究发现多肽类抗生素多黏菌素能特异性下调RIPK1、RIPK3、MLKL表达和磷酸化水平, 抑制细胞坏死性凋亡，可减少脑神经细胞死亡和提高神经细胞功能。

本发明通过实验表明，多黏菌素通过特异性抑制受体相互作用蛋白激酶RIPK、RIPK3、MLKL，抑制神经细胞坏死样凋亡，显著降低脑缺血梗死体积。多黏菌素可以降低脑脑卒中脑细胞的坏死样凋亡。因此，多黏菌素B/E可应用于制备治疗脑卒中损伤药物。优选地，所述脑卒中包括缺血性脑卒中。

本发明通过实验表明，多黏菌素B和多黏菌素E均可显著降低脑缺血梗死体积和神经生物学评分，减少脑神经细胞死亡和提高神经细胞功能，可应用于制备中枢神经系统疾病所致脑神经细胞受损和神经功能失调。

本发明提供了多肽类抗生素多黏菌素（Polymyxin）的新用途，包括对脑脑卒中及神经细胞损伤的保护作用，扩大了多黏菌素的适应症，可适用于脑卒中治疗及神经保护。

多黏菌素通过破坏革兰阴性细菌细胞膜，导致细胞质成分外漏而杀死细菌，目前主要用于治疗铜绿假单胞菌和其它革兰阴性杆菌引起的严重感染。本发明首次将多黏菌素用于治疗大鼠缺血性脑卒中模型，发现多黏菌素能下调大鼠脑组织中RIPK1、RIPK3、MLKL表达和磷酸化水平，降低大鼠脑梗死体积，改善神经学功能，这一作用优于阳性工具药Nec-1。本发明首次证明治疗感染的抗菌药物多黏菌素可以用于治疗缺血性脑卒中。与治疗感染机制不同，多黏菌素通过下调RIPK1、RIPK3、MLKL表达和磷酸化水平，抑制神经细胞坏死性凋亡而发挥作用。由于治疗缺血性脑卒中为急性和短期用药，可大大降低多黏菌素的不良反应。本发明扩大多黏菌素现有的适应症范围，发现了其新的药物作用机制。缺血性脑卒中为临床常见病，多黏菌素具有广阔的应用前景。

总之，本发明将多黏菌素用于治疗脑组织神经病，尤其是对缺血性脑卒中的保护作用，能显著减轻脑缺血/再灌注损伤。

附图说明

图1：缺血前15分钟第一次给与多黏菌素E1mg/kg，缺血2h再灌1h第二次给药2mg/kg，再灌4h第三次给药3mg/kg；A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定，B-大鼠神经学功能评分；

图2：缺血2h再灌1h第一次给与多黏菌素E2mg/kg，再灌6h第二次给药3mg/kg；A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定，B-大鼠神经学功能评分。

图3：缺血2h再灌1h第一次给与多黏菌素B 2mg/kg，再灌6h第二次给药3mg/kg；A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定，B-大鼠神经学功能评分。

具体实施方式

动物实验：多黏菌素B、多黏菌素E对缺血性脑卒中的保护作用。

实施药品：多黏菌素B及多黏菌素E购于试剂公司。

将多黏菌素B、多黏菌素E用0.9%生理盐水作为溶媒制成溶液。

实验动物：体重250～300 g的健康雄性SD大鼠。将实验动物在温度25℃、相对湿度60%、自由饮水、定时定量的环境中饲养一周，然后按实验要求，药物组肌肉注射给药。。

建模方法：用脑中动脉阻塞（MCAO）法制备大鼠脑卒中模型。步骤如下：(1) 分离颈外动脉(CCA),向上分离左颈外动脉(ECA) 与颈内动脉(ICA)；(2) 用眼科镊暂时夹闭ECA和ICA，并结扎CCA 近心端；(3) 于CCA远心端放置一打好结的备用丝线，在此线上端剪一小口,将栓线插入至颈内动脉，收紧丝线，放开ECA和ICA上的动脉夹，顺ICA 将栓线送至颅内；(4) 遇阻力而止,从CCA分叉处算起，插入深度约为18～20mm； (5) 缺血120min后，将栓线拔出，缝好皮肤，再灌注24h后处理动物。

模型成功评判标准采用Longa“5分法”对大鼠脑缺血损伤的神经功能缺损进行评分。0分：无神经缺损症状；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋转；3分：行走向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。 1～4分为有效模型。

大鼠脑TTC染色和梗死体积测定。大鼠麻醉后，迅速将脑取出，去掉嗅球及后脑，从额极开始切取4张冠状脑片，厚约2.0mm，立刻置于1% TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min。然后用10%多聚甲醛溶液浸泡固定。梗死区呈现白色，非梗死区呈现红色。将每组脑片排列整齐后进行扫描。再应用ImageJ测出各脑片的梗塞面积，根据公式：梗死体积=[（各片正面梗死面积之和+各片反面梗死面积之和）/2]×每片厚度,同样方法计算出全脑体积。

实验分组：将实验动物随机分为4组，即：

对照组（control组）：不做任何处理。

假手术组（sham组）：分离血管后不插入栓线。

脑卒中组（I/R）：脑缺血2h，再灌注24h。

多黏菌素B/E+脑卒中组(PolymyxinB/ E +I/R)：

①手术前15分钟肌肉注射(多黏菌素E用0.9%生理盐水做成溶液，多黏菌素E用量：1mg/kg)，缺血2h再灌后1小时第二次肌肉注射(多黏菌素E用0.9%生理盐水做成溶液，多黏菌素E用量：2mg/kg)，缺血2h再灌后4小时第三次肌肉注射(多黏菌素E用0.9%生理盐水做成溶液，多黏菌素E用量：3mg/kg)。检测指标：大鼠神经功能评分和梗死体积测定。

②缺血2h再灌后1小时肌肉注射(多黏菌素B、多黏菌素E分别用0.9%生理盐水做成溶液，多黏菌素用量分别为：2mg/kg)，缺血2h再灌后6小时第二次肌肉注射(多黏菌素B、E分别用0.9%生理盐水做成溶液，多黏菌素用量分别为：3mg/kg)。检测指标：大鼠神经功能评分和梗死体积测定。

实验结果：

多黏菌素对大鼠脑梗死体积及神经功能的影响

图1中的A所示，I/R组有明显的白色梗死灶，而给予多黏菌素E（缺血前15分钟第一次给药1mg/kg，缺血2h再灌1h第二次给药2mg/kg，再灌4h第三次给药3mg/kg）组大鼠脑梗死灶显著缩小，明显缓解脑缺血损伤(p<0.01)。图B，脑卒中组（I/R）大鼠出现明显的神经运动功能障碍，而多黏菌素E可明显改善神经功能缺损症状 (p<0.05)。

图2中的A所示， I/R组有明显的白色梗死灶，给予多黏菌素E（缺血2h再灌1h第一次给药2mg/kg，再灌6h第二次给药3mg/kg）组大鼠脑梗死灶显著缩小，明显缓解脑缺血损伤(p<0.01)。图B，脑卒中组（I/R）大鼠出现明显的神经运动功能障碍，而多黏菌素E可明显改善神经功能缺损症状 (p<0.05)。

图3 中的A所示， I/R组有明显的白色梗死灶，给予多黏菌素B（缺血2h再灌1h第一次给药2mg/kg，再灌6h第二次给药3mg/kg）组大鼠脑梗死灶显著缩小，明显缓解脑缺血损伤(p<0.01)。图B，脑卒中组（I/R）大鼠出现明显的神经运动功能障碍，而多黏菌素B可明显改善神经功能缺损症状 (p<0.05)。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (6)

1.多黏菌素在制备治疗神经细胞损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多黏菌素包括多黏菌素A、多黏菌素B、多黏菌素C、多黏菌素D、多黏菌素E中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述多黏菌素包括多黏菌素B和/或多黏菌素E。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述神经细胞包括中枢神经系统疾病相关神经细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述中枢神经系统疾病包括外伤性中枢神经系统损伤、脑损伤、脊髓损伤、脑卒中、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、痴呆、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、多发性硬化症、糖尿病性神经病、脊髓小脑共济失调、fahr病、menke病、威尔逊病、脑缺血、朊病毒病、额颞叶痴呆、路易体痴呆、皮质基底部退化、进行性核上性麻痹、多系统萎缩和遗传性痉挛性截瘫。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和/或出血性脑卒中。