CN109999035A - 索拉菲尼衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

索拉菲尼衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，索拉菲尼衍生物的结构如下：

Description

索拉菲尼衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体地涉及一种索拉菲尼衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化，从而引发肿瘤的发生。基于此，Folkman建设性地提出了“饿死肿瘤”的抗血管生成策略。2002年，血管内皮生长因子的发现，为血管生成抑制剂的研究奠定了基础，已有十余种AIs相继上市，并表现出一定的疗效。VEGF受体是抗血管生成的重要靶标。近年来，靶向VEGF受体的小分子抑制剂的研究非常活跃，大量结构各异的抑制剂被报道出来，具代表性的有2-吲哚酮类，4-苯胺基喹唑啉类和2，4-二氮杂萘类等。其中一些化合物已分别进入各期临床评价，显示出良好的应用前景。但目前这些抑制剂仍存在一些问题，例如它们都是ATP的竞争性抑制剂，而细胞内尤其是癌细胞内的ATP浓度能达到5mmol/L以上，因此抑制剂活性应至少达到纳摩尔级水平才能表现出有效的抑制作用。另外，VEGF受体属于酪氨酸激酶超家族，该家族成员广泛参与体内生物信号的传导。由于序列的同源性，它们的ATP结合位点的三维结构是高度保守的。因此如何提高抑制剂在这些家族成员中的选择性也是一个研究重点。所以，寻找高活性，高选择性的VEGF受体抑制剂仍是今后的研究方向。
发明内容
本发明的目的在于提供索拉菲尼衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
索拉菲尼衍生物或其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，索拉菲尼衍生物的结构如下：
其中，X为NH或O。
本发明进一步的改进在于，抗肿瘤药物为治疗实体瘤的药物。
本发明进一步的改进在于，抗肿瘤药物能够抑制乳腺癌细胞、神经胶质瘤细胞以及人脐静脉血管内皮细胞的增殖。
本发明进一步的改进在于，可药用盐是盐酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、甲磺酸盐或苯甲磺酸盐。
本发明进一步的改进在于，抗肿瘤药物为临床可接受的药物制剂。
本发明进一步的改进在于，药物制剂是片剂、胶囊剂或颗粒剂。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：本发明的索拉菲尼衍生物或其可药用盐能够在制备抗肿瘤药物中的应用，并且经过激酶活性以及细胞活性筛选，索拉菲尼衍生物的活性均优于索拉菲尼，其激酶抑制活性均在pM(皮摩尔)级别，细胞抑制增殖活性结果也均优于索拉菲尼，其中对于Hela细胞的增殖抑制活性结果在pM级别。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
索拉菲尼衍生物的结构如下：
其中，X为NH或O，具体结构如下：
上述结构的索拉菲尼衍生物(SN和SO)及其可药用盐均具有较好的抗肿瘤活性。为此，本发明提供一种索拉菲尼衍生化合物包括SN和SO在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所述的肿瘤选自：乳腺癌细胞和神经胶质瘤细胞。
本发明的化合物SN和SO为对多种肿瘤具有杀伤作用。以下通过实验数据说明本发明的抗肿瘤效果。
实施例1：索拉菲尼衍生物对VEGFR-2激酶的抑制活性筛选。
采用的是ADP-Glo发光方法测定索拉菲尼光亲和探针分子对VEGFR-2激酶的抑制活性。
用Buffer(Tris 80mM,MgCl2 20mM,BSA 0.2mg/mL,DTT 2mM)稀释ATP(10mM)为250μM；将ATP和底物Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide按体积1:1配成ATP(125μM)-Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide(0.5μg/μL)混合溶液；用Buffer稀释激酶为1.5ng/μL。将待测化合物配成6个浓度梯度的溶液，于384孔板上依次加入2μL ATP-Poly(4:1Glu,Tyr)Peptide溶液、1μL样品溶液、2μL酶溶液启动反应。30℃孵育60min后，加入ADP-Glo试剂5μL终止反应。再加入KinaseDetection试剂10μL将ADP转化为ATP，在25℃孵育30min，使用PerkinElmer多功能酶标仪的化学发光模块测定发光值，计算抑制率。
数值处理：抑制率＝(阳性值-给药组值)/(阳性值-阴性值)×100％；
表1索拉菲尼、SN和SO对VEGFR-2激酶的抑制活性
实施例2：索拉菲尼衍生物对肿瘤细胞的细胞活性实验
采用的是MTT方法测定索拉菲尼衍生物对EAhy926细胞、实体瘤细胞如乳腺癌细胞、神经胶质瘤细胞的增殖抑制活性。
MTT法是检测细胞的存活和生长状态的一种常用方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，噻唑蓝)还原为水不溶型的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞则没有这种功能，根据这种差异，可以采用此法评价药物对细胞的增长抑制活性。其中，DMSO能够溶解细胞中的甲瓒，用DMSO溶解后采用用酶联免疫检测仪在590nm波长处测定其吸光值，可反映活细胞数量，进而反映化合物的抗细胞增殖的抑制作用。具体实验操作如下：
1)细胞复苏
将冻存于液氮罐的细胞(EA.hy926)，在37℃水浴锅中不断摇动使其融化(1min内)，将冻存管中的细胞悬液转移至10mL离心管中离心，弃去上清液，加入3mL培养基重悬，转移至培养皿中培养。
2)细胞培养
DMEM高糖型培养基(1％双抗，10％胎牛血清)，37℃，5％CO2。
3)化合物的配制
分别称取化合物Sorafinib、SN、SO溶于100μL DMSO中，配制成6×10-2mol/L的母液，用培养基稀释成2.5×10-12mol/L 、2.5×10-11mol/L 、2.5×10-10mol/L 、2.5×10-9mol/L 、2.5×10-8mol/L，2.5×10-7mol/L，2.5×10-6mol/L，2.5×10-5mol/L的溶液以备用。
4)细胞接种
将处于对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞(EA.hy926)、乳腺癌细胞(Hela)、神经胶质瘤细胞(U87)、用0.25％的胰酶消化1min，吹打均匀后稀释成浓度为1×104～2×104个/mL的单细胞悬液，平行接种于96孔培养板中，每孔接种体积为180μL。于37℃、5％CO2培养箱中培养。
5)加药
培养24h后，观察96孔板中细胞的生长状况，若细胞状态良好则进行给药。每孔加入不同浓度的待测化合物20μL，使孔中化合物的终浓度为：2.5×10-13mol/L 、2.5×10- 12mol/L 、2.5×10-11mol/L 、2.5×10-10mol/L 、2.5×10-9mol/L，2.5×10-8mol/L，2.5×10- 7mol/L，2.5×10-6mol/L，以Sorafenib为阳性对照，于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。
6)加MTT
取25mg MTT加入50mL三蒸水中，避光超声使溶解，即得5mg/mL的MTT工作液。移入无菌操作台，用一次性注射器在0.22μm水相滤头下过滤，分装至棕色EP管中，-20℃冰箱保存。
给药培养48h后，于96孔板中每孔加入MTT工作液20μL，混匀，37℃培养箱孵育4h。
7)吸光度测定
4h后取出96孔板，小心吸弃培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，使用Multiskan FC型酶标仪测量各孔570nm处紫外吸收值(OD值)，然后计算抑制率，并根据抑制率求出IC50值。抑制率的计算公式为：
抑制率％＝(阴性对照孔平均OD值-用药组平均OD值)/(阴性对照孔平均OD值-空白对照孔平均OD值)×100％。
人脐静脉血管内皮细胞活性增殖抑制活性、乳腺癌细胞增殖抑制活性以及神经胶质瘤细胞增殖抑制活性结果参见表2-表4，从表2-表4可以看出，本发明的索拉菲尼衍生物具有较好的抑制效果，可能够应用于抗肿瘤药物的制备。
表2人脐静脉血管内皮细胞活性增殖抑制活性结果
化合物 索拉菲尼 SO SN
IC50 33.804nM 3.364nM 2.344nM
表3乳腺癌细胞增殖抑制活性结果
化合物 索拉菲尼 SO SN
IC50 35.454nM 28.615nM 28.615nM
表4神经胶质瘤细胞增殖抑制活性结果
化合物 索拉菲尼 SO SN
IC50 ND 20.549nM 0.95nM
索拉菲尼衍生物的可药用盐为索拉菲尼衍生物的盐酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、甲磺酸盐或苯甲磺酸盐药学上可接受的盐，索拉菲尼衍生物的可药用盐同样能够在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了确证索拉菲尼的药物靶点，设计合成了索拉菲尼光亲和探针SO、SN，目的是通过化学生物学方法验证索拉菲尼的药物靶点。但是，在对探针分子进行活性筛选时意外发现所制备的索拉菲尼光亲和探针SO、SN具有非常好的受体酪氨酸激酶抑制活性和抗肿瘤活性定。特别是，在对其进行受体酪氨酸激酶抑制活性测定的过程中，意外发现其对VEGFR-2激酶表现出很好的抑制活性，其抑制活性表现在pM级别，明显高于已上市药物索拉菲尼。基于上述结果，又通过对一些实体瘤细胞如神经胶质瘤细胞、乳腺癌细胞以及人脐静脉血管内皮细胞的活性筛选中，发现索拉菲尼光亲和探针同样具有很好的抗肿瘤细胞增殖活性。在此基础上完成临床前研究，有望开发为一类高活性的抗肿瘤药物，这是研究过程中的创新性发现，可以为抗肿瘤药物的设计及合成提供一种全新的思路。

Claims (6)

1.索拉菲尼衍生物或其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，索拉菲尼衍生物的结构如下：
其中，X为NH或O。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为治疗实体瘤的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物能够抑制乳腺癌细胞、神经胶质瘤细胞以及人脐静脉血管内皮细胞的增殖。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，可药用盐是盐酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、甲磺酸盐或苯甲磺酸盐。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为临床可接受的药物制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，药物制剂是片剂、胶囊剂或颗粒剂。
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